CN103627817A

CN103627817A - 检测口蹄疫病毒通用型的rt-pcr引物及试剂盒

Info

Publication number: CN103627817A
Application number: CN201310461862.XA
Authority: CN
Inventors: 冯淑萍; 颜健华; 胡巧云; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2014-03-12

Abstract

本发明公开了一对检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒，所述引物的上游引物核苷酸序列为5’-CTGGGCCCTTCTTCTTC-3’，下游引物核苷酸序列为5’-GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3’，所述试剂盒包括所述的引物。采用本发明检测口蹄疫O型、A型、亚I病毒，具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点。

Description

检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物检测技术领域，具体涉及一对检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒。

背景技术

口蹄疫（Foot and mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的一种急性高度接触性传染病，主要侵害偶蹄动物，如牛、猪、羊等。其特征是发热、皮肤或粘膜发生水泡溃疡，尤其是在口腔和蹄叉部位。

口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus,FMDV）属于小RNA病毒科，约有8500个核苷酸组成。病毒基因组由一个开放性阅读框（ORF）、一个5′端非编码区（NCR）和3′端非编码区（NCR）组成，ORF编码由4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3和VP4）、RNA聚合酶（3D）、蛋白酶（L、2A、3C）以及其他非结构蛋白（如3A等）组成。口蹄疫病毒包括7个血清型和60余个亚型，7个血清型为：A型、亚洲I型、O型、C型、南非Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，各型之间无交叉保护反应，同一血清不同分离株之间也存在广泛的抗原变异；由于亚型分类越来越复杂，现在由用于分析基因组遗传衍化关系的基因型代替。

口蹄疫在亚洲主要流行有A、O型、C型、亚洲I型4个血清型，截至目前，我国仅见O型、A型、亚洲I型三个血清型的口蹄疫。A型在1960—1975年曾流行20多省。目前，A型口蹄疫病毒在我国已广为扩散，是仅次于O型口蹄疫的世界主要流行毒株。广西地处我国沿海地区西南部，东部毗邻广东，西南与越南为界，是我国边疆省区之一。而越南口蹄疫疫情复杂，O型、亚洲I型、A型时有发生。2013年2月，农业部确认广东省茂名市某猪场发生生猪A型口蹄疫疫情。因此建立有效的诊断方法对边境口蹄疫疫情的防控与监测具有重要意义。

O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒与其他血清型的口蹄疫病毒在致病性上并无明显差异，症状基本相同，主要引起口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂。由于口蹄疫传播速度快、感染率高、对畜牧业生产危害严重。目前对于各型口蹄疫病毒的实验室检查主要包括：间接夹心联免疫吸附试验、反向间接血凝试验、中和试验、液相阻断酶联免疫吸附试验、非结构蛋白ELISA检测、正向间接血凝试验等。这些方法的目的是检测相应的抗体，属于血清学检测方法，鉴于口蹄疫病毒的高度变异性以及交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性，因此建立有效的诊断方法对防治口蹄疫具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一对检测口蹄疫O型、A型、亚I型病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒，具有较高的灵敏度和特异性，且检测成本低，有良好的应用前景。

本发明的技术方案为：

一对检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-CTGGGCCCTTCTTCTTC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3′。

一种检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒,所述试剂盒包括以上所述的引物。

以上所述检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒,所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。

所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；

所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和下游引物Wd；

所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；

所述阴性对照包括：DEPC水；

所述阳性对照包括：口蹄疫O型全病毒、口蹄疫A型全病毒和口蹄疫亚I型全病毒。

所述口蹄疫O型全病毒可为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫O型全病毒，所述口蹄疫A型全病毒可为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫A型全病毒，所述口蹄疫亚I型全病毒可为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫亚I型全病毒。

本发明的具体原理是利用口蹄疫O型、A型、亚I型病毒的同源性，应用OLIG6.0软件，合成一对靶核苷酸序列的特异性引物，用RT-PCR方法扩增出特异性的目的带。试验方法及过程如下：

1.引物设计：

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物长度一般为16-25bp左右，引物之间、引物内无互补序列。通过对口蹄疫O型、A型、亚I型病毒三型基因组序列进行比较分析，选择无二级结构且高度保守的片段，设计多对引物，通过匹配、筛选最优引物组合如下：

上游引物Wu序列：5′-CTGGGCCCTTCTTCTTC-3′；

下游引物Wd序列：5′-GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3′。

2.反应体系的建立和优化：

将灭活的待检样品用Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分别分装后储存于-20℃备用。

2.1引物用量的优化在反应体系其他条件相同的情况下，将引物对的用量分别从0.1μL至1.8μL加入体系，通过实验结果分析比较，确定最优引物用量为0.5μL。

2.2氯化镁浓度的优化在反应体系其他条件相同的情况下通过实验结果分析比较，确定氯化镁的浓度为25mM最佳。

2.3反转录酶（M-MLV）的优化通过实验结果对比分析，选择200U/μL反转录酶作为反应体系最佳用量。

2.4Taq DNA聚合酶（Taq酶）的优化通过实验结果对比分析，选择5U/μL酶作为反应体系最佳用量。

2.5dNTPs浓度的优化通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，反转录时选择10mM，PCR扩增时选择2.5mM作为反应体系最佳用量。

利用上述引物和各成分的最终浓度，最后确定采用的RT-PCR反应体系为25μL，所需各组及相应浓度见表1。

表1检测口蹄病毒通用型反应体系

3.RT-PCR反应条件优选如下：

反转录体系：42℃60min，95℃5min；

扩增条件：94℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的引物检测灵敏度可达100个拷贝/ml，说明其具有良好的灵敏度。

2.本发明提供的引物对于无口蹄疫O型、A型、亚I型的检测样品无扩增带，说明引物对目的基因具有良好的特异性。

3.本发明是针对口蹄疫O型、A型、亚I型代表毒株以及高度保守区域进行引物的设计，避免了假阴性结果的产生。

4.本发明设计的引物可以检测样本是否呈口蹄疫O型、A型、亚I型病毒阳性，进行35个循环扩增只需2个小时左右，节约了大量的人工时间、实验耗材，提高实验室工作效率，降低了检测成本。

附图说明

图1是本发明检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR扩增图。

M：DNA Marker20001、口蹄疫O型病毒阳性对照2、口蹄疫A型病毒阳性对照3、口蹄疫亚I型病毒阳性对照4、阴性样品5、口蹄疫O型病毒阳性样品6、口蹄疫A型病毒阳性样品7、口蹄疫亚I型病毒阳性对照

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明的保护范围和应用范围：

一、检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒

一种检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒，包括以下试剂，详见表2，引物为本实验室自行设计，其他试剂均可从市场上购买。

表2检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒

二、试剂盒的使用方法

检测口蹄疫病毒通用型试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1.病毒RNA的提取

①取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；

②加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟；

③低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；

④缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管；

⑤加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟；

⑥低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃去上清液；

⑦用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；

⑧将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；

⑨加入25μL DEPC水，-20℃保存备用。

2.RT操作程序

取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs2μL、M-MLV0.5μL、HIR0.5μL、下游引物Wd2μL，RNA15μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：42℃60min，95℃5min。

3.PCR操作程序

上游引物Wu0.5μL、下游引物Wd0.5μL，Taq DNA酶0.2μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs2μL、MgCl₂2μL、DEPC水12.3μL,cDNA5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94℃30s，51℃30s，72℃30s，35个循环。

4.结果判定

|阳性对照出现403bp扩增带，阴性对照在403bp扩增带相应位置无带出现时，实验结果成立。

试验结果详见图1。被检样品出现403bp扩增带，表明被检样品呈口蹄疫O型、A型、亚I型病毒通用型阳性；否则为阴性。本方法敏感性高、特异性强、快速简便、检测成本低，具有良好的市场应用前景。

<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心

<120> 检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物及试剂盒

<160> 2

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成的序列

<400> 1

CTGGGCCCTT CTTCTTC 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成的序列

<400> 2

GCTGTTTCTC TGCTCTCTC 19

Claims

1.一对检测口蹄疫病毒通用型的RT-PCR引物，其特征在于，所述引物的上游引物核苷酸序列为5′-CTGGGCCCTTCTTCTTC-3′，下游引物核苷酸序列为5′-GCTGTTTCTCTGCTCTCTC-3′。

2.一种检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述检测口蹄疫病毒通用型的试剂盒, 其特征在于，所述试剂盒还包括：RNA提取试剂、RT反应试剂、PCR反应试剂、阴性对照和阳性对照。

4.根据权利要求3所述检测口蹄疫O型、A型、亚I型病毒通用型的试剂盒, 其特征在于：

（1）所述RNA提取试剂包括：Trizol裂解液、氯仿、异丙醇和75%的DEPC乙醇；

（2）所述RT反应试剂包括：5×buffer缓冲液、dNTPs、HIR和下游引物Wd；

（3）所述PCR反应试剂包括：Taq DNA酶、10×buffer缓冲液、dNTPs、MgCl₂和cDNA；

（4）所述阴性对照包括：DEPC水；

（5）所述阳性对照包括：口蹄疫O型全病毒、口蹄疫A型全病毒和口蹄疫亚I型全病毒。

5.一种如权利要求4所述检测口蹄疫病毒通用型试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

（1）病毒RNA的提取：

取待检样品、阳性对照、阴性对照各500μL于1.5ml灭菌无RNA酶污染的EP管中，加入等量Trizol裂解液进行裂解，充分振荡，室温放置10分钟；加入300μL氯仿，摇匀放置10分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟；缓慢取出上层液体600μL放置于新的EP管；加入等量异丙醇轻轻混匀，-20℃放置30分钟；低温高速离心机12000转/分钟离心15分钟，弃去上清液；用75%的DEPC乙醇吸取1ml于管内洗涤沉淀，充分吸弃洗涤；将EP管倒置于吸水纸上，尽量吸干液体，放置于37℃温箱中15分钟，管内无可见水珠时取出；加入25μL DEPC水，-20℃保存备用；

（2）RT操作程序：

取5×buffer缓冲液5μL、dNTPs 2μL、M-MLV 0.5μL、HIR 0.5μL、下游引物Wd 2μL，RNA 15μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；

（3）PCR操作程序：

上游引物Wu0.5μL、下游引物Wd 0.5μL，Taq DNA酶0.2μL、10×buffer缓冲液2.5μL、dNTPs 2μL、MgCl₂2μL、DEPC水12.3μL, cDNA 5μL，将上述液体置于同一EP管内，混匀后放于PCR仪按如下程序操作,扩增条件：94 ℃ 30s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环。