CN1858246A - 口蹄疫病毒rt－pcr检测和分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的是一种口蹄疫病毒RT－PCR检测和分型方法。本方法通过引物P1/P2和S1/S2可以对口蹄疫病毒进行检测；通过引物S1/S2的PCR产物核苷酸同源性比较进行口蹄疫病毒血清型鉴定。本方法检测过程包括：(1)设计特异检测口蹄疫病毒的引物P1/P2和S1/S2；(2)提取口蹄疫病毒的RNA；(3)以提取的RNA为模板，利用反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA；(4)利用PCR技术进行口蹄疫病毒的核酸扩增；(5)将引物S1/S2的PCR产物克隆到pMD18－T载体，进行核苷酸序列测定，然后利用生物学软件通过核苷酸同源性比较进行血清型鉴定。用本发明的方法检测口蹄疫病毒和分型的快速、稳定性好、灵敏度高、特异性强、无散毒危险。
Description
(一)技术领域
本发明涉及的是一种利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测口蹄疫病毒，并且对所检测的毒株进行血清型鉴定。
(二)背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起偶蹄兽共患急性、热性、接触性传染病。具有传播快，传染性强，宿主谱广，抗原容易发生变异等特点。FMDV共有7种血清型即O、A、C、Asia I、SAT I、SAT II、SATIII，各血清型之间无交叉保护。所以，对FMD的快速诊断及血清型鉴定是有效控制该病的发生与传播的重要基础。
FMD的传播途径多、传染性强、为多种动物共患。严重危害家畜的生产力和畜产品质量，给畜牧业和进出口贸易造成较大的经济损失。直接威胁着国际贸易和国家声誉及人类食品卫生，因而受到人们的普遍关注，被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病。控制FMD关键在于早发现、早隔离、早预防，因而快速、敏感、可靠的诊断方法受到人们的重视。
目前，国内检疫、诊断该病常用的方法有病毒分离、琼脂扩散试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验等，这些方法或需长时间才能获得检测结果，检出率低，或在操作过程中不可避免造成散毒的危险。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种检测口蹄疫病毒和分型的快速、稳定性好、灵敏度高、特异性强、无散毒危险的口蹄疫病毒RT-PCR检测和分型方法。
本发明的目的是这样实现的：
本发明所建立的口蹄疫检测方法，是利用基因工程技术，根据口蹄疫病毒基因组中保守的3D基因和7个血清型中主要不同的部分(即VP1基因)设计、合成了2对引物，即P1/P2和S1/S2。以2对引物的下游引物(P2和S2)为反转录引物，以病毒基因组核糖核酸(RNA)为模板反转录出cDNA。然后，利用2对引物进行PCR扩增，引物P1/P2的PCR产物为457bp，引物S1/S2的PCR产物为670bp，包括口蹄疫病毒7个血清型的主要不同的部分。本发明在临床上的初步应用表明：该检测方法具有良好的特异性和敏感性，而且根据引物S1/S2的PCR产物的核苷酸同源性分析确定所检测毒株的血清型。
其中所述的检测口蹄疫病毒的2对引物的核苷酸序列为：
P1：5-AATTTTGAACAACATCTACGTGCT-3(24bp)
P2：5-CAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3(24bp)
S1：5-GCCACTGTTGAGAGCTACGG-3(20bp)
S2：5-ACGTCGGAGAAGAAGAAGGG-3(20bp)
采用本发明的检测方法可应用于：
①本发明的检测方法可以检测出处于临床和亚临床感染的病畜的口蹄疫病毒。
②本发明的检测方法还可以根据S1/S2引物的核苷酸同源性的分析进行血清型的鉴定，而且可以确定所检测毒株的流行病学情况。
本发明的产品优点体现在：
①由于该检测方法是以引物P1/P2和S1/S2、提取的病毒核酸试验材料，并非全病毒，因此避免检测时造成散毒的危险。
②该检测方法直接检测动物体内的病源，并且具有灵敏度高，特异性强，无交叉反应等优点。
③该检测方法从病料的处理到核苷酸序列分析，整个过程只需要8-72h，能够满足临床快速诊断的要求。
(四)具体实施方式
本发明的检测方法的2对引物的核苷酸序列如下：
P1：5-AATTTTGAACAACATCTACGTGCT-3(24bp)
P2：5-CAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3(24bp)
S1：5-GCCACTGTTGAGAGCTACGG-3(20bp)
S2：5-ACGTCGGAGAAGAAGAAGGG-3(20bp)
本发明检测方法过程如下：
1)病料的处理
动物组织的处理：加入5倍体积(m/v)的PBS(pH7.4)，用组织研磨器将组织捣碎。反复冻融3次，8000rpm离心5min，取上清进行RNA的提取；水疱液和流涎液体：直接将采来的水疱液或流涎液体于8000r/nim离心5min，去上清进行RNA的提取。
2)病毒RNA的提取与反转录
病毒RNA提取具体步骤为：取已处理好的病料425μl，加入50μl 10％SDS和25μl蛋白酶K，37℃水浴1.5h；加入水饱和酚/氯仿500μl，反复倒置混匀后，12000rpm离心10min，取上清于新离心管中；加入等体积的氯仿，反复倒置混匀，12000rpm离心10min，取上清于新离心管中；加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAC，-20℃沉淀2h。14000r/min4℃离心15min，弃去上清，自然晾干，用灭菌的0.1％DEPC水11μl溶解RNA。向提取的RNA中加入2μl下游引物P2或S2，70℃水浴5min，冰水浴5min。短暂离心，依次加入5μl反转录缓冲液、5μl dNTP、1μl反转录酶、1μl RNA酶抑制剂。37℃水浴90min，70℃水浴15min，-20℃保存。
3)PCR的扩增及产物检测
2对引物的PCR反应体系(25μl)均为：10×PCR Buffer 2.5μl，4×dNTP2.0μl，引物P1、P2各0.25μl，DNA模板2.0μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，加超纯水使总反应体积为25μl。PCR反应条件均为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火25s，72℃延伸30s，进行30-35个循环，最后72℃延伸7min，4℃终止反应。取5μl PCR产物在10g/L琼脂糖凝胶中以100V恒定电压电泳30min，以DL2000 DNA Marker为标准分析结果。
4)检测毒株的血清型鉴定
将引物S1/S2的PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，克隆到pMD18-T载体上，进行核苷酸序列测定，然后与GenBank中参考序列的同源性比较，从而确定其血清型。
Claims (3)
1、一种口蹄疫病毒RT-PCR检测和分型方法，其特征是：设计P1/P2和S1/S2两对引物，其中引物P1/P2位于7567-7590bp和8000-8023bp，在7个血清型口蹄疫病毒基因组中高度保守，PCR产物为457bp，主要为3D基因部分；引物S1/S2位于3266-3285bp和3917-3936bp，PCR产物大小为670bp，主要为VP1基因大部分和2A基因的小部分，此片段的相同血清型同源性均在80％以上，不同血清型同源性均小于69％，从而根据PCR产物核苷酸同源性确定所检测毒株的血清型。
2、根据权利要求1所述的口蹄疫病毒RT-PCR检测和分型方法，其特征是：检测口蹄疫病毒的2对引物的核苷酸序列如下：
P1：5-AATTTTGAACAACATCTACGTGCT-3
P2：5-CAGGTAAAGTGATCTGTAGCTTGG-3
S1：5-GCCACTGTTGAGAGCTACGG-3
S2：5-ACGTCGGAGAAGAAGAAGGG-3
3、根据权利要求1或2所述的口蹄疫病毒RT-PCR检测和分型方法，其特征是：其检测的过程包括：
(1)病料的处理
动物组织的处理：加入5倍体积(m/v)的pH7.4的PBS，捣碎，反复冻融3次，离心、取上清进行RNA的提取；
水疱液和流涎液体：直接将采来的水疱液或流涎液体进行离心处理，去上清进行RNA的提取；
(2)病毒RNA的提取与反转录
病毒RNA提取具体步骤为：取已处理好的病料425μl，加入50μl 10％SDS和25μl蛋白酶K，37℃水浴1.5h；加入水饱和酚/氯仿500μl，反复倒置混匀后，离心，取上清；加入等体积的氯仿，反复倒置混匀，离心，取上清；加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAC，-20℃沉淀2h，4℃离心，弃去上清，自然晾干，用灭菌的0.1％DEPC水11μl溶解RNA；向提取的RNA中加入2μl下游引物50pmol/L的P2或S2，70℃水浴5min，冰水浴5min；离心，依次加入5μl反转录缓冲液、5μl dNTP、1μl反转录酶M-MLV、1μl RNA酶抑制剂，37℃水浴90min，70℃水浴15min，-20□保存；
(3)PCR的扩增及产物检测
两对引物的PCR反应均为25μl体系：10×PCR Buffer 2.5μl，4×dNTP2.0μl，引物P1、P2各0.25μl，DNA模板2.0μl，TaqDNA聚合酶0.25μl，加超纯水使总反应体积为25μl；PCR反应条件均为：94℃预变性5min，94℃变性30s、58℃退火25s、72℃延伸30s，进行30-35个循环，最后72℃延伸7min，4℃终止反应；取5μl PCR产物在10g/L琼脂糖凝胶中以100V恒定电压电泳30min，以DL2000 DNA Marker为标准分析结果；将引物S1/S2的PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，克隆到pMD18-T载体上，进行核苷酸序列测定，然后与GenBank中参考序列的同源性比较，从而确定其血清型。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20061108 |
|
| CI01 | Publication of corrected invention patent application |
Correction item: Rejection of patent application Correct: Dismiss False: Reject Number: 32 Volume: 26 |
|
| ERR | Gazette correction |
Free format text: CORRECT: PATENT APPLICATION REJECTION AFTER THE ANNOUNCEMENT; FROM: REJECTION TO: CANCEL REJECTION |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Wang Junwei Inventor after: Qu Zhehui Inventor after: Zhang Wenlong Inventor before: Wang Junwei Inventor before: Qu Zhehui |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WANG JUNWEI QU ZHEHUI TO: WANG JUNWEI QU ZHEHUI ZHANG WENLONG |
|
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111026 Termination date: 20130322 |