CN101724711B - 用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光pcr引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光PCR引物和探针，所述的引物对能特异性扩增口蹄疫病毒基因组5′-UTR序列的保守区域，所述探针特异性针对于该引物对扩增区域中的GC高含量区，其5’端具有报告荧光染料标记，3’端具有淬灭荧光染料标记。本发明充分利用了荧光PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定待检组织病料中是否含有亚欧型口蹄疫病毒，本发明中PCR扩增所针对的基因组区域，为亚欧型口蹄疫病毒特异性的序列，与南非型口蹄疫病毒无交叉反应，在获得良好的特异性同时，通用性更强。

Description

用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光PCR引物和探针

技术领域

本发明属于流行病学和食品卫生检测领域，具体而言，本发明涉及用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光PCR引物和探针，以及使用其进行检测的方法，更具体地说，是对猪、牛、羊等偶蹄类动物及相关动物产品中是否携带A、O、C以及Asia1型口蹄疫病毒进行检测的通用实时荧光PCR引物和探针，以及使用其进行检测的方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、高接触性传染病(江鹏斐等，1999)，同时也是一种严重的“政治经济病”，列为OIE规定的A类传染病之首，同时也是动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象(董志强等，2007)。目前，ELISA及病毒分离是OIE推荐的检测方法，存在操作时间长(病毒培养需要4d时间)、敏感性低(ELISA敏感性只有70％-80％)等缺点(花群义等，2005)。

荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特异性强(在普通PCR一对引物的基础上，中间还设计有探针，只有引物和探针均完全配对，才可能得到扩增，可对少至2个核苷酸的序列差异进行鉴定，从而保证了反应的特异性)、操作安全方便(无须凝胶电泳，避免了EB染色对人体的危害)等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。

目前，国内外建立了很多FMDV通用型荧光RT-PCR检测方法。但现有资料表明作为RNA病毒，FMDV在复制过程中由于缺乏校对机制，基因组每复制一次，就有0.1-10个核苷酸发生变异(Gu等，2007)。在不同的生存环境、免疫压力等条件的诱导下，基因组特别是结构蛋白编码区核苷酸变异的几率更高，很难选择在蛋白编码区设计引物/探针，建立通用型荧光RT-PCR检测方法。同时研究表明，FMDV的七个血清型即O、A、C、亚洲1(Asia1)型、南非1、2、3型(SAT1、SAT2、SAT3)可用核酸杂交分成两群，O、A、C和亚洲1型为亚欧型FMDV，南非1、2、3型为南非型FMDV，群内各型核酸同源性达60％-70％，但两群之间仅为25％-40％(卢曾军，2003)，因此目前还很难设计出特异性较高的亚欧型及南非型均通用的荧光RT-PCR引物与探针。

针对目前我国尚无南非型口蹄疫疫情的现状，本发明在对FMDV大量基因信息进行分析比较的基础上，选择亚欧型口蹄疫病毒高度保守的5′-UTR(非翻译区)设计引物和探针，建立了亚欧型FMDV特异的荧光RT-PCR检测方法，从而可大大提高口蹄疫病毒PCR检测方法的通用性，满足我国相关动物及动物产品的口蹄疫检测及监测需求。

发明内容

本发明目的在于提供用于亚欧型口蹄疫病毒检测的荧光PCR引物和探针序列。

本发明的目的通过下述技术方案实现：从GenBank中获得口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列，应用MegAlign软件对上述序列进行比较和一致性分析，选择较为保守的5′-UTR(非翻译区)序列，根据引物和探针的设计原则，用软件Beacon Designer7.0在这些序列的保守区域筛选到一对具有通用碱基序列的通用引物，引物对经在线序列BLAST分析，确定为亚欧型FMDV(包括A、O、C以及Asia 1型)区别于南非型FMDV(包括SAT-1、SAT-2、SAT-3型)的特异性引物对。在该引物对的扩增区域内设定一条通用的荧光TaqMan探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同DNA模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对亚欧型FMDV的检测。

优选地，本发明荧光PCR引物对扩增的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的特异性荧光探针针对该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5’端具有报告荧光染料标记，3’端具有淬灭荧光染料标记。更优选地，本发明亚欧型FMDV特异性的正向引物序列为5′-TACCACYTTCCGCCTACTTG-3′，反向引物序列为5′-GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3′，以及该引物对的正向引物向5’端延伸10个碱基、反向引物向3’端延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列及互补序列；探针序列为，5′-CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3′，5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。探针的反向互补序列为5′-CAACRGGAGTGCCCAAGACAGCG-3′以及该探针向5’端延伸10个碱基、向3’端延伸10个碱基区域内得到的探针序列及互补序列。

亚欧型FMDV特异性的PCR引物和探针设计完成后，采用在线BLAST分析其序列特异性。结果表明亚欧型FMDV特异性的引物和探针设计区域为亚欧型FMDV所特有，没有发现同源或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。

在本发明的一个优选实验方案中，引物扩增产物长度为196bp，探针设计于待扩增序列间的高GC含量区，该探针的5’端用报告荧光染料HEX标记，3’端用淬灭荧光染料Eclipse标记。

亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测采用如下步骤进行：

1)进行A、O、C以及Asia 1型口蹄疫病毒感染样本RNA的提取；

2)向经过处理的口蹄疫病毒RNA加入权利要求1所述引物对和荧光素标记探针以及PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液、MgCl₂、ddH₂O及反转录酶、DNA聚合酶，制备PCR扩增反应液；

3)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；

5)根据各样本的反应Ct值，按照阳性判定标准判定待检样本中是否存在亚欧型口蹄疫病毒。

本发明的引物对和探针以及相应检测方法充分利用了荧光PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定待检组织病料中是否含有亚欧型口蹄疫病毒。同时，本发明中PCR扩增所针对的基因组区域，为亚欧型口蹄疫病毒特异性的序列，与南非型口蹄疫病毒无交叉反应，在获得良好的特异性同时，通用性更强。

附图说明

图1所示的是含有荧光PCR锚定DNA片断的重组质粒的PCR鉴定结果。图中M道指DL-2000DNA Marker，1-5道分别均为PCR产物，6道为阴性对照；

图2所示的为亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测方法的扩增曲线。图中曲线1-7分别对应当采用的质粒模板浓度为1.9×10⁷-1.9×10拷贝时的扩增情况，曲线8是阴性对照；

图3所示的是亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测方法的标准曲线；

图4所示的是亚欧型FMDV荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果。图中曲线1、2、3、4分别代表采用C Waldman、OlManisa、Asial shamir与A22 Mahmatli型FMDV的RNA作为模板时的荧光RT-PCR扩增结果，曲线5、6、7分别代表采用SAT1RV11/37、SAT2Eritrea、SAT3 Kenya11/60型FMDV的RNA作为模板时的荧光RT-PCR扩增结果，曲线8为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例1引物和探针的制备

1引物和探针的设计和合成

从GenBank中获得口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列，应用MegAlign软件对上述序列进行比较和一致性分析，选择较为保守的5′-UTR(非翻译区)序列，根据引物和探针的设计原则，用软件BeaconDesigner7.0在这些序列的保守区域筛选到一对具有通用碱基序列的亚欧型口蹄疫病毒通用引物，引物对经在线序列BLAST分析，确定为亚欧型FMDV(包括A、O、C以及Asia1型)区别于南非型FMDV(包括SAT-1、SAT-2、SAT-3型)的特异性引物对。并在该引物对的扩增区域内设定一条通用的荧光TaqMan探针。

引物序列为：

FMDVU6(正向)：5′-TACCACYTTCCGCCTACTTG-3′

FMDVL6(反向)：5′-GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3′，扩增产物长度为196bp；

所述探针的序列为：

FMDVP65′-CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3′

该探针的5’端用报告荧光染料HEX标记，3’端用淬灭荧光染料Eclipse标记。该探针的设计针对于所扩增序列间的高GC含量区。

2引物和探针的准备

引物和探针合成后，引物稀释为10μmol/L，探针稀释为20μmol/l，上、下游引物和探针按照1：1：1等体积混合后，将引物+探针混合液-20℃避光保存备用。

实施例2亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测方法的建立

1病毒RNA的提取

取100μL的灭活细胞毒，加1mL Trizol液，按照Trizol操作说明书提取总RNA后，用20μL DEPC处理的灭菌双蒸水溶解，置-86℃冰箱贮存备用。

2一步法扩增目的基因

利用实施例1制备的引物FMDVU6与FMDVL6对上述提取的RNA进行RT-PCR扩增。RT-PCR反应体系参照One Step RNA PCRKit说明书进行。在PTC-200梯度PCR仪(MJ)上扩增，反应程序为：50℃反转录30min，94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环；72℃补偿延伸10min。

3阳性质粒的构建

用Agarose Gel DNA Purification Kit(OMEGA，D2501-01)将上述PCR产物回收纯化，连接到pGEM-T easy载体(Promega，A1360)中并转入JM109大肠埃希氏菌，经过筛选、PCR鉴定获得含目的片段的重组质粒。通过北京诺赛基因组研究中心测序鉴定，证实目的基因已正确克隆到载体中，用核酸蛋白测定仪(NanoDrop，ND-100)测定质粒浓度，换算成拷贝数，-20℃保存备用，使用前进行10倍梯度稀释。

4荧光PCR反应条件与体系的建立与优化

以构建的含有靶基因的阳性质粒为DNA模板，建立亚欧型FMDV通用荧光PCR方法，并对PCR反应体系和反应条件进行优化，确定荧光PCR反应体系组成为：10倍系列稀释的质粒DNA1μL，10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL，FMDVL6、FMDVU6(10μmol/L)各0.5μL，荧光探针FMDVP6(10μmol/L)0.5μL，MgCl₂(25mmol/L)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.5μL，rTaq DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O补充至25μL。反应在iQ^TM5荧光PCR仪(Bio-Rad)上进行，PCR反应程序为：95℃预变性3min，94℃变性10s，52℃退火30s，扩增45个循环，每个循环第二步反应结束时检测荧光。

5标准曲线的建立及敏感性测定

以10倍梯度稀释(1.9×10⁷-1.9×10拷贝)的质粒DNA为模板，在荧光PCR仪上检测，得到扩增动力学曲线与相应的标准曲线。同时根据测得的最低拷贝数评价其敏感性。

6特异性试验

提取O1Manisa(.Carrillo C，Tulman ER，Delhon G，LuZ，Carreno A，Vagnozzi A，Kutish GF，Rock DL.ComparativeGenomics of Foot-and-Mouth Disease Virus.JOURNAL OFVIROLOGY.2005，79(10)：6487-6504.)、Asial shamir(Freiberg B，

 B，Haas B，Saalmüller A，Pfaff E，MarquardtO.Type-independent detection of foot-and-mouthdisease virus by monoclonal antibodies that bind toamino-terminal residues of capsid protein VP2.J Virol Methods.2001，92(2):199-205.)、A22Mahmatli(Klein J，Hussain M，Ahmad M，NormannP，Afzal M，Alexandersen S.Geneticcharacterisation of the recent foot-and-mouth disease virus subtypeA/IRN/2005.VirolJ，2007，15(4):122)、C Waldman(Carrillo C，TulmanER，Delhon G，Lu Z，Carreno A，Vagnozzi A，Kutish GF，Rock DL.Comparative Genomics of Foot-and-Mouth Disease Virus.JOURNALOF VIROLOGY.2005，79(10)：6487-6504.)、SAT1RV11/37(Carrillo C，Tulman ER，Delhon G，Lu Z，Carreno A，Vagnozzi A，Kutish GF，Rock DL.High throughput sequencing and comparativegenomics of foot-and-mouth disease virus.Dev Biol(Basel).2006，126:23-30)、SAT2 Eritrea(Bronsvoort BM，Radford AD，Tanya VN，Nfon C，Kitching RP，Morgan KL.Molecular epidemiology offoot-and-mouth disease viruses in the Adamawa province of Cameroon.J Clin Microbiol.2004，42(5):2186-2196)、SAT3 Kenya11/60(CarrilloC，Tulman ER，Delhon G，Lu Z，Carreno A，Vagnozzi A，KutishGF，Rock DL.Comparative Genomics of Foot-and-Mouth Disease Virus.JOURNAL OF VIROLOGY.2005，79(10)：6487-6504.)等病毒株的RNA作为模板，以DEPC处理的ddH₂O为模板作阴性对照，进行亚欧型FMDV荧光RT-PCR检测方法的特异性试验。反应体系为：10×One step RNA PCR Buffer2.5μL，dNTP(10mmol/L)2.5μL，MgCl₂(25mmol/L)5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，AMV RTaseXL(5U/μL)0.5μL，AMV-Optimized Taq(5U/μL)0.5μL，FMDVU6、FMDVL6(10μmol/L)各0.5μL，荧光探针FMDVP6(10μmol/L)0.5μL，RNA模板2μL，ddH₂O补充至25μL。反应程序为:50℃反转录30min，95℃预变性3min，95℃变性15s，52℃退火30s，扩增45个循环。

7实验结果

以重组的质粒DNA为模板进行扩增，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示特异性条带大小为196bp，与引物的预设扩增片段大小相符。

使用质粒DNA制作标准曲线。以10倍梯度稀释的质粒为模板，对应浓度为1.9×10⁷-19拷贝，以获得的CT值为y轴，对应的质粒DNA拷贝数的对数为x轴，仪器自动生成标准曲线的扩增效率为99％，相关系数为0.998，标准方程为y＝-3.346x+42.717。由扩增曲线可知，荧光PCR的检测灵敏度为19个拷贝。根据检测出的最低拷贝数我们设立检测结果的判定标准，在阴性无Ct值的前提下，待检样品Ct值在38以下为阳性，38-45为可疑，需加大模板量重新进行检测，无Ct值的样品为阴性。

将建立的亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测方法进行特异性试验发现，口蹄疫O1Manisa、Asial shamir、A22Mahmatli、C Waldman等亚欧型分离株都有扩增，Ct值分别为32.84，33.88，31.49，33.20。而SAT1RV11/37、SAT2Eritrea、SAT3Kenya11/60与阴性对照都没有扩增，体现了本方法良好的特异性。

实施例3亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测方法的应用

1组织病料RNA的提取

在无菌环境中，将采集的动物机体组织(如舌、鼻、蹄水泡皮)置乳钵中，剪碎，加灭菌石英砂研磨。其它机体组织(如淋巴结、扁桃体等)除去包膜和其它结缔组织，选取内部实质部分，置乳钵中，剪碎，加灭菌石英砂研磨。再加0.01mol/L PBS(pH7.6-7.8)或MEM(pH7.6-7.8)制成1:5的悬液。-20℃至-30℃冻融2次，3000r/min离心10min，取上清液提取总RNA。液体样品，如水泡液和OP液直接用于提取总RNA。进行组合子病料RNA提取的同时，应设立细胞培养亚欧型口蹄疫病毒作为阳性对照，未感染口蹄疫的动物相关组织作为阴性对照。

组织病料总RNA提取具体按照如下步骤进行：

1.1取500μL组织样品研磨上清液置1.5mleppendorf管中，加等量(500μL)三氯甲烷，快速振荡数秒，8000r/min，4℃，离心5min。细胞毒、水泡液、阳性样品不经此步处理。

1.2取上清液200μL置1.5ml eppendorf管中，加入1000μLTRIzoL，反复混匀，冰上放置5min。取阳性对照样品(50-200μL均可)，同时提RNA。

1.3加200μL三氯甲烷，小心盖上帽盖，用力摇动eppendorf管15秒，室温放置5min。

1.411000r/min，4℃，离心15min，可见分为三层，上层水相含RNA。

1.5转移水相至一新eppendorf管，加入等量异丙醇(约500μL)，混匀，室温放置15min。

1.611000r/min，4℃，离心10min，离心后在eppendorf管边和底部可见有胶样RNA沉淀。

1.7洗RNA：弃上清，加1000μL75％乙醇(使用前用RNase FreedH₂O加无水乙醇配置而成)洗涤沉淀，重复一次，10000r/min，4℃，离心5min。

1.8室温充分干燥RNA沉淀。加10μL RNase Free dH₂O，即可用于PCR扩增。可以-20℃保存备用。

2样品检测步骤

亚欧型口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的反应体系为:10×One stepRNA PCR Buffer2.5μL，dNTP(10mmol/L)2.5μL，MgCl₂(25mmol/L)5μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)0.5μL，AMV RTase XL(5U/μL)0.5μL，AMV-Optimized Taq(5U/μL)0.5μL，FMDVU6、FMDVL6(10μmol/L)各0.5μL，荧光探针FMDVP6(10μmol/L)0.5μL，上述提取的组织病料RNA模板2μL，ddH₂O补充至25μL。试验同时设立以DEPC处理的ddH₂O为模板作空白对照。将上述各PCR反应管放于荧光PCR仪上，选择HEX通道采集荧光信号。

反应程序为：50℃反转录30min，95℃预变性3min，95℃变性15s，52℃退火30s，扩增45个循环，每个循环结束采集荧光信号。

3结果判定

反应结束后，仪器将自动给出每个样品的Ct值。记录Ct值，分析检测结果。

3.1试验成立判定

只有阳性对照有扩增曲线，而且Ct≤38；同时阴性对照及空白对照无扩增曲线或者扩增曲线Ct>45的，才可判定本次试验成立，否则本次试验无效。

3.2阳性判定

如果样品的PCR扩增曲线Ct≤38，则表明样品中携带亚欧型口蹄疫病毒。

3.3阴性判定

如果样品无扩增曲线或者扩增曲线Ct≥45，则表明样品中不携带亚欧型口蹄疫病毒。

3.4可疑判定

如果38<Ct<45，判为可疑，可以加大模板量5-10倍再重复扩增，如果重复试验的Ct<45，则判定样品中携带亚欧型口蹄疫病毒。

按照上述方法对实验室保存的14份口蹄疫可疑样品进行检测，结果检出阳性2份，均为河北某肉牛饲养场送检的牛O-P液。该结果与采用国家口蹄疫参考实验室提供的口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测ELIS试剂盒(FMDV-NSP-I-ELISA Kit)、按照试剂盒说明、对相关牛的血清进行检测的结果(待检动物非结构蛋白检测为阳性，表明为感染动物)相一致。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所

<120>用于亚欧型口蹄疫病毒检测的实时荧光PCR引物和探针

<130>KHP08112986.5

<160>4

<170>PatentIn version3.5

<210>1

<211>1096

<212>DNA

<213>Foot-and-mouth di sease virus

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

Claims (4)

1.一种用于亚欧型口蹄疫病毒进行实时荧光PCR检测的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：正向引物：5’-TACCACYTTCCGCCTACTTG-3’；

反向引物：5’-GGAAHGACGYAAAACTTAGG-3’，所述亚欧型口蹄疫病毒为O、A、C和亚洲1型口蹄疫病毒。

2.一种用于亚欧型口蹄疫病毒进行实时荧光PCR检测的荧光素探针，其特征在于，该探针的核苷酸序列为：5′-CGCTGTCTTGGGCACTCCYGTTG-3′，该探针的5’端具有报告荧光染料HEX标记，3’端具有淬灭荧光染料Eclipse标记，所述亚欧型口蹄疫病毒为O、A、C和亚洲1型口蹄疫病毒。

3.含有权利要求1所述引物对和权利要求2所述探针的检测试剂盒。

4.权利要求1所述引物对和权利要求2所述探针在制备用于检测及鉴定亚欧型口蹄疫的试剂中的用途，所述亚欧型口蹄疫为O、A、C和亚洲1型口蹄疫。

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