CN104152578B - 猪流行性腹泻病毒rt-pcr鉴别诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

猪流行性腹泻病毒rt-pcr鉴别诊断试剂盒及其应用 Download PDF

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

本发明公开一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含：针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245～294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区。本发明基于ORF3基因的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，具有特异性强、灵敏性高的特点，不仅能快速检测出仔猪腹泻样品中是否存在PEDV，而且还能快速、准确地区分自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株，对于猪流行性腹泻病的早期快速诊断和防控具有重要意义。

Description

猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻病毒感染检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻病(Porcineepidemicdiarrhea，PED)在欧洲和亚洲一些养猪业发达的国家都曾有相关报道，是一种危害较为严重的传染病。最近两年来在我国部分养猪场再度爆发了以未断奶仔猪发生水样腹泻、呕吐和高死亡率为特征仔猪腹泻疫情，该病以7日龄内仔猪发病为主，病程急、传播迅速、仔猪死亡率高，而且在同一猪场易呈反复发作，曾一度造成部分猪场出现阶段性产房无仔的严重局面，给养猪业带来了重大的经济损失。在对发生仔猪腹泻疫情的临床样品检测时发现猪流行性腹泻病毒(PEDV)的阳性检出率很高，推测PEDV是此次腹泻疫情主要病因之一。疫苗免疫是控制疫情的首选，韩国、日本等已经将弱毒疫苗用于该病的预防控制，国内也有一些猪场在使用弱毒疫苗，在临床上如何区分疫苗免疫与自然感染毒株，对仔猪腹泻疫情进行有效地预警具有重要意义。
对于PEDV感染的诊断方法已有多种，如对采集的临床样品进行处理后，利用病毒适应性细胞进行病毒分离的方法；利用免疫胶体金试纸条直接检测样品中的病毒抗原；根据PEDV病毒的保守性内部基因设计引物，利用RT-PCR的方法对病毒的基因进行检测等方法。其中，病毒分离不仅耗时耗力，而且由于该病毒的特性难于细胞上进行分离培养，因此不利于对疫情的及时诊断，后两种方法可以实现对病毒的及时、快速诊断，但是却不能很好的满足对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的需求。PEDV的ORF3基因位于S基因与E基因之间，有研究认为冠状病毒ORF3编码的辅助蛋白具有离子通道的特性与病毒的释放有关，ORF3基因沉默可以降低病毒在Vero细胞上的滴度。
发明内容
本发明要解决目前诊断PEDV感染的方法，不能实现对自然感染与疫苗免疫毒株进行鉴别诊断的技术问题，提供一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，该试剂盒特异性强、灵敏性高，可快速、准确地区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，对于猪流行性腹泻病毒疫情的早期快速诊断、防控、以及流行病学的全面监测具有重要意义。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245～294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区。
优选的，所述上下游引物的序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。
更优选的，所述引物的使用浓度为25mmol/L。
所述试剂盒还包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列没有发生缺失的PEDV野毒株对照。
所述试剂盒还包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列发生缺失的PEDV弱毒疫苗株对照。
所述试剂盒还包含：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。
优选的，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为50℃。
在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备诊断猪流行性腹泻病的产品中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了上述猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备区分PEDV弱毒疫苗株与自然感染野毒株的产品中的应用。
本发明基于PEDVORF3基因的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，具有特异性强、灵敏性高的特点，不仅能快速检测出仔猪腹泻腹泻样品中是否存在PEDV，而且还能快速、准确地区分自然感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，可应用于猪流行性腹泻病的临床诊断、分子流行病学调查等方面，对于猪流行性腹泻病的早期快速诊断和防控具有重要意义。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的PEDV流行毒株ORF3基因缺失区域核苷酸序列比较图；
图2是本发明实施例1的基于ORF3基因序列建立的进化树图；
图3是本发明实施例2确定RT-PCR最佳Tm值的结果图；
图4是本发明实施例2确定RT-PCR最佳引物浓度的结果图；
图5是本发明实施例3的RT-PCR特异性试验结果图；
图6是本发明实施例4的RT-PCR方法敏感性鉴定结果图；
图7是本发明实施例5临床样品的RT-PCR检测结果图。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔DW，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
为了建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒(PEDV)自然感染与疫苗免疫毒株的方法。本发明根据目前使用的PEDV弱毒疫苗均为ORF3基因存在缺失的毒株，而能引起自然感染发病的毒株ORF3基因没有发生缺失，研发出一种基于ORF3基因缺失区域的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法与试剂盒。本发明根据GenBank公布的PEDVORF3基因序列，在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物，对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测，分析流行毒株的ORF3基因，选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增，优化其反应体系、Tm值等条件，进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验，并对大量临床样品进行检测验证。结果是，从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因，序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失，属于自然感染野毒，其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8％～97.1％。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因，其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300bp，而弱毒疫苗株则为250bp左右；该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增，其敏感性可达到100TCID50/0.1mL，对仔猪腹泻临床样品检测结果显示，PEDV自然感染的阳性率为65.4％。因此，本发明基于PEDVORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法和试剂盒，可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速、实用的检测方法和检测试剂盒。
下面通过具体实施例阐述本发明。
材料：
1.毒株与样品来源
PEDV毒株HLJ-1株和ZJCZ4株以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSVHuN4株)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪瘟病毒(CFSV)由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室分离保存，11份已知PEDV阳性仔猪腹泻样品由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室鉴定并保存，26份未知仔猪腹泻样品2013年初采集自上海。
2.主要试剂
TaqDNA聚合酶、DNAMarker、dNTP、pMD18-T载体购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒RNeasyPlusMiniKit购自QIAGEN公司；单链cDNA合成试剂盒RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit购自Fermentas公司；感受态菌种DH5α由中国农业科学院上海兽医研究所猪传染病研究室保存。
实施例1仔猪腹泻样品的检测与流行毒株ORF3基因序列的分析
(1)引物设计
根据PEDVZJCZ-4(GenBank序列号：JX524137)设计并合成一对扩增ORF3全基因引物ORF3-P1/ORF3-P2。参考PEDVCV777(GenBank序列号：AF353511)、ZJCZ-4及疫苗株DR13(GenBank序列号：EU054930)的ORF3基因序列，设计并合成了一对鉴定引物ORF3-JD1/ORF3-JD2，鉴定引物位于ORF3缺失区(245nt～294nt)两端的保守区，其扩增范围覆盖整个缺失区域。以上两对引物如表1所示，所有引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
表1扩增PEDVORF3基因引物及鉴定引物
(2)样品中RNA提取及反转录
离心处理本实验室采集并保存的仔猪腹泻样品，取PEDV分离株HLJ-1株和ZJCZ4株以及处理好的临床样品各300μL，按RNeasyPlusMiniKit说明书提取病毒RNA。同时根据RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit说明书将样品提取的RNA反转录成单链cDNA，即提取的样品总的RNA11μL，随机引物Oligo(dT)1μL，5×缓冲液4μL，RNase抑制剂(20u/μL)1μL，dNTPMix(10mM)2μL，M-MuLV反转录酶(200u/μL)1μL，cDNA合成后-20℃保存备用。
(3)临床样品ORF3基因的扩增、克隆与测序
从本实验室保存的仔猪腹泻样品中挑选出11个PEDV阳性样品(ZZ-1，HEB-1，FQ1-5，QZ1-4，SD-2，SD-4，SD-5，SDXY-7B，BJ-26，ZJ-2，ZJ-3)，利用ORF3-P1/P2引物扩增、克隆ORF3基因，并由Invitrogen公司测序。应用MEGA4.1软件，对以上样品毒株的ORF3基因与GenBank上已发表的PEDVORF3基因参考序列进行比较分析(参考株见表2)。
表2用于ORF3基因序列分析的12个PEDV参考毒株名称和来源
分离株名称 登录号 来源
CV777 AF353511 英国分离株(首次分离株)
CV777 GU372744 中国弱毒疫苗株
DR13 JQ023161 韩国分离株
DR13 EU054930 DR13株致弱株
Chinju99 AF237764 韩国分离株
DBI865 GU937797 韩国弱毒疫苗株
CH/S JN547228 中国分离株
LZC EF185992 中国分离株
CH/FJND-3/2011 JQ282909 中国分离株(现在流行株)
ZJCZ-4 JX524137 中国分离株(现在流行株)
AHYS JX910248 中国分离株
JSTS2010 KC161198 中国分离株
(4)结果：流行毒株ORF3基因序列分析
本发明克隆获得了11份PEDV阳性样品的ORF3基因，测序后运用MEGA4.1分析了11个样品的ORF3基因序列，结果显示：与表2中列出的GenBank提供的参考序列相比较，11份样品中有9个流行毒株在ORF3基因中没发生基因缺失，另外2株(HEB-1与SD-5)则在245nt～293nt之间均存在49个碱基的缺失(如图1所示)，9株未缺失的流行株与现在流行株CH-FJND-2011(JQ282909)的核苷酸同源性为96.6％～99.1％，与疫苗株DR13(EU054930)的核苷酸同源性为95.8％～97.1％。系统发育树分析表明，9个毒株与我国现在流行株CH-FJND-2011株以及我国分离株CH/S(JN547228)和韩国分离株DR13(JQ023161)亲缘关系较近，共处于同一分枝，而SD-5和HEB-1则分别与我国的弱毒疫苗株CV777(GU372744)以及韩国弱毒疫苗株DR13(EU054930)和DBI8659(GU937797)的亲缘关系较近(见图2)。图2中，“▲”为本发明获得的毒株序列。
实施例2RT-PCR反应条件的优化
(1)鉴别诊断RT-PCR扩增及最佳Tm值的确定
利用鉴定引物ORF3-JD1/JD2对HLJ-1株和ZJCZ4株的cDNA进行PCR扩增。PCR反应总体积20μL，内含10×PCR缓冲液2μL、dNTP(2.5mmol/L)1.5μL、上下游引物各0.5μL、rTaqDNA聚合酶0.5μL、cDNA2μL，加水至20μL。PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min，退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。其中PCR退火温度设5个梯度，分别是：45℃、48℃、50℃、52℃、55℃。获得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。
(2)RT-PCR最佳引物浓度的确定
在上述反应条件的基础上，将上、下游鉴定引物浓度分为25mmol/L、5mmol/L、2.5mmol/L、0.5mmol/L、0.25mmol/L等5个不同浓度分别进行RT-PCR扩增，其PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察。
(3)结果：
分别以ZJCZ4株、HLJ-1株为模板，对RT-PCRTm值、引物浓度等反应条件进行优化，结果显示鉴别诊断RT-PCR反应体系为20μL时：模板cDNA2μL，10×PCR缓冲液2μL，dNTP(2.5mmol/L)1.5μL，上、下游引物25mmol/L各0.5μL，rTaqDNA聚合酶0.5μL，ddH2O13μL；反应条件为：95℃/5min，94℃/1min，50℃/30s，72℃/30s，进行35个循环；最后72℃/10min(见图3、图4)。图3中，M：MakerDL2000；1-6：以ZJCZ4株为模板，依次为45℃，48℃，50℃，52℃，55℃，58℃；7-12：以HLJ-1株为模板，依次为45℃，48℃，50℃，52℃，55℃，58℃；13：阴性对照。图4中，M：MakerDL2000；1-5以ZJCZ4株为模板；依次为25、5、2.5、0.5、0.25mmol/L；6-10以HLJ-1株为模板；依次为25、5、2.5、0.5、0.25mmol/L；11：阴性对照。
实施例3RT-PCR特异性鉴定试验
分别提取本实验室保存的TGEV、PoRV、PRRSV(HuN4株)、CSFV和PEDV(HLJ-1株和ZJCZ4株)的RNA，利用ORF3-JD1/JD2引物，进行RT-PCR扩增特异性的验证。
结果显示，只有ZJCZ4株和HLJ-1株可以扩增出大小不一的特异性条带，大小分别约为300bp和250bp，而以其它病毒核酸为模板没有特异性条带出现(见图5)。图5中，M：MakerDL2000；1：TGEV；2：PoRV；3：PRRSV(HuN4株)；4：CSFV；5：HLJ-1株；6：ZJCZ4株；7：阴性对照。
实施例4RT-PCR敏感性试验
将病毒效价已知的PEDVHLJ-1株悬液(106TCID50/0.1mL)进行10倍倍比稀释，按照实施例1所述的方法提取病毒RNA并反转录，利用ORF3-JD1/JD2引物进行RT-PCR，检测其敏感性。
结果显示，该方法最低可以检测出100TCID50/0.1mL(见图6)。图6中，M：MarkerDL2000；1-8：106TCID50-0.1TCID50，9：HLI-1对照，10：ZJCZ4对照；11：阴性对照。
实施例5猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒的组成及应用该试剂盒对临床样品进行RT-PCR检测
1、试剂盒的组成
将SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的ORF3-JD1/JD2引物对、ORF3基因中没发生基因片段缺失的PEDV野毒株对照、ORF3基因中存在基因片段缺失的PEDV弱毒疫苗株对照、RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。
2、本发明试剂盒的应用
取11份2011-2012年间已知PEDV阳性样品和2013年初采集的26份未知的仔猪腹泻样品分别经离心处理后，提取样品中的总RNA，利用上述RT-PCR鉴别诊断试剂盒进行检测和结果分析。
对11份已知PEDV阳性的临床样品和26份未知样品进行RT-PCR鉴别扩增，结果显示11份样品与此前检测的结果符合率为100％，其中11份样品中除了位于9、13泳道的SD-5和HEB-1这2个样品的扩增片段为250bp外，其它泳道的9个样品的扩增片段大小均一致约为300bp(见图7A)。对26份未知仔猪腹泻样品检测检测结果显示有17份样品为PEDV阳性，且扩增片段大小与阳性对照ZJCZ4株大小一致(见图7B)。图7A中：M：MakerDL2000；1-3：FQ1-5，ZZ-1，QZ1-4；4、17：ZJCZ4阳性对照；5、16：HJL-1阳性对照；6、15：阴性对照；7-14：SD-2，SD-4，SD-5，SDXY-7B，ZJ-2，ZJ-3，HEB-1，BJ-26。图7B：1、17：ZJCZ4阳性对照；16、32：HJL-1阳性对照；15、31：阴性对照；2-14：SH1～SH13；18-30：SH14～26。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所
<120>猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒及其应用
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
<223>引物
<400>1
atgtttcttggacttttt18
<210>2
<211>18
<212>DNA
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<220>
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<222>(1)..(20)
<223>引物
<400>4
gctcaaaagtgatgtaatgg20

Claims (8)

1.一种猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
针对PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245～294位核苷酸序列缺失区设计的一对引物，该对引物的上下游引物分别位于所述ORF3基因缺失区两端的保守区，所述上下游引物的序列如SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列没有发生缺失的PEDV野毒株对照。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：ORF3基因第245～294位核苷酸序列发生缺失的PEDV弱毒疫苗株对照。
4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。
5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述引物的使用浓度为25mmol/L。
6.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为50℃。
7.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备诊断猪流行性腹泻病的产品中的应用。
8.权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断试剂盒在制备区分PEDV弱毒疫苗株与自然感染野毒株的产品中的应用。
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