CN103320536A

CN103320536A - 一种非洲猪瘟pcr检测方法及寡核苷酸引物对

Info

Publication number: CN103320536A
Application number: CN2013102729079A
Authority: CN
Inventors: 单虎; 张传美; 秦晓冰; 王述柏; 黄娟; 杨瑞梅; 陈琳琳
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2013-09-25
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: CN103320536B

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测非洲猪瘟的PCR方法及寡核苷酸引物对。参照GenBank收录的23株ASFVP72蛋白全基因序列，设计一对特异性引物，根据设计的引物，探索最佳反应体系和反应条件，并对建立的PCR反应方法进行敏感性试验、特异性试验、重复性试验，对来自14个猪场中患有繁殖障碍母猪或具有呼吸障碍症状的仔猪和流产胎儿的临床样本进行PCR方法检测。试验结果表明所建立的PCR方法能敏感、快速地检测非洲猪瘟病毒。本研究所建立的PCR检测方法具有很好的应用性,能够用于非洲猪瘟疫病的检测。

Description

一种非洲猪瘟PCR检测方法及寡核苷酸引物对

技术领域

本发明涉及一种用于检测非洲猪瘟的PCR方法及寡核苷酸引物对，属于生物检测技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病。对养猪业危害巨大，是各国严密防范的传染病，我国将其列为一类动物疫病。临床症状和病理变化表现为高热、皮肤出血、呼吸障碍、神经症状、流产、水肿及脏器出血，均类似于急性猪瘟,在诊断时极易误诊,且病程短、病死率高,可高达100%。目前我国未传入非洲猪瘟疫病，世界上也无有效地疫苗可以防治，为杜绝此病传入我国，加强检验检疫力度，有必要建立快速准确的PCR检测方法。

非洲猪瘟P72蛋白是B646L编码的ASFV主要的核衣壳蛋白，分子量为73.09KDa，在碱基序列和核苷酸序列上高度保守，是病毒相当保守的抗原性蛋白。因此，针对P72基因的保守区进行PCR检测方法的建立，能够提高PCR检测方法的特异性和敏感性。

发明内容

本发明的目的在于建立一种快速敏感检测非洲猪瘟的PCR方法及寡核苷酸引物对。

建立一种快速敏感检测非洲猪瘟的PCR方法及寡核苷酸引物对的具体实施步骤见图7。

PCR检测方法最关键在于引物设计，本发明通过序列比对，针对P72基因的保守区设计引物，既能保证鉴定病原的正确，又不能漏检同种不同株病原，同时提高引物的特异性。另外，本发明的扩增片段长度适宜，同时引物二聚体等非特异性扩增产物很少。另外，通过PCR反应体系和反应条件的优化，得到特异性和灵敏性较高的针对P72基因的PCR检测方法。经最终实验证实，本发明的PCR方法由于引物设计和实验体系的选取，最低可检测到24.6fg/ml的模板量，且成本低廉，能够快速实现对ASFV的特异性和敏感性检测。

附图说明

图1ASFVP72蛋白全基因序列比对结果。

图2ASFV PCR最佳退火温度，M代表DL-2000Marker，第1-8泳道分别代表52-59℃时PCR扩增结果，第9泳道为阴性对照。

图3ASFV PCR反应的特异性，M代表DL-2000Marker，第1-4泳道分别为以ASFV P72质粒、CSFV、PRRSV的cDNA和PCV2的DNA为模板的扩增结果。

图4ASFV PCR反应的敏感性试验，M代表DL-2000Marker，第1泳道为阳性对照，第2泳道为阴性对照，第3-10泳道为ASFV P72质粒10^-1-10^-8倍稀释作为模板的扩增结果。

图5ASFV PCR反应的重复性试验，M代表DL-2000Marker，第1-4泳道为PCR扩增结果。

图6临床病料检测，M代表DL-2000Marker，第1泳道为阳性对照，第2-15泳道为以来自14个猪场的疑似病料为样品的PCR扩增结果。

图7为建立一种快速敏感检测非洲猪瘟的PCR方法及寡核苷酸引物对的

具体实施步骤。

具体实施方式

实施例：

1材料

1.1ASFV P72质粒

利用常规PCR技术，根据GeneBank公布的非洲猪瘟病毒P72基因的核苷酸序列，扩增出ASFV P72全长基因，插入pcDNA3.1载体中。

1.2组织病料的来源及处理

猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)，均由哈尔滨维科生物技术开发公司购买。

采集临床样本来自14个猪场中患有繁殖障碍母猪或具有呼吸障碍症状的仔猪和流产胎儿。

对临床组织病料进行无菌处理：剪取组织病料2.0g～4.0g，加少量灭菌PBS(含青霉素、链霉素)，剪碎，用无菌研磨器研磨至糊状，再按1∶4的体积比用PBS稀释成悬液，经上述处理后的样品分管置于-70℃冻存备用。

1.3试剂与仪器

DNAzol Regent、TRIzolReagent RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen Corporation；质粒提取试剂盒、Gold view购自上海赛百盛基因技术有限公司；dNTPs、rTaq DNA ploymerase、Rnase-Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、10×PCR Buffer、6×Loading Buffer、DNA Marker（DL-1000）、DNA Marker（DL-2000）均购自大连宝生物工程技术有限公司；TRIzol

Reagent RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen Corporation；Agarose琼脂糖购自上海TiYo公司；氯仿、异丙醇、75%乙醇、琼脂粉、酵母提取物（Yeast extract）、蛋白胨（Typtone）、PBS缓冲液、TAE缓冲液等试剂均为进口或国产分析纯。

超净工作台、台式高速冷冻离心机、PCR扩增仪（Alpha Unit Black Assembly PCR、PTC-200）、高速离心机（长沙市湘仪离心机有限公司、H2050R-1）、掌上离心机（Sigma公司）、42℃可调恒温水浴锅、微波炉、低温冰箱、超低温冰箱、电子天平（万分位）、DYY-Ⅲ-7型、DYY-Ⅲ-8B核酸电泳仪、紫外凝胶成像系统（美国GeneGenius UVP型）。

2方法

2.1菌种复苏，提取质粒

将在-20℃甘油保存的ASFV P72菌液用移液枪吸取30微升分别接种到装有3mL含氨苄的LB的试管中，摇菌过夜。按照质粒提取试剂盒操作步骤提取质粒，-20℃备用

2.2CSFV、PRRSV的RNA提取及cDNA的制备

取1.5ml离心管置于离心管架上，加入250μL组织液；加入TRIzol750μL轻轻混匀常温下静置5min；加入200μL氯仿震荡至充分乳化均匀，放在4℃冰箱，静置12min；12000转离心15min；取上清液500μL，加入等量的异丙醇，颠倒混匀，放置-20℃冰箱中过夜（-70℃冰箱中半小时）；离心12000转15min，弃上清液；加入75%乙醇（DEPC配置）1000μL，离心5min，弃上清液，晾干20min；加入20μL灭菌水溶解，-20℃保存备用。反转录体系如下。42℃水浴1h，70℃5min灭活反转录酶。

2.3PCV2的DNA提取

取1.5ml离心管置于离心管架上，加入250μL组织液；加DNAiso750μL，轻摇混匀，常温下静置置3min；12000转离心10min，取800μL于新的EP管中；加500μL无水乙醇，颠倒混匀，常温下静置5min，7500转离心5min；弃上清液；用1000μL75%的乙醇，颠倒混匀，12000转离心3min，弃上清液；晾干20min；用20μL灭菌水溶解，-20℃保存备用。

2.4引物的设计与合成

参照GenBank收录的23株ASFVP72蛋白全基因序列，通过DNAStar软件中的MegLign比对，选择保守区域为引物设计区（部分比对结果参见图1）。参照ASFV的经典毒株BA71V株的核酸序列，通过Prime5软件设计一对特异性引物，预期PCR产物长度为347bp。引物由上海赛百盛基因技术公司合成，用ddH₂O按20pmol/μL稀释后，置-20℃冻存。序列如下见表1-1：

表1引物名称、序列、扩增长度

其中，ASFV-F代表正向引物，ASFV-R代表反向引物。

2.5针对ASFV的PCR检测方法的建立

2.5.1针对ASFV的PCR的初步反应体系及条件的优化

根据设计的引物，探索最佳退火温度，进行初步的PCR反应。依据已经优化的PCR反应条件：总体积为25μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)2μL，上下游引物各0.5μL，TaKaRa Taq0.25μL，灭菌双蒸水17.25μL，ASFV P72质粒DNA模板2μL。验证该PCR反应的最佳退火温度。

表2PCR扩增条件

2.5.2针对ASFV PCR反应的特异性试验

按已优化的PCR反应的最佳条件，对ASFV、CSFV、PRRSV的cDNA和PCV2的DNA样品进行试验，验证该PCR检测方法的特异性。

2.5.3针对ASFV PCR反应的敏感性试验

应用紫外分光光度计对ASFV P72质粒浓度进行测定，浓度为24.6ng/ml，分别进行10倍系列稀释，即10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、 10^-8等8个梯度，按已优化的PCR反应的最佳条件进行PCR扩增，以确定最小检测量。

2.5.4针对ASFV PCR反应的重复性试验

按已优化的PCR的最佳反应条件进行PCR扩增，试验重复三次，以验证结果的可靠性。

2.5.5临床样品的检测

将来自14个猪场中患有繁殖障碍母猪或具有呼吸障碍症状的仔猪和流产胎儿的临床样本进行PCR方法检测。

3结果与分析

3.1ASFV的PCR检测方法的最终反应条件的确定

PCR最佳反应体系：总体积为25μL，10×PCR Buffer2.5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)2μL，TaKaRa rTaq0.25μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水17.25μL。

采用建立的针对ASFV P72质粒单项PCR反应体系，进行PCR最佳扩增退火温度的探索，结果表明55℃为最佳退火温度（图2）。PCR最佳反应条件：95℃5min；94℃30s，55℃40s，72℃1min，循环35次；72℃延伸10min。扩增的PCR目的片段大小为347bp。

3.2ASFV的PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验结果

对ASFV、CSFV、PRRSV的cDNA和PCV2的DNA模板进行PCR扩增，结果含有ASFV P72质粒的核酸样品成功地扩增出与试验设计相符合的347bp的目的片段，而其它核酸样品均没有条带出现(图3)。在上述优化条件下，该PCR方法最低能检测到经10^-6稀释的ASFV P72质粒（图4），检测最低模板含量为24.6fg/ml。按已优化的PCR反应的最佳条件进行PCR扩增，重复三次，结果在347bp处，均得到了清晰可见的目的条带（图5）。

3.3临床样品检测结果

对来自14个猪场中患有繁殖障碍母猪或具有呼吸障碍症状的仔猪和流产胎儿的临床样本进行PCR方法检测，均未出现阳性条带（图6）。

本试验成功建立了非洲猪瘟PCR检测方法，结果表明所建立的PCR方法能敏感、快速地检测非洲猪瘟病毒。根据上述研究结果，本研究所建立的PCR检测方法具有很好的应用性,能够用于非洲猪瘟疫病的检测。

Claims

1.一种用于检测非洲猪瘟的PCR方法，其特征在于：该方法是针对GenBank上已发表的非洲猪瘟P72蛋白的基因序列，经过反复比对，选取其高度保守区域，设计合成引物，选取最佳退火温度和反应体系，针对非洲猪瘟病毒建立的PCR检测方法。

2.根据权利要求1所述的检测非洲猪瘟的PCR方法，其特征在于，参照GenBank收录的23株ASFVP72蛋白全基因序列，通过DNAStar软件中的MegLign比对，选择保守区域为引物设计区，参照ASFV的经典毒株BA71V株的核酸序列，通过Prime5软件设计一对特异性引物。

3.根据权利要求2所述的检测非洲猪瘟的PCR方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物对序列如下：

4.根据权利要求3所述的检测非洲猪瘟的PCR方法，其特征在于，PCR最佳反应条件：95℃5min；94℃30s，55℃40s，72℃1min，循环35次；72℃延伸10min。

5.一种用于非洲猪瘟检测的PCR寡核苷酸引物对，其序列如下：