CN101463395B

CN101463395B - 一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN101463395B
Application number: CN 200810241706
Authority: CN
Inventors: 刘湘涛; �田宏; 吴锦艳; 尚佑军; 尹双辉; 靳野
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2008-12-26
Filing date: 2008-12-26
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2028-12-26
Also published as: CN101463395A

Abstract

一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法，所述试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无RNA酶水、One Step RNA PCR混合液、阴性对照以及序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6引物的混合物，所述检测包括使用所述试剂盒进行RT-PCR扩增的步骤。所述方法能快速、敏感、准确以及低成本地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。

Description

一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法，更具体地涉及RT-PCR一步法检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome，PRRS)，亦称蓝耳病，是一种新的有高度传染性的猪病，主要表现为妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊胎以及产弱仔等繁殖障碍以及各年龄猪发生呼吸道症状，仔猪死亡率高，感染猪出现免疫抑制等现象。该病最早于1987年在美国和1990年在欧洲被发现以来，已传遍世界所有养猪国家，本病隐性感染率高，并呈周期性暴发。据统计，PRRS每年给美国养猪业造成的直接经济损失为5.6亿美元，而美国用于该病的防控研究经费高达6亿美元。因此，国内外许多知名专家和学者将该病称为对养猪业最具危害的两大杀手之一。国际兽疫局(OIE)将其列为需要通报的B类传染病，我国亦将其列为二类传染病。值得注意的是，自2006年5月份以来，我国从江西开始发病，后波及到浙江、江苏、安徽、湖南、山东、河南等许多省市，初步估算，到2007年初，我国发病地区生猪存栏量已锐减了近三分之一，造成了极大的经济损失，也给许多生猪养殖场(户)造成了毁灭性地打击。

国外和国内均已建立了RT-PCR检测方法。国外应用PCR诊断PRRSV已取得很大进展，许多学者根据PRRSV不同的ORF序列，设计了不同引物，建立了检测PRRSV核酸的RT-PCR方法。该方法直接从PAM分离培养物、临床样品(肺泡巨噬细胞、血清和血浆，肺脏组织以及精液等)中扩增出预期的片断，但该方法仅应用了一对引物，通过PCR扩增产生一个核苷酸片段。众所周知，RNA病毒具有高度变异能力，同时PRRSV是一种高度传染性的病毒，因此现有的检测方法不具有快速，敏感和准确的特点。因此需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格便宜的PRRSV检测试剂盒和检测方法，以弥补我国在PRRSV检测上的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动物。

发明内容

本发明要解决的技术问题是快速、敏感、准确以及低成本地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。

为解决上述问题，本发明提供了一组针对猪繁殖与呼吸综合症病毒的引物，所述引物包括：

第一对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：1；

第一对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：2；

第二对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：3，

第二对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：4；

第三对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：5，

第三对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：6；

或者上述序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6的向5’端和/或3’端延长的序列；

或者与上述序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6同源性大于85％的序列；

或者与上述序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6碱基互补的序列。

本发明还提供了一种用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无RNA酶水、One Step RNA PCR混合液、阴性对照以及序列SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：6引物的混合物。

其中所述One Step RNA PCR混合液包含PCR缓冲液、dNTP和Mg²⁺。

所述阴性对照为无RNA酶水空白对照。

所述阳性对照为为PRRSV HuN4细胞株的RNA，其浓度为0.25μg/mL。

所述RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL，AMV逆转录酶的浓度为5U/μL，Taq酶的浓度为5U/μL，引物的浓度为50pM/μL，One StepRNA PCR混合液中PCR缓冲液的浓度为10×，dNTP的浓度为10mM和Mg²⁺的浓度为25mM。

本发明还提供了用所述检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

a.提取样品总RNA；

b.使用本发明所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，其中条件如下：50℃反转录30分钟，94℃预变性2分钟，94℃40秒，退火温度57℃40秒，72℃50秒，30个循环后72℃延伸8分钟；

c.电泳；

d.结果分析，与DL 2000标准分子量对照，如果阳性对照出现490bp、345bp及228bp三条条带，样品扩增产物出现228bp、345bp以及490bp中的任何一条条带，而阴性对照无扩增条带，则可判定该样品为阳性。

所述样品可以是待测猪的肺泡巨噬细胞、血清和血浆、肺脏组织以及精液。

本发明在检测过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间由原来的4-5小时缩短到现在的2-3小时，从而有利于快速检测。同时本发明使用了三对引物，从而使该方法与普通的PCR方法相比具有更高的敏感性，有助于PRRSV的防控和隐形带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。所述方法适用于任何实验室和基层单位，例如我国各级防控单位、基层兽医站和大中小型养殖场等。

附图说明

附图1为待测样品PCR产物的电泳结果图。

具体实施方式

引物的设计和制备

参照GenBank查找多个毒株，进行序列比对，根据比对结果设计相对保守的三对特异引物，引物序列如下：

490bp条带的引物序列为：

上游引物CCCCGCCAACCCCGAGAATAG(SEQ ID NO：1)

下游引物AATCCCAAAGCGTGCCATCAATCC(SEQ ID NO：2)

345bp条带的引物序列为：

上游引物为AGCCAGCCTTCGCCCTATCCAT(SEQ ID NO：3)

下游引物为GAAACCCCGACCACCGCAACT(SEQ ID NO：4)

228bp条带的引物序列为：

上游引物为CCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGT(SEQ ID NO：5)

下游引物为GGCTTCTCCGGGTTTTTCTTCCTA(SEQ ID NO：6)

上述引物由大连宝生物工程有限公司合成。

阳性对照

本发明试剂盒的阳性对照是PRRSV HuN细胞株的RNA。从患高热病猪体内分离得到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HuN株)，按照常规方法提取其RNA，浓度为0.25μg/mL。

样品1的制备

(1)从待测猪身上取下肺脏组织，加上一定量TRIzol进行研磨，取500μL组织样品研磨上清液置于1.5mL eppendorf管中，加入500μL三氯甲烷，快速振荡数秒，8000转/分和4℃离心5分钟。

(2)取上清液200μL置于1.5mL eppendorf管中，加入1000μLTRIzol，反复混匀，冰上放置5分钟。

(3)加200μL三氯甲烷，小心盖上盖子，用力振摇15秒，室温放置5分钟。

(4)12000转/分和4℃离心15分钟，分为三层。

(5)将上层水相转移至另一eppendorf管中，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置15分钟，加6μL核酸助沉剂。

(6)12000转/分和4℃离心10分钟，在eppendorf管底部可见胶样RNA沉淀。

(7)弃去上清，用1000μL75％乙醇(使用前用无RNA酶水配制，-20℃预冷)漂洗沉淀两次，10000转/分和4℃离心5分钟。

(8)室温充分干燥RNA沉淀。加10μL无RNA酶水，即可用于PCR扩增。其余RNA沉淀-20℃保存备用。

样品2的制备

从待测猪的全血中制备样品2，操作步骤基本同样品1的制备，只是不对全血进行处理而直接从步骤(2)开始相关操作。

样品3的制备

从待测猪的血清中制备样品3，操作步骤基本同样品1的制备，只是不对血清进行处理而直接从步骤(2)开始相关操作。

本发明试剂盒

本发明试剂盒由以下组分组成：

a.One Step RNA PCR混合液，浓度为10×

b.RNA酶抑制剂，浓度为40U/μL

c.AMV，浓度为5U/μL

d.Taq酶，浓度为5U/μL

e.三对引物，各自浓度均为50Pm/μL

f.无RNA酶水

g.阳性对照，浓度为0.25μg/mL

用本发明试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合症病毒

PCR反应总体系为25μL。分别将本发明试剂盒中(1)One StepRNA PCR混合液：10μL；(2)RNA酶抑制剂0.5μL；(3)AMV 0.5μL；(4)Taq酶0.5μL；(5)三对引物1.5μL；(6)无RNA酶水7μL，加入到5根0.2mL扩增管中，

然后分别向扩增管1、扩增管2、扩增管3、扩增管4和扩增管5中加入阳性对照5μL、样品1的RNA模板5μL、样品2的RNA模板5μL、样品3的RNA模板5μL和无RNA酶水空白对照5μL。混匀，高速离心5-30秒。将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃40s，退火温度57℃40s，72℃50s，30个循环后72℃延伸8分钟。

称取1.5g琼脂糖，加入100mL 1×TAE缓冲液中，加热融化，加入5μL(100mg/mL)溴化乙锭，混匀，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为约5mm。依据样品数选用适宜的梳子，待凝胶冷却后拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。

分别取5μL上文所得PCR扩增产物和2μL缓冲液，混匀，加入加样孔中。同时上样标准DNA Marker。

80V-100V电压或40mA-50mA电流电泳15min-25min。

取出凝胶板置于紫外透射仪上，打开紫外灯观察并拍摄照片，结果见图1，其中泳道1为阳性对照、泳道2、泳道3和泳道4分别为样品1、样品2和样品3，泳道5为空白对照，泳道M为DL2000Marker。

如图1所示，与DL 2000标准分子量对照可知，样品1、样品2和样品3的电泳结果出现了三条不同的条带，即490bp(序列见SEQID NO：7)、345bp(序列见SEQ ID NO：8)以及228bp(序列见SEQ IDNO：9)。样品1、样品2和样品3的DNA条带与阳性对照相符，同时空白对照无扩增条带，判定判样品1、样品2和样品3为阳性，即所述样品对应的待测猪包含猪繁殖与呼吸综合症病毒。

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种用于检测猪繁殖与呼吸综合症病毒的试剂盒和检测方法

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<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccccgccaac cccgagaata g 21

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aatcccaaag cgtgccatca atcc 24

<210>3

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<212>DNA

<213>人工序列

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agccagcctt cgccctatcc at 22

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

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<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

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cccgggttga aaagcctcgt gt 22

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

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ggcttctccg ggtttttctt ccta 24

<210>7

<211>490

<212>DNA

<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒

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ccccgccaac cccgagaata gaagagctca gtgggaagcc gccaagcttt ccgtggagca 60

agcccttggc atgatgaacg tcgacggcga actaactgcc aaagaactgg agaaactgaa 120

aagaataatt gacaaactcc agggcctgac taaggagcag tgtttaaact gctagccgca 180

agcggcttga cccgctgtgg tcgcggcggc ttagttgtta ctgagacagc ggtaaaaata 240

gtcaaatttc acaaccggac cttcacccta ggacctgtga acttaaaagt ggccagtgag 300

gttgagctaa aagacgcggt tgagcacaac caacatccgg ttgccagacc ggttgatggt 360

ggtgttgtgc tcctgcgctc tgcagttcct tcgcttatag atgtcttgat ctccggcgct 420

gatgcatctc ctaagttact cgcccgccac gggccgggaa acactgggat tgatggcacg 480

ctttgggatt 490

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<212>DNA

<213>猪繁殖与呼吸综合症病毒

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gggcccctcg gtgtttttag gcacccctgg ggttgtgtca tactatctca caaaatttgt 120

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tccgcgcttc cttcccaagg aatcagttgc ggtggtcggg gtttc 345

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aggcaaggga ccggggaaga aaaataggaa gaaaaacccg gagaagcc 228

Claims

1.一组针对猪繁殖与呼吸综合症病毒的引物，其特征在于，所述引物包括：

第一对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：1；

第一对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：2；

第二对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：3，

第二对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：4；

第三对的上游引物，其序列为SEQ ID NO：5，

第三对的下游引物，其序列为SEQ ID NO：6；

2.一种用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无RNA酶水、One Step RNAPCR混合液、阴性对照以及序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6引物的混合物。

3.权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述One Step RNA PCR混合液包含PCR缓冲液、dNTP和Mg²⁺。

4.权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无RNA酶水空白对照。

5.权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为PRRSVHuN4细胞株的RNA，浓度为0.25μg/mL。

6.权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述RNA酶抑制剂的浓度为40U/μL，AMV逆转录酶的浓度为5U/μL，Taq酶的浓度为5U/μL，引物的浓度为50pM/μL，One Step RNA PCR混合液中PCR缓冲液的浓度为10×，dNTP的浓度为10mM和Mg²⁺的浓度为25mM。