CN103131797A

CN103131797A - 一种博卡病毒实时荧光pcr检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103131797A
Application number: CN2013100582489A
Authority: CN
Inventors: 石康; 王琳琳; 朱世新
Original assignee: HUBEI LANGDE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HUBEI LANGDE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-02-25
Filing date: 2013-02-25
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2033-02-25
Also published as: CN103131797B

Abstract

本发明属于基因检测领域，涉及一种博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒中包含有筛选获得的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，通过一步法实时荧光PCR可检测出的HBoV的最低浓度为1.0×10²copies/mL，这说明本试剂盒的灵敏度和特异性非常高。通过本发明试剂盒实现了对痰液、咽拭子等样品中的博卡病毒的快速早期检测和定量分析。本发明检测周期短、效率高；检测病毒特异性强，准确率高；病毒定性分析的同时还能定量分析；灵敏度比普通PCR和免疫学检测方法高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

一种博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及一种博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其应用。本发明的试剂盒中包含有筛选获得的一对寡核苷酸引物和一条寡核苷酸探针，通过一步法实时荧光PCR可检测出的HBoV的最低浓度为1.0×10²copies/mL，这说明本试剂盒的灵敏度和特异性非常高。

背景技术

博卡病毒(Bocavirus，BoV)是一个直径25nm的球形核衣壳为20面体对称的六角形病毒颗粒，为一单链线状DNA病毒。博卡病毒是由瑞典科学家Allander等于2005年运用分子病毒筛查方法，从呼吸道感染患儿鼻咽分泌物中进行病原检测，分离得到的一种新型的人类细小病毒，命名为人类博卡病毒(HBoV)。它属于细小病毒科，博卡病毒属。根据目前研究，BoV基因组由3个开放阅读框构成。2个主要开放阅读框分别编码非结构蛋白(NS1)和至少2个衣壳蛋白(VP1和VP2)，一个次要开放阅读框编码功能未知的非结构蛋白NP1。VP2蛋白是主要的衣壳蛋白，其片段虽较VP1蛋白短，但占全部衣壳蛋白的95％以上。HBoV的非结构蛋白NS1较为保守，而VP1和VP2较易发生突变。

HBoV是人类呼吸道感染常见而重要的病原体之一。在相关呼吸道疾病中，成年人多表现为上呼吸道感染，而小儿表现主要有肺炎、鼻炎、喉炎、支气管炎、毛细支气管炎、支气管哮喘等。HBoV感染多见于小于5岁的婴幼儿，高峰年龄在6月～2岁的婴幼儿。HBoV所致的呼吸道感染全年均可发生，Sloots等发现整个冬季均能检测到HBoV，而在初冬其感染较为盛行。目前HBoV病毒的传播途径仍未明确。HBoV多在呼吸道分泌物标本中被检出，因此与其他呼吸道病原体一样，打喷嚏、咳嗽和物理传播等通过空气传播的可能性很高。而在血清标本、粪便标本及尿液样本中均能检测到HBoV，故亦不能排除粪-口传播及血液传播的可能性。

发明内容

本试剂盒检测的基本原理是利用一对特异性的寡核苷酸引物和一条特异性寡聚核苷酸探针，在耐热DNA聚合酶、高品质的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）以及Mg²⁺等PCR反应缓冲液，通过荧光PCR扩增仪实现靶核苷酸的扩增，从而实现分别快速、高效、特异、实时定量检测博卡病毒寡核苷酸的目的。

为了高效、特异、灵敏的检测出博卡病毒，本发明在对GeneBank中所有的现有的博卡病毒基因序列进行生物信息学分析，找出了博卡病毒的特异性保守区，并对这个保守区域设计了多对引物、探针。通过对博卡病毒标准株的检测，筛选出灵敏度高、特异性好、且针对博卡病毒的一对引物（用于扩增博卡病毒靶多核苷酸）和一条探针，即：能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HBoV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HBoV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HBoV-P，其中荧光报告基团任选自FAM、TET、JOE、HEX、VIC；荧光猝灭基团任选自：TAMRA、DABCYL、BHQ。

其中：所述正向引物HBoV-F的序列为：CGYTGGATGCGNTTYCATGA（SEQ ID NO：1）；所述反向引物HBoV-R的序列为：CTTAGACGCCATCATCATTYAC（SEQ ID NO：2）；所述寡核苷酸探针HBoV-P的序列为：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA（SEQ ID NO：3），优选的，该寡核苷酸探针5’端连接有FAM(5’羧基荧光素)，3’端连接有TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明)；上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T。

所以本发明提供了一种用于检测博卡病毒的寡核苷酸组合物，所述组合物包含1)-4)中任一个：

1)寡核苷酸正向引物HBoV-F；2)寡核苷酸反向引物HBoV-R；3)寡核苷酸探针HBoV-P；4)1)-3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。本发明还提供了上述寡核苷酸组合物在制备检测博卡病毒的试剂中的应用，其中所述试剂为用于实时荧光PCR的试剂。

本发明的目的之一是提供一种博卡病毒的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包含1)～4)中任一个：1)能与博卡病毒双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HBoV-F；2)能与博卡病毒双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HBoV-R；3)能与博卡病毒靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HBoV-P；4)1)～3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

本发明的目的之一是提供一种博卡病毒的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：DNA提取试剂，PCR扩增反应液，DNA聚合酶，阴性质控品，阳性质控品，博卡病毒阳性标准品等。其中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶；所述PCR扩增反应液包含有能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HBoV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HBoV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HBoV-P中任意一种或一种以上的组合，所述的PCR扩增反应液还包含有dNTPs和PCR buffer。

其中：所述正向引物HBoV-F的序列为：CGYTGGATGCGNTTYCATGA（SEQ ID NO：1）；所述反向引物HBoV-R的序列为：CTTAGACGCCATCATCATTYAC（SEQ ID NO：2）；所述寡核苷酸探针HBoV-P的序列为：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA（SEQ ID NO：3），优选的，该寡核苷酸探针5’端连接有FAM(5’羧基荧光素)，3’端连接有TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明)；或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T。

本发明所提供的试剂盒还包含：（1）分别装有DNA提取剂、PCR扩增反应液、DNA聚合酶、阴性质控品、阳性质控品、博卡病毒阳性标准品的加盖密封的多个试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒中，正向引物浓度为0.5-1umol/L、反向引物的浓度为0.5-1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.25-0.5umol/L；优选为：正向引物浓度为1umol/L、反向引物的浓度为1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.5umol/L。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒中，Taq DNA聚合酶的浓度为1-8U/反应；优选为：Taq DNA聚合酶的浓度为5U/反应。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中Mg²⁺最佳浓度为2.0mmol/L，高品质的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）最佳浓度为0.1-0.25mmol/L，优选为0.2mmol/L。

根据本发明的一个优选实施方法是：所述的试剂盒的PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s，共30个循环。

根据本发明的一个优选实施方法是：使用所述的试剂盒时，检测样本选自口腔样品、含口腔样品的抽提液或培养上清液，如痰液、咽拭子等。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阴性质控品为生理盐水。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为HBoV体外扩增DNA。其中，建立HBoV体外扩增DNA的技术路线如下：使用HBoV特异性正、反向引物定性扩增病毒核酸，扩增产物纯化后克隆入pGEM-T载体中，阳性克隆经测序确定目的片段是否正确插入并确定插入方向。提取重组质粒pGEM-T-HBoV质粒进行酶切反应，割胶回收后得到其模板DNA。其中阳性质控品的浓度为10³copies/ml。

根据本发明的另一个优选实施方案，本发明试剂盒中定量参考品为10⁴-10⁷copies/mlHBoV体外扩增DNA。其中体外扩增步骤同上，体外扩增后的DNA用紫外分光光度计测定A260进行定量，根据定量结果，用灭菌处理的纯水将体外扩增的HBoV DNA稀释至10⁴-10⁷copies/ml作为本试剂盒中定量参考品。所有定量参考品与标本中提取的DNA同时进行扩增，荧光定量PCR仪会根据定量参考品绘制出标准曲线，并依此对检测标本中博卡病毒的感染量进行自动测定。

本发明所提供的检测样品中博卡病毒的试剂盒可以检测出的HBoV的最低浓度为1.0×10²copies/mL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明所提供的检测样品中博卡病毒的试剂盒是针对博卡病毒基因组保守基因片段设计特异引物和探针，可检测出博卡病毒，但不能检测出非博卡病毒病原体，如呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒等，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明所提供的检测样品中博卡病毒的试剂盒可以检测痰液、咽拭子等样本中的博卡病毒；可为灵敏、快速、特异早期诊断博卡病毒感染提供可靠的实验证据，并且能够准确定量，所以可对疗效进行有效检测。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：（1）同时检测待检测样本中博卡病毒感染型别和感染量，可真实的反映出患者体内病原体类型、拷贝数的高低和复制情况，有助于判断疾病，选择治疗方案及监测治疗效果；（2）与ELISA技术相比，具有更高的灵敏性，适用于痰液、咽拭子等多种样本的检测；（3）针对病毒特异性保守序列设计引物和探针，具有更高的特异性，避免了与其他如呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒等呼吸道感染病毒的交叉反应；（4）将PCR的敏感性与探针杂交的特异性相结合，在很大程度上改变了普通PCR的缺陷，降低了反应时间，简化了操作步骤；（5）闭管检测不需要PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染；实时的检测技术可以连续的检测PCR反应中荧光信号的变化，避免了普通PCR的“平台期效应”，而且模板的定量不通过终产物，而是有Ct值计算，准确性和灵敏性均有很大的提高。

附图说明

图1是HBoV病毒标准品扩增曲线；

图2是HBoV病毒标准品浓度标准曲线；

图3是4例HBoV阳性标本扩增曲线。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次或以上重复实验，结果取平均值。

实施例1：博卡病毒一步法实时荧光定量PCR试剂的研制

1、引物和探针的设计：通过对Genebank数据库中已有的博卡病毒核酸序列利用DNAman软件进行序列比对分析，以博卡病毒基因组NS1基因的保守片段为扩增靶位点，根据引物探针设计的基本原则，利用软件人工设计多对引物和探针。

2、样本的选择：根据国内外相关的文献报道表明，可以选择来自口腔的样品，如痰液、咽拭子等样品。

3、反应体系的建立与优化

样本的准备：以病毒鉴定为博卡病毒阳性的10份样品作为HBoV阳性参考品，分别为HBoV-1、HBoV-2、HBoV-3、HBoV-4、HBoV-5、HBoV-6、HBoV-7、HBoV-8、HBoV-9、HBoV-10；以病毒鉴定为阴性的10份非HBoV样本为阴性参考品，分别为3种病毒样品（呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、鼻病毒）以及7份正常的痰液和咽拭子样品。分别提取上述阳性参考品和阴性参考品的DNA，待用。

引物探针的筛选：用上述1中设计的多组引物和针分别检测上述的阳性参考品与阴性参考品的DNA，经反复多次试验，筛选出特异性好、灵敏度高和重复性好的最佳引物探针组合，如引物HBoV-F、HBoV-R及探针HBoV-P的组合。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的条件下，分别使用0.5umol/L至1umol/L的浓度梯度的引物和0.25umol/L至0.5umol/L的浓度梯度的探针进行PCR反应，经反复多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为1umol/L、探针浓度为0.5umol/L。

Taq DNA聚合酶用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从1U（酶单位）至8U浓度梯度的酶用量/反应，进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的Taq酶用量为5U/反应。

dNTPs度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs用量/反应，进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.2mmol/L。

反应温度、时间的优化：根据酶的活性和寡核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：94℃5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s共30个循环。

4、标本检测：以痰液、咽拭子等为作为待检标本，分别提取标本的DNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明：本发明试剂盒可以灵敏的检测出临床标本中的博卡病毒（HBoV）。

实施例2：博卡病毒一步法荧光实时定量PCR检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组分成分的试剂盒：DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品、博卡病毒阳性标准品（定量参考品）、灭菌处理的纯水。

2、标本的采集、运输及保存

2.1适用标本类型：痰液、咽拭子等。

2.2标本采集与前处理（注意无菌操作）

2.2.1痰液标本采集：以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开水漱口或用牙刷（不用牙膏）清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙（为减少口腔正常菌群污染标本），用力咳出呼吸道深部的痰（非后鼻部分泌物、非唾液），痰液直接吐入无菌痰杯中，标本量应≥1ml。对于痰量少或无痰或咳痰困难者可用雾化吸入加温至45℃的10％NaCl水溶液(痰液粘稠难咳，阻塞气道的，需要用α-糜蛋白酶盐水溶液)，使痰液易于排出后咳痰。

2.2.2咽拭子标本采集：以无菌棉拭子或无菌棉拭子吸附无菌生理盐水，采集两侧腭弓、咽部或扁桃体粘膜上的分泌物，放入灭菌试管中，加盖送检。

2.3标本运输与保存：采集或处理的样本在4℃条件下保存应不超过48h；若需长期保存，须放置-80℃低温冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样本密封后，采用保温箱加冰密封，并尽快运送到实验室。

3、检测步骤

（1）DNA提取

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；

B、取30ul蛋白酶放入1.5ml离心管中；

C、将标本（如痰液等）取200ul加入此管中，充分混匀；

D、再在每管分别加入200ul漂洗液（含30μg/ml carrier RNA），混匀振荡30s，70℃温育10min；

E、加入250ul无水乙醇，充分混匀振荡30s，室温裂解5min；

F、将上述裂解液加入离心柱中，8000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤C剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心后弃离心液；

G、滤柱中加入500ul缓冲液1，12000rpm，离心1min，弃收集管中的离心液；

H、另取一支干净的2ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500ul缓冲液2，12000rpm，离心1min，重复步骤H一次；

I、将滤柱移到一个干净的收集管中，12000rpm，离心3min，后将滤柱放在37℃15min以干燥滤膜；

J、将滤柱放在1.5ml Eppendorf管上，向滤柱中加入50ul灭菌处理的纯水，室温静置2min。12000rpm，离心2min，收集离心液即为提取的核酸。

可以直接用于检测，也可保存于-80℃低温冰箱备用。

（2）PCR反应与结果分析、判定

分别取阴性质控品、阳性质控品、定量参考品、待测标本各3ul，加入PCR反应管中进行PCR扩增反应。PCR扩增反应的条件为：94℃预变性5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s共30个循环。

结果分析：据定量参考品的扩增曲线设置Baseline的Start值、Stop值以及Threshold的Value值，使Std curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于-1.0～-0.97。最后在Analysis菜单中选择Analyze自动分析结果。

结果判定：阳性样本扩增曲线呈S型，所有阴性样本无扩增曲线出现，待测标本的HBoV检测结果有效，否则，结果为无效，需要重新检测，并根据标准品进行阳性样本定量检测，结果如图1-2。

实施例3：博卡病毒一步法荧光实时定量PCR检测试剂盒临床检测使用

用上述方法对另外疑似博卡病毒感染病人痰液标本42份进行检测，其中HBoV检测结果阳性4例，病毒荧光定量PCR扩增曲线见图3，根据这4例阳性结果的C_t值结合扩增曲线，由Roche LightCycler480分析软件自动分析得到这4例HBoV阳性标本的病毒浓度，具体结果见表1。

表14例HBoV阳性标本病毒浓度

样品编号	Ct值	HBoV病毒浓度（拷贝数/μl）
			样品1	23.34	2.02×10²
样品2	22.28	2.05×10²
			样品3	26.46	3.18×10³
样品4	23.06	5.41×10²

序列表

SEQUENCE LIS TING

<110>湖北朗德医疗科技有限公司

<120>一种博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其应用

<130>2013

<160>3

<170>PatentIn versiOn3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>正向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>n is a，c，g，Or t

<400>1

cgytggatgc gnttycatga 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>反向引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>n is a，c，g，Or t

<400>2

cgytggatgc gnttycatga 20<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>寡核苷酸探针

<400>3

agatygcgrt cycctgtcca 20

Claims

1.一种博卡病毒的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：DNA提取试剂，PCR扩增反应液，DNA聚合酶，阴性质控品，阳性质控品，博卡病毒阳性标准品。

2.权利要求1所述的试剂盒，其中，所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。

3.权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述的PCR扩增反应液包含有能与双链靶多核苷酸的第一条链特异性结合的寡核苷酸正向引物HBoV-F、能与双链靶多核苷酸的第二条链特异性结合的寡核苷酸反向引物HBoV-R、能与靶多核苷酸特异性结合并且两末端分别结合有荧光报告集团和荧光猝灭集团的寡核苷酸探针HBoV-P中任意一种或一种以上的组合。

4.权利要求3所述的试剂盒，其中：

所述正向引物HBoV-F的序列为：CGYTGGATGCGNTTYCATGA；

所述反向引物HBoV-R的序列为：CTTAGACGCCATCATCATTYAC；

所述寡核苷酸探针HBoV-P的序列为：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA；

或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合；

上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T。

5.权利要求1-4任一所述的试剂盒，其中，所述的PCR扩增反应液还包含有dNTPs和PCR buffer。

6.根据权利要求3-5任一所述的试剂盒，其中，正向引物浓度为0.5-1umol/L、反向引物的浓度为0.5-1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.25-0.5umol/L。

7.根据权利要求3-6任一所述的试剂盒，其中，正向引物浓度为1umol/L、反向引物的浓度为1umol/L、寡核苷酸探针的浓度为0.5umol/L。

8.根据权利要求2-7任一所述的试剂盒，其中，Taq DNA聚合酶的浓度为1-8U/反应。

9.根据权利要求2-8任一所述的试剂盒，其中，Taq DNA聚合酶的浓度为5U/反应。

10.根据权利要求5-9任一所述的试剂盒，其中，PCR扩增反应液中的dNTPs的浓度为0.1-0.25mmol/L/反应。

11.根据权利要求5-10任一所述的试剂盒，其中，PCR扩增反应液中的dNTPs的浓度为0.2mmol/L/反应。

12.根据权利要求1-11任一所述的试剂盒，其中，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；PCR反应条件为94℃5min；94℃10s，60℃30s，72℃1s，共30个循环。

13.根据权利要求1-12任一所述的试剂盒，其特征还在于：检测样本选自口腔样品、含口腔样品的抽提液或培养上清液。

14.一种用于检测博卡病毒的寡核苷酸组合物，所述组合物包含1)-4)中任一个：

1)寡核苷酸正向引物HBoV-F，其序列为：CGYTGGATGCGNTTYCATGA；

2)寡核苷酸反向引物HBoV-R，其序列为：CTTAGACGCCATCATCATTYAC；

3)寡核苷酸探针HBoV-P，其序列为：AGATYGCGRTCYCCTGTCCA；

上述序列中，其中N代表A、T、G或C，R代表A或G，Y代表C或T。

4)1)-3)中一个或多个序列的组合，或包含有上述序列的向5’端和/或3’端延长的序列；或与上述序列同源性大于85％的序列；或上述序列的碱基互补序列；或使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

15.权利要求14所述的寡核苷酸组合物在制备检测博卡病毒的试剂中的应用。

16.权利要求15所述的应用，其中所述试剂为用于实时荧光PCR的试剂。