CN105385787A - 12种脑炎病毒核酸多重pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒及其应用，包括有用于扩增如下12种脑炎病毒特异基因位点的引物：JeV，HTLV1，WNV，HSV1，HSVII，HHV6，JCV，HTLV2，BBF，HCMV，EBV及VZV。本发明具有以下优点：本发明所述的试剂盒能够多重检测、灵敏度高且使用快捷方便。此外，本发明采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量大，试剂耗材成本低；可直接对脑炎病原体样本提取的核酸进行检测；对检测平台和人工技术水平要求低，能够在常规检测中广泛推广。

Description

12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于基因检测领域，涉及一种利用通用引物介导的多重PCR扩增方法检测12种脑炎病毒核酸的试剂盒及其应用。
背景技术
病毒性脑炎是由多种病毒引起的中枢神经系统感染性疾病，因一年四季均可发生，故又称为散发性脑炎，其发病率约为(3.5～7.4)/10万，近年来呈逐年上升趋势，病毒性脑炎多发于儿童，该病往往缺乏特异性临床表现，病情严重者脑实质严重受损，可导致神经系统后遗症，甚至死亡。目前认为，在脑脊液(Cerebrospinalfluids，CSF)中检出病毒、病毒核酸或病毒特异性抗体则可明确中枢神经系统病毒感染的病因。用分子生物学检测方法在CSF标本中检出病毒核酸，被认为是中枢神经系统病毒感染性疾病病因诊断的标准。
引起病毒性脑炎的病毒较多，目前已知国内外报道的就有高达100多种病毒可导致脑实质或脑膜炎症病变，并且不断发现新的病毒，脑炎发病率和发病人群有逐年增加的趋势。临床统计数据表明，约20％的病毒性脑炎是由DNA病毒感染所致，其余均由RNA病毒感染引起。引起病毒性脑炎的病毒主要有肠道病毒、疱疹病毒(HSV1、HSV2、HHV6、EB、VZV、HCMV)、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、JC病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV1、HTLV2)和伯氏疏螺旋体。
流行性乙型脑炎(Japaneseencephalitis)是由流行性乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus，JEV)，又称日本脑炎病毒，是RNA病毒，引起的以中枢神经系统损害为特征的一种急性传染病，是一种自然疫源性人兽共患病，是病毒性脑炎中的重要一员，致死率高达5％～35％，严重威胁人类的健康和生命安全。
西尼罗病毒(WNV)属于黄病毒科、黄病毒属的重要成员，是RNA病毒。人感染WNV后，通常表现为西尼罗热、西尼罗病毒性脑炎，极少数患者表现为严重的胰腺炎、肝炎、心肌炎等。大约有1/300～1/150的西尼罗病毒感染者发展为脑炎、脑膜脑炎，一般称为西尼罗病毒性脑炎，临床症状表现为发热、头痛、抽搐、意识障碍、脑膜刺激等。西尼罗病毒性脑炎病死率大约为3～15％，多为老年人或免疫力低下病人。
人T细胞白血病病毒(HTLV))是1980年美国人Gallo首先从皮肤型T细胞淋巴瘤患者体内发现的第一种人类逆转录病毒，按基因组学及血清学反应可分为1型(HTLV-I)和2型(HTLV-II)。该病毒为球型颗粒，内部由RNA核蛋白及围绕在外的20面体蛋白衣壳组成，最外层具有包膜结构，表面镶嵌有糖蛋白。目前全世界大约有1000到2000万人感染HTLV病毒，而在我国的北京、广西、江西、新疆、柳州、合肥和四川等10多个省市已发现了HTLV感染病例，同时某些沿海地区也出现了局部小规模流行。HTLV感染细胞主要通过细胞间感染的方式，游离病毒颗粒是没有感染能力的。HTLV感染细胞与未感染细胞建立突触，进而使病毒蛋白和RNA染色体组进入靶细胞。通过逆转录酶使病毒RNA逆转录为cDNA，同时这种前病毒DNA被整合到宿主细胞，最终引起成人T细胞白血病、热带痉挛性瘫痪及其他相关神经系统疾病。
伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)属于原核生物界螺旋体目、螺旋体科疏螺旋体属的一种，是一种单细胞疏松盘绕的左旋螺旋体。是由蜱虫传播的一种自然疫源性、人畜共患疾病，通过肩突硬蜱感染人体宿主，可引起多系统器官损害，游走性红斑、神经炎、关节炎、心肌炎等。伯氏疏螺旋体在细菌中是最复杂的一个，基因组包含950kb线性染色体，由不同的线性质粒和环形质粒组成。对于伯氏疏螺旋体的分子生物学检测主要是PCR方法，在大多数的研究中针对不同的基因序列设计引物，如ospA、ospC、16SrRNA等。
单纯性疱疹(HerpesSimplex)是一种由疱疹病毒所致的病毒性皮肤病。单纯疱疹病毒包括单纯疱疹病毒I型(HSVI)和单纯疱疹病毒II型(HSVII)，其中HSVI首要引起生殖器以外的皮肤、粘膜(口腔粘膜)和器官(脑)的感染；HSVII首要引起生殖器部位皮肤粘膜感染，通常认为与宫颈癌发生有关。
水痘－带状疱疹病毒(varicella-zostervirus，VZV)，在儿童初次感染引起水痘，恢复后病毒潜伏在体内，少数病人在成人后病毒再发而引起带状疱疹。多见于成年人和老年人。成人水痘症状较严重，常并发肺炎，死亡率较高。有免疫缺陷的儿童和无免疫力的新生儿感染水痘，病情凶险，可能是一种致死性感染。如孕妇患水痘除病情严重，可导致胎儿畸形、流产或死亡。
人巨细胞病毒(humancytomegalovirus)又称为涎病毒，是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞增大，所以叫做巨细胞病毒。
EB病毒(Epstein-Barr)是一种DNA病毒，呈球形，直径为180nm～200nm，在B淋巴细胞中复制，为95％以上的成人所携带。它是传染性单核细胞增多症的病原体，还与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切关系，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。
人疱疹病毒6型(HHV-6)原发感染后多无症状，少数可引起幼儿丘疹或婴儿玫瑰疹。常急性发病，先有高热(39℃数天)和上呼吸道感染症状，退热后颈部和躯干出现淡红色斑丘疹。此外，感染可导致中枢神经系统症状，包括癫痫、脑膜炎和大脑炎等。
JC病毒为小双链DNA病毒，在人群中广泛感染，只有一种血清型，可分为30多个基因型，JC病毒可垂直传播，也可通过呼吸道、消化道传播，严重免疫抑制患者感染JC病毒后可引起进行性多灶脑白质病。
在脑脊液(Cerebrospinalfluids，CSF)中检出病毒、病毒核酸或病毒特异性抗体则可明确中枢神经系统病毒感染的病因。病毒分离阳性为中枢神经系统病毒感染性疾病病原学诊断的标准，但费时、费力，且CSF中病毒含量低，分离的阳性率不高。急性期在CSF中检测到病毒的特异性IgM抗体，可作为早期诊断的依据，但CSF中IgM含量低，且不同病毒及其血清型需要选择相应的试剂盒，否则易漏诊。PCR的出现，极大的增加了检测手段的敏感性，用分子生物学检测方法在CSF标本中检出病毒核酸，被认为是中枢神经系统病毒感染性疾病病因诊断的金标准。但目前缺乏利用PCR方法检测CSF标本中病毒核酸的试剂盒，尤其缺乏利用多重PCR方法在一个反应管中同时检测CSF标本中多种病毒核酸的试剂盒。
多重PCR(MultiplexPCR，M-PCR)是指在同一个反应体系中，加入多对特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，即可同时在一个反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段，实现了一次性检测多种病原体的目的。然而，由于多重PCR是在同一PCR反应体系里加入多对引物以扩增多个DNA片段的PCR反应，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构，二聚体结构等，引物对和引物量越多，引物之间的相互作用越明显，从而影响PCR扩增效率，进而影响了多重PCR的广泛应用。
发明内容
本发明解决的技术问题：为了解决同一反应体系中的多对引物之间相互作用的问题，本发明采用了通用引物多重PCR扩增技术。通用引物多重PCR扩增是指在特异性引物的5’端添加一段与待测模板无任何扩增的寡核苷酸序列而进行的PCR扩增，5’端添加的寡核苷酸序列为通用引物，PCR扩增时嵌合引物浓度通常是通用引物的1/10，PCR扩增的最初几个循环中由嵌合引物的特异性序列进行扩增，富集核酸模板，随着PCR反应的进行，嵌合引物逐渐消耗，通用引物由于浓度较大发挥主要作用，余下循环中，所有的扩增均通过通用引物进行扩增，降低了普通多重PCR的扩增偏好性，使得低浓度的核酸模板得到有效扩增，且由于嵌合引物浓度较低，避免了引物间二级结构的影响。
鉴于此，本发明提供一种特异性强、灵敏度高、通量高的12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，用于检测脑炎病毒患者脑脊液或血液样本中的流行性乙型脑炎病毒(JeV)、人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV1)、西尼罗病毒(WNV)、单纯疱疹病毒I型(HSV1)、单纯疱疹病毒II型(HSVII)、人疱疹病毒VI型(HHV6)、JC病毒(JCV)、人类T淋巴细胞白血病病毒II型(HTLV2)、伯氏疏螺旋体(BBF)、人巨细胞病毒(HCMV)、EB病毒(EBV)及水痘带状疱疹病毒(VZV)，实现多重检测，且灵敏度高。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，包括用于扩增如下12种脑炎病毒特异基因位点的引物：JeV，HTLV1，WNV，HSV1，HSVII，HHV6，JCV，HTLV2，BBF，HCMV，EBV及VZV。
作为本发明的一种优选方案，所述引物是由通用引物和特异性引物组合而成的嵌合引物，即在特异性引物的5’端添加一段通用引物序列。
其中，特异性引物序列为：JeV，SEQIDNO.1～2；HTLV1，SEQIDNO.3～4；WNV，SEQIDNO.5～6；HSV1，SEQIDNO.7～8；HSVII，SEQIDNO.9～10；HHV6，SEQIDNO.11～12；JCV，SEQIDNO.13～14；HTLV2，SEQIDNO.15～16；BBF，SEQIDNO.17～18；HCMV，SEQIDNO.19～20；EBV，SEQIDNO.21～22；及VZV，SEQIDNO.23～24；通用引物序列为：SEQIDNO.25～26。检测靶标、引物序列及产物片段大小如表1所示：
表1检测靶标、引物序列及产物片段大小
作为本发明的一种优选技术方案，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为400nM～1μM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为20nM～100nM。
进一步的，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为800nM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为60nM。
含有上述引物的12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其组份为：表1中引物混合物、阳性对照、阴性对照、酶系、PCR反应缓冲液及DEPC水。其中，阳性对照为表1中所述的12种检测靶标的107copy/mLPMD19-T的克隆DNA，阴性对照为生理盐水。PCR反应缓冲液的组分为5×onestepRT-PCRBuffer、Mg2+和dNTPs的混合液。酶系的组分为热启动DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。
一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒的应用，所述试剂盒用于流行性乙型脑炎病毒、人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型、西尼罗病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人疱疹病毒VI型、JC病毒、人类T淋巴细胞白血病病毒II型、伯氏疏螺旋体、人巨细胞病毒、EB病毒及水痘带状疱疹病毒的检测。
作为本发明的一种优选技术方案，所述检测方法为多重PCR程序，具体如下：程序1，50℃、25min、1个循环；程序2，95℃、10min、1个循环；程序3，95℃、15s，56℃、30s，72℃、35s，10个循环；程序4，95℃、15s，65℃、35s，72℃、35s，10个循环；程序5，95℃、15s，48℃、30s，72℃、35s，20个循环；程序6，72℃、5min、1个循环；程序7，4℃保温。
进一步的，所述多重PCR程序是基于毛细管电泳技术，检测扩增产物。
基于毛细管电泳技术检测12种脑炎病毒核酸的具体方法如下：(1)制备12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒；(2)采集样本并提取核酸；(3)分别以样本提取的核酸、阴性对照及阳性对照为模板进行多重PCR扩增反应；(4)市售的毛细管电泳检测设备同时检测样本、阳性对照及阴性对照PCR产物。
其中，采集样本为脑脊液和血清样本，脑脊液样本采集按照常规标准方法抽取脑脊液0.5～1ml，加入无菌离心管，密闭送检；血清样本采集用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌收集管，室温条件下存放不超过4小时，待样本自行析出血清，或直接置于离心机中1600rpm离心5分钟分离血清，转移上清液至1.5mL灭菌离心管中备用。核酸样本的提取采用市售的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(如天根生化科技有限公司的产品、货号：DP312)在样本处理区按照说明书操作步骤提取核酸。
以提取的核酸样本、阴性对照及阳性对照为模板进行多重PCR扩增反应，反应体系为25μL，具体如下：酶系2.0μL，PCR反应缓冲液18.0μL，模板2-5μL，补DEPC水至25μL。所述酶系为含有反转录酶(200U/ul)、RNA酶抑制剂(80U/ul)、热启动TaqDNA聚合酶(5U/ul)的混合物；所述PCR反应缓冲液为含有5×onestepRT-PCRBuffer(Tris-HClpH8.5100mM、KCl500nM、MgCl215nM)、Mg2+(25mM)、dNTPs(25mM)及表1中引物组的混合液。
使用市售的毛细管电泳检测设备(如MOKOBIO的MP2000微流控芯片检测系统、Qiagen的QIAxcelAdvanced毛细管电泳系统等)分析PCR产物，将25μLPCR扩增产物直接在市售的毛细管电泳检测设备中按照实验操作说明进行操作，将设备分析样本的图谱与阳性对照的图谱进行比对，判断病毒种类。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)多重检测：本发明首次公开了12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，使用本试剂盒可一次性检测12种脑炎病毒，降低检测成本，节省检测时间，适合脑炎患者的常规检测和突发脑炎疫情的应急检测。
(2)灵敏度高：本发明公开的多重PCR扩增方法及引物浓度避免了现有技术中多重PCR程序中引物间相互作用和引物对模板的扩增偏好性，提高了多重PCR扩增通量和检测灵敏度，尤其适合对低浓度模板的扩增，且操作简单，临床检测特异性好，灵敏度与定量PCR相当，具有较强的临床应用推广价值。
(3)高灵敏高通量：本发明所提供的检测方法采用毛细管电泳技术进行检测，检测灵敏度较琼脂糖凝胶电泳高；通量大，可一次检测96个样本。
综上所述，本发明提供一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，并建立一种基于多重PCR平台的毛细管电泳检测方法。本发明采用特异性的引物序列，保证检测结果的可靠性；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量大，试剂耗材成本低；可直接对脑炎病原体样本提取的核酸进行检测；对检测平台和人工技术水平要求低，能够在常规检测中广泛推广。
附图说明
图1为阳性对照使用本试剂盒的实验结果。阳性对照结果显示了12个峰值大小的特征峰，从左到右分别为JEV(163bp)、HTLV1(193bp)、HSV1(204bp)、HHV-6(234bp)、HTLV2(258bp)、HCMV(283bp)、WNV(296bp)、BBF(321bp)、HSV2(377bp)、JCV(447bp)、EBV(542bp)、VZV(643bp)。
图2为1号临床样本使用本试剂盒的实验结果。结果显示该临床样本出现了645bp的特征峰，为VZV病毒。
图3为2号临床样本使用本试剂盒的实验结果。结果显示该临床样本出现了529bp的特征峰，为HCMV病毒。
图4为3号临床样本使用本试剂盒的实验结果。结果显示该临床样本出现了258bp的特征峰，为HSV1病毒。
图5为4号临床样本使用本试剂盒的实验结果。结果显示该临床样本出现了283bp的特征峰，为HSV2病毒。
图6为5号临床样本使用本试剂盒的实验结果。结果显示该临床样本出现了321bp的特征峰，为JCV病毒。
具体实施方式
实施例112种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒
该试剂盒由PCR反应缓冲液、酶系、阳性对照品、阴性对照品和DEPC水构成，所述酶系为含有反转录酶(200U/ul)、RNA酶抑制剂(80U/ul)、热启动TaqDNA聚合酶(5U/ul)的混合物；所述PCR反应缓冲液为含有5×onestepRT-PCRBuffer(Tris-HClpH8.5100mM、KCl500nM、MgCl215nM)、Mg2+(25mM)、dNTPs(25mM)、12对嵌合引物和1对通用引物；；阳性对照由12种靶标的107copy/mLPMD19-T克隆DNA构成；阴性对照为生理盐水。
所述通用引物在扩增体系中的终浓度为800nM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为60nM。
该试剂盒的反应体系为25ul，具体如下：酶系2.0μL，PCR反应缓冲液18.0μL，核酸模板2～5μL，补DEPC水至25μL。
实施例2试剂盒的操作和结果判定
(1)病毒基因组DNA的提取
采用天根生化科技有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(货号：DP312)在样本处理区按照说明书操作步骤提取脑脊液和血清标本的核酸。
(2)反应体系的配制
采用实施例1的试剂盒进行以下实验，待试剂盒PCR反应液在室温条件下完全溶解后，快速震荡混匀，25μLPCR反应体系为：PCR反应缓冲液18μL，酶系2μL，模板(包括样本提取的核酸、阴性对照及阳性对照)3μL，补DEPC水至25μL。
(3)PCR扩增
将PCR管放入普通PCR仪中，开启热盖后，按照如下要求设定PCR仪反应程序：程序1，50℃、25min、1个循环；程序2，95℃、10min、1个循环；程序3，95℃、15s，56℃、30s，72℃、35s，10个循环；程序4，95℃、15s，65℃、35s，72℃、35s，10个循环；程序5，95℃、15s，48℃、30s，72℃、35s，20个循环；程序6，72℃、5min、1个循环；程序7，4℃保温。
(4)MP2000微流控芯片检测系统同时分析样本、阴性对照和阳性对照的PCR产物。
(5)结果判读
本试剂盒的结果判读如表2所示；阳性对照结果如附图1所示，阴性对照结果无表2所示峰值大小的特征峰。
表2检测结果判断
实施例3试剂盒特异性实验
选取柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、人疱疹病毒7型、人细小病毒B19、多瘤病毒BK、流感病毒、腺病毒、埃可病毒8种病毒样本，采用实施例1所述的试剂盒按照实施例2所述方法进行操作和结果判定，以上8种病毒检测结果显示均无表2所示峰值大小的特征峰，表明本发明试剂盒特异性好。
实施例4试剂盒灵敏度检测
将自行制备的12种病毒检测靶标的质粒标准品浓度均为107copy/mL，分别梯度稀释到106copy/mL、105copy/mL、104copy/mL、103copy/mL、102copy/mL、101copy/mL，使用实施例1所述的试剂盒对上述稀释后的模板分别进行PCR扩增，根据实施例2中的结果判定标准进行判定，12种病毒检测灵敏度结果如表3所示：
表312种脑炎病毒核酸用本试剂盒检测灵敏度结果
病毒 106copy/mL 105copy/mL 104copy/mL 103copy/mL 102copy/mL 101copy/mL
JeV + + + + + －
HTLV1 + + + + + －
HSV1 + + + + + －
HHV-6 + + + + + －
HTLV2 + + + + + －
HCMV + + + + + －
WNV + + + + + －
BBF + + + + + －
HSV2 + + + + + －
JC + + + + + －
EB + + + + + －
VZV + + + + + －
从表3可见，实施例1所述试剂盒对以上12种病毒检测靶标的质粒标准品检测灵敏度为102copy/mL，因此，在模板浓度很低的情况下，本发明所述试剂盒仍能进行检测，具有很高的灵敏度。
实施例5：应用12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒检测临床样品
选取5份脑炎患者的临床样本作为待检样本，采用实施例1所述的试剂盒并按照实施例2所述方法进行操作和结果判定。5份临床样品的检测结果如附图2～附图6所示：5份临床标本分别出现了645bp、529bp、258bp、283bp、321bp的特征峰，其分别对应为VZV、HCMV、HSV1、HSV2、JCV阳性，这5份样本经测序确认均是正确的。
以上实施例并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本领域技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>南京美宁康诚生物科技有限公司北京美康基因科学股份有限公司
<120>12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒及其应用
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Claims (11)

1.一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增如下12种脑炎病毒特异基因位点的引物：JeV，HTLV1，WNV，HSV1，HSVII，HHV6，JCV，HTLV2，BBF，HCMV，EBV及VZV。
2.根据权利要求1所述一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物是在特异性引物的5’端添加一段通用引物序列组合而成的嵌合引物。
3.根据权利要求1所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物中，特异性引物序列为：JeV，SEQIDNO.1～2；HTLV1，SEQIDNO.3～4；WNV，SEQIDNO.5～6；HSV1，SEQIDNO.7～8；HSVII，SEQIDNO.9～10；HHV6，SEQIDNO.11～12；JCV，SEQIDNO.13～14；HTLV2，SEQIDNO.15～16；BBF，SEQIDNO.17～18；HCMV，SEQIDNO.19～20；EBV，SEQIDNO.21～22；及VZV，SEQIDNO.23～24；通用引物序列为：SEQIDNO.25～26。
4.根据权利要求1所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为400nM～1μM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为20nM～100nM。
5.根据权利要求4所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为800nM；所述嵌合引物在扩增体系中的终浓度为60nM。
6.根据权利要求1、2或5所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组份为：引物混合物、阳性对照、阴性对照、酶系、PCR反应缓冲液及DEPC水。
7.权利要求1、2或5所述的一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在检测流行性乙型脑炎病毒、人T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型、西尼罗病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人疱疹病毒VI型、JC病毒、人类T淋巴细胞白血病病毒II型、伯氏疏螺旋体、人巨细胞病毒、EB病毒及水痘带状疱疹病毒中的应用。
8.根据权利要求6所述一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述酶系为热启动DNA聚合酶、反转录酶和RNA酶抑制剂。
9.根据权利要求6所述一种12种脑炎病毒核酸多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应缓冲液为5×onestepRT-PCRBuffer、Mg2+、dNTPs的混合液。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测方法为多重PCR程序，具体如下：程序1，50℃、25min、1个循环；程序2，95℃、10min、1个循环；程序3，95℃、15s，56℃、30s，72℃、35s，10个循环；程序4，95℃、15s，65℃、35s，72℃、35s，10个循环；程序5，95℃、15s，48℃、30s，72℃、35s，20个循环；程序6，72℃、5min、1个循环；程序7，4℃保温。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述多重PCR程序是基于毛细管电泳技术，检测扩增产物。
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