CN102952893A - GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用 - Google Patents

GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102952893A
CN102952893A CN 201110242055 CN201110242055A CN102952893A CN 102952893 A CN102952893 A CN 102952893A CN 201110242055 CN201110242055 CN 201110242055 CN 201110242055 A CN201110242055 A CN 201110242055A CN 102952893 A CN102952893 A CN 102952893A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
encephalitis
viruses
primer
correlated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201110242055
Other languages
English (en)
Inventor
马学军
何玢
梁国栋
王环宇
秦萌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention filed Critical National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority to CN 201110242055 priority Critical patent/CN102952893A/zh
Publication of CN102952893A publication Critical patent/CN102952893A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构、哨点医院等用于病毒性脑炎病患标本的9种脑炎病毒(包括版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒)感染的同时检测和分型。具体在NCBI下载9种脑炎相关病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，设计多重特异性引物。进行单管多重(13重)PCR检测9种脑炎病毒保守区，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为脑炎病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为脑炎病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国脑炎症候群患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。

Description

GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用
发明领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于脑炎相关疾病患者血液及脑脊液标本的9种脑炎相关病毒(包括版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna病毒，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒，及云南环状病毒)感染的同时检测和分型。具体在NCBI下载9种脑炎病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，设计多重特异性引物。进行单管多重(13重)PCR检测9种脑炎病毒保守区，整个反应不到2个小时。本专利克服了病毒培养法、直接荧光抗体法、芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为脑炎病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为脑炎相关病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国脑炎症候群的病原谱和分子流行病学调查有重要意义。 
发明背景 
病毒性脑炎(virus encephalitis)是指由各种病毒感染所引起的脑实质炎症。其主要临床表现为：发热、头痛、意识障碍、抽搐和脑膜刺激症状等。目前报道全世界约有100余种病毒可以引起中枢神经系统感染。其中虫媒病毒包括乙型脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)及科萨努尔森林热病毒(KFDV)、西尼罗病毒(WNV)等；非虫媒病毒包括单纯疱疹病毒1型(HSV1)和2型(HSV2)、肠道病毒的柯萨奇病毒(COXV)、肠道病毒71型(EV-71)、风疹病毒，和其它病毒如朊病毒、登革热病毒等。 
目前病毒性脑炎的实验室诊断主要依靠病毒分离培养、血清学检测和分子生物学方法。病毒分离培养是诊断病毒性脑炎的金标准，但由于脑组织标本难收集，脑脊液中病毒含量低，因此阳性率很低，且耗时耗力。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒特异抗体是目前较常用的方法，其操作简单，敏感性和特异性高，但由于缺乏理想的诊断试剂因此只能对十余种病毒性脑炎做出实验室诊断。近几年，以PCR技术为基础的各种分子生物学诊断方法得到广泛应用和发展，其中包括SYBR Green I实时PCR及TaqMan PCR等，但基本都是用于单种病毒检测(如乙型脑炎病毒)而难以对未知病原感染病例做出准确诊断。本研究基于GeXP多基因遗传表达分析系统及多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)建立了一种多重检测方法，同时检测国内常见能引起病毒性脑炎的九种虫媒病毒：版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna病毒，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒，及云南环状病毒。 
发明内容
1.在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)下载上述9种脑炎相关病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，输入GeXP eXpress Profiler软件设计多重特异性引物(Specific-Primer，SP-Primer)。将设计的引物通过NCBI Primer-Blast，Primer Premier5.0分析评价，使各引物具有相对一致的Tm值。在全部正向引物和反向引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(Tag)，构成特异性嵌合引物。上游通用引物标签的5’端标记荧光染料Cy5(Cy5-Tag-F)。在整个引物体系中加入一对扩增人类RNase P基因的引物Rnasep(F/R)，以检验人源样品质量。引物信息见表1。 
2.建立了如下的检测过程，详见如下： 
(1)合成引物：引物均由上海Invitrogen公司合成，除Cy5-Tag-F采用HPLC纯化外，其余引物均PAGE纯化。 
(2)使用QIAamp Viral RNAMini Kit提取病毒RNA，洗脱体积为30μl，分装置于-80℃保存。 
(3)建立同时检测9种脑炎相关病毒的多重RT-PCR反应体系，并对其特异性和灵敏度进行验证。 
(4)用该13重RT-PCR检验临床标本，对体系进行验证评估。 
表1GeXP 13重RT-PCR检测9种脑炎相关病毒引物信息表 
Figure DEST_PATH_GSB00000725025100031
兼并碱基代码：M＝A/C R＝A/G W＝A/T S＝G/C Y＝C/T K＝G/T V＝A/G/C H＝A/C/T D＝A/G/T B＝G/C/T 
注：下划线表示的是上、下游通用引物序列(tag F、tag R) 
具体实施方式
实施方案1：单重RT-PCR验证引物 
分别用多株已知病毒核酸的单一感染阳性标本作为模板，阴性样品为阴性对照，重蒸水作为空白对照，进行单引物PCR反应。采用Qiagen公司One-step RT-PCR试剂盒。25μl PCR反应体系：5*buffer 5ul，dNTPMix 1ul，enzyme mix 1ul，上、下游嵌合引物(1μmol/L)各1.25μl，上、下游通用引物各(10μmol/L)各1.25μl，模板RNA 2μl，RNase抑制剂0.1ul，去RNase水补足至25μl。反应条件为：逆转录50℃30min；预变性95℃15min；特异性引物扩增95℃30s、55℃30s、72℃30s，10个循环；嵌合引物扩增95℃30s、68℃30s、72℃30s，10个循环；通用引物扩增95℃30s、53℃30s、72℃30s，20个循环。取2ul PCR产物进行GeXP system分析，确定各型特异引物扩增片段的实际检测大小。 
实施方案2：多重反应体系特异性验证 
配制多重混合引物(Mix-Primer)工作液，使RT-PCR体系中各SP-Primer终浓度为50nmol/L，其余成分与引物验证的相同。以多株已知病毒核酸的单一阳性标本作为模板，进行多引物PCR反应。 
实施方案3：多重检测体系单模板灵敏度试验 
以不含tag的特异性引物扩增靶核酸区域，PCR产物连接至pGEM-T载体进行单克隆，提取克隆质粒，Spe I酶切使之线性化，使用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录，RNeasy MinElute Cleanup Kit对体外转录的RNA片段纯化，利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计定量，根据分子量和核酸浓度计算RNA的拷贝数。体外转录RNA梯度稀释至106、105、104、102、101copies/μL，各取1μl作为模板，检测多重体系的灵敏度。非同日三次平行实验。 
实施方案4：多重检测体系多模板灵敏度试验 
根据多引物单模板灵敏度实验结果及扩增片段长度调整各对引物浓度，确定PCR体系中各对引物最佳引物浓度：嵌合引物浓度均为50nmol/L，通用引物(Cy5-Tag-F和Tag-R)各500nmol/L。将13种体外转录RNA等拷贝混合，并梯度稀释至105、104、103、102、101copies/μL，其余反应成分和反应程序不变，非同日三次重复。 
实施方案5：临床标本检测验证体系 
中国CDC脑炎室提供33份标本验证体系。标本均为蚊子碾磨液。提取病毒RNA进行单管13重RT-PCR，GeXP毛细管电泳检测。以病毒分离或测序结果作为金标准，验证体系。 
Figure ISA00000560699100021
Figure ISA00000560699100041
Figure ISA00000560699100051

Claims (5)

1.一种单管13重PCR同时检测9种脑炎相关病毒，包括：用于检测脑炎相关病毒版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒的型特异性引物。
2.权力要求1所述的13重PCR技术的引物和通用引物包括核酸序列表所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权力要求1所述的13重PCR检测技术包括脑炎相关病毒版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒。
4.权力要求1所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，哨点医院用于脑炎相关病毒版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒同时检测。
5.权力要求1所述的同时检测脑炎相关病毒版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒的多重PCR技术的反应程序和检测程序。
CN 201110242055 2011-08-23 2011-08-23 GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用 Pending CN102952893A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110242055 CN102952893A (zh) 2011-08-23 2011-08-23 GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110242055 CN102952893A (zh) 2011-08-23 2011-08-23 GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102952893A true CN102952893A (zh) 2013-03-06

Family

ID=47762274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110242055 Pending CN102952893A (zh) 2011-08-23 2011-08-23 GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102952893A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561370A (zh) * 2014-12-04 2015-04-29 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于版纳病毒荧光rt-pcr检测的引物探针组及其试剂盒
CN105385787A (zh) * 2015-12-04 2016-03-09 南京美宁康诚生物科技有限公司 12种脑炎病毒核酸多重pcr检测试剂盒及其应用
CN108950079A (zh) * 2018-08-08 2018-12-07 广东省疾病预防控制中心 三重荧光pcr测西藏环状病毒、云南环状病毒及萨斯乌瓦扎利环状病毒的引物探针组及试剂盒
CN109161611A (zh) * 2018-08-08 2019-01-08 广东省疾病预防控制中心 一种基于三重荧光pcr法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒
CN110066889A (zh) * 2019-05-21 2019-07-30 四川国际旅行卫生保健中心 同时检测四种黄热病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用
CN112779325A (zh) * 2021-02-04 2021-05-11 广西壮族自治区兽医研究所 同时鉴别β-内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561370A (zh) * 2014-12-04 2015-04-29 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于版纳病毒荧光rt-pcr检测的引物探针组及其试剂盒
CN104561370B (zh) * 2014-12-04 2016-11-09 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 用于版纳病毒荧光rt-pcr检测的引物探针组及其试剂盒
CN105385787A (zh) * 2015-12-04 2016-03-09 南京美宁康诚生物科技有限公司 12种脑炎病毒核酸多重pcr检测试剂盒及其应用
CN105385787B (zh) * 2015-12-04 2020-02-14 南京美宁康诚生物科技有限公司 12种脑炎病毒核酸多重pcr检测试剂盒及其应用
CN108950079A (zh) * 2018-08-08 2018-12-07 广东省疾病预防控制中心 三重荧光pcr测西藏环状病毒、云南环状病毒及萨斯乌瓦扎利环状病毒的引物探针组及试剂盒
CN109161611A (zh) * 2018-08-08 2019-01-08 广东省疾病预防控制中心 一种基于三重荧光pcr法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒
CN109161611B (zh) * 2018-08-08 2021-09-10 广东省疾病预防控制中心 一种基于三重荧光pcr法联合检测版纳病毒、卡地皮诺病毒及辽宁病毒的引物探针组及试剂盒
CN108950079B (zh) * 2018-08-08 2021-11-19 广东省疾病预防控制中心 三重荧光pcr测西藏环状病毒、云南环状病毒及萨斯乌瓦扎利环状病毒的引物探针组及试剂盒
CN110066889A (zh) * 2019-05-21 2019-07-30 四川国际旅行卫生保健中心 同时检测四种黄热病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用
CN110066889B (zh) * 2019-05-21 2023-11-24 四川国际旅行卫生保健中心 同时检测四种黄热病毒属病毒的GeXP的快速检测引物组、试剂盒及其应用
CN112779325A (zh) * 2021-02-04 2021-05-11 广西壮族自治区兽医研究所 同时鉴别β-内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组
CN112779325B (zh) * 2021-02-04 2022-12-06 广西壮族自治区兽医研究所 同时鉴别β-内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Park et al. Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assays targeting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
CN102839223B (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在16种常见呼吸道病毒分型检测中的应用
CN106947838B (zh) 非洲猪瘟病毒非结构基因实时荧光lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
Sun et al. Early diagnosis of novel SFTS bunyavirus infection by quantitative real-time RT-PCR assay
Cecilia et al. Development of a multiplex real-time RT-PCR assay for simultaneous detection of dengue and chikungunya viruses
CN102952893A (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用
Zheng et al. Reverse transcription recombinase-aided amplification assay with lateral flow dipstick assay for rapid detection of 2019 novel coronavirus
Kurosaki et al. Development and evaluation of a simple assay for Marburg virus detection using a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification method
CN103757139B (zh) 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法
Nie et al. Visual detection of human enterovirus 71 subgenotype C4 and Coxsackievirus A16 by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with the hydroxynaphthol blue dye
Xi et al. Rapid and visual detection of dengue virus using recombinase polymerase amplification method combined with lateral flow dipstick
Barros et al. Simultaneous detection of West Nile and Japanese encephalitis virus RNA by duplex TaqMan RT-PCR
CN103397105B (zh) 一种检测gii型诺如病毒的试剂盒及其用途
CN103614489A (zh) 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN105349697A (zh) 同时鉴别8种感染人不同亚型禽流感病毒HA基因的GeXP快速检测试剂盒及其应用
CN103981286A (zh) 鉴别8种猪病毒病的GeXP快速检测试剂盒及其引物组
Park et al. Loop-mediated isothermal amplification for the rapid detection of Chrysanthemum chlorotic mottle viroid (CChMVd)
Telwatte et al. Novel RT-ddPCR assays for simultaneous quantification of multiple noncoding and coding regions of SARS-CoV-2 RNA
Wang et al. A novel rapid detection of Senecavirus A using recombinase polymerase amplification (RPA) coupled with lateral flow (LF) dipstrip
CN102732639A (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用
CN102230023B (zh) 双重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及应用
CN105586438B (zh) 用于检测赤羽病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病毒的GeXP多重快速检测用引物和检测方法
CN103451320A (zh) 人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒
Yuan et al. Development of a reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification method for detection of rabbit hemorrhagic disease virus
McMenamy et al. Development of a minor groove binder assay for real-time one-step RT-PCR detection of swine vesicular disease virus

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20130306