CN102732639A - GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用 - Google Patents

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102732639A
CN102732639A CN 201110089404 CN201110089404A CN102732639A CN 102732639 A CN102732639 A CN 102732639A CN 201110089404 CN201110089404 CN 201110089404 CN 201110089404 A CN201110089404 A CN 201110089404A CN 102732639 A CN102732639 A CN 102732639A
Authority
CN
China
Prior art keywords
enterovirus
mouth disease
typing
hand
hev71
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 201110089404
Other languages
English (en)
Inventor
马学军
胡秀梅
许文波
张勇
聂凯
李瑾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention filed Critical National Institute for Viral Disease Control and Prevention Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority to CN 201110089404 priority Critical patent/CN102732639A/zh
Publication of CN102732639A publication Critical patent/CN102732639A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于手足口病患者咽拭子和粪便等标本的多种肠道病毒(包括HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB)感染的同时检测和分型。具体在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/下载各种血清型的人肠道病毒VP1区核苷酸序列和所有肠道病毒5’UTR保守片段，设计各个血清型特异性引物和肠道通用引物，进行单管多重(10重)PCR检测9种肠道病毒和所有肠道病毒5’UTR保守片段，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为肠道病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为手足口病相关肠道病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国手足口病患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。

Description

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用
发明领域
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于手足口病患者咽拭子和粪便等标本的多种肠道病毒(包括HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB)感染的同时检测和分型。具体在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/下载各种血清型的人肠道病毒VP1区核苷酸序列和所有肠道病毒5’UTR保守片段，设计各个血清型特异性引物和肠道通用引物，进行单管多重(10重)PCR检测9种肠道病毒和所有肠道病毒5’UTR保守片段，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为肠道病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为手足口病相关肠道病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国手足口病患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。
发明背景
手足口病(Hand-Foot-and-Mouth Disease，HFMD)是由一组人肠道病毒引起的，临床表现以发热和手、足、口腔和臀部等部位出现皮疹为主要临床特征的一种常见的急性传染病。少数病例可出现心肌炎、脑膜炎、脑炎、肺水肿、循环障碍等，个别重症患儿病情进展快，可导致死亡。引起HFMD的病原体主要为小核糖酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属的柯萨奇病毒A组(CoxsackievirusA，CVA)的2、4、5、6、7、8、10、16型，柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B，CVB)的1-5型，以及埃可病毒(Echovirus)1、4、5、6、7、9、11、13、19型和人肠道病毒71型(Human entervirus71，HEV71)。其中CVA16和HEV71为引起HFMD的主要致病病原体。
目前HFMD的实验室检测主要依赖于病毒分离培养、血清学实验和分子生物学实验。病毒分离培养是诊断肠道病毒感染的主要手段和金标准，但是操作步骤复杂，而且一些CVA难以分离，一般实验室没有条件进行这种试验。血清学实验以中和试验和酶联免疫法试验为主，操作步骤相对简单，但是缺点是试剂的质量不一，试验的重复性，以及非特异性的评价尚不完善。近年来，基于TaqMan技术的实时荧光定量-逆转录聚合酶链反应法已成为检测肠道病毒感染的最常用的实验室方法，该方法使用三对引物——肠道通用型引物、HEV71和CVA16特异性引物，分别检测人肠道病毒，HEV71和CVA16，但尚无快速检测HFMD其它病原体的分子生物学方法报道。为快速检测HFMD患者中的其它病原体或混合感染的病原体，以阐明我国HFMD患者的病原谱，本研究建立了基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重逆转录聚合酶链反应(Multiplex Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)体系同时快速检测常见的9种引起HFMD的人肠道病毒：HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5，并对该方法的特异性和敏感性进行了分析。
发明内容
1.查询已在我国疾病控制系统的网络实验室推广使用的肠道病毒通用引物Pan-enterovirus PE2/PE1和HEV71、CVA16的血清型特异性引物HEV71S/A、CoxA16S/A序列。并在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/下载其余7种血清型的人肠道病毒VP1区核苷酸序列，使用ClustalX软件进行多序列比对分析，选择各血清型肠道病毒VP1区相对保守区输入GeXP eXpress Profiler工具设计多重特异性引物(Specific-Primer，SP-Primer)，参考ClustalX比对结果，设置简并碱基。在正、反向特异性引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物标签(Tag)，构成特异性嵌合引物。上游通用引物标签的5’端标记荧光染料Cy5，即Cy5-Tag-F；下游通用引物标签(Tag-R)不标记荧光。引物信息如表1：
表1
表1GeXP多重RT-PCR检测9种手足口病相关的肠道病毒引物信息表
兼并碱基代码：M＝A/C R＝A/G W＝A/T S＝G/C Y＝C/T K＝G/T V＝A/G/C H＝A/C/T D＝A/G/T B＝G/C/T注：下划线表示的是上、下游通用引物序列
2.建立了如下的检测过程，详见如下：
(1)合成引物：特异性嵌合引物及下游通用引物标签(Tag-R)由上海Invitrogen公司合成，PAGE纯化；荧光染料Cy5标记的上游通用引物标签(Cy5-Tag-F)，由江苏硕世生物科技公司合成，HPLC纯化。
(2)将待测标本包括肠道病毒细胞培养物和手足口病患者粪便标本，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒RNA。
(3)建立同时检测9种肠道病毒的多重RT-PCR反应体系，并对其特异性和灵敏度进行验证。
具体实施方式
实施方案1：使用单重RT-PCR法验证引物
SP-Primer稀释至工作浓度1μmol/L，Cy5-Tag-F和Tag-R稀释至工作浓度10μmol/L。以已确定型别的细胞培养物RNA作为反应模板，按照One-Step RT-PCR Kit配制25μl反应体系，包括5μl 5×QIAGENOneStep RT-PCR Buffer，1μl dNTP Mix(containing 10mmol/L of each dNTP)，1μl RT-PCR Enzyme Mix，0.1μl RNase inhibitor，SP-PrimerF/R(1μmol/L)各取1.25μl(PCR体系终浓度50nmol/L)，Cy5-Tag-F和Tag-R(10μmol/L)各取1.25μl(PCR体系终浓度500nmol/L)，1μl模板RNA，nuclease-free water补足25μl.参考Temperature Switch PCR(TSP)原理设定RT-PCR反应条件：首先：50℃30min，95℃15min；然后：95℃30s，55℃30s，72℃30s，进行10个循环；其次：95℃30s，65℃30s，72℃30s，进行10个循环；最后：95℃30s，48℃30s，72℃30s，进行20个循环。取PCR产物分别进行GeXP system毛细管电泳分析[12]，确定各型特异引物扩增片段的实际检测大小。
实施方案2：Gexp多重反应体系特异性验证
配制多重混合引物(Mix-Primer)工作液，使RT-PCR体系中SP-Primer终浓度为50nmol/L，肠道通用引物PE2/PE1终浓度为25nmol/L，其余成分同单重RT-PCR。取HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5病毒细胞培养物和阳性粪便标本核酸，验证多重检测体系中各对引物的特异性。
实施方案3：多重检测体系单模板灵敏度试验
(1)细胞培养病毒HEV71和CVA16，各取140μl 105.5TCID50的细胞培养液提取病毒RNA，50μl洗脱，然后按104.5、103.5、102.5、101.5、100.5TCID50/μL梯度稀释，分别取1μl作为模板，检测多重体系的灵敏度。(2)以不含通用引物标签的特异性引物扩增的靶核酸区域，扩增后的PCR阳性产物连接到pGEM-T载体进行单克隆，提取克隆质粒，Spe I酶切使之线性化，使用RiboMAX TM Large ScaleRNA Production System-T7试剂盒进行体外转录，RNeasy MinElute Cleanup Kit对体外转录的RNA片段纯化，利用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计定量，根据分子量和核酸浓度计算RNA的拷贝数。体外转录RNA梯度稀释至105、104、102、10copies/μL，各取1μl作为模板，检测多重体系的灵敏度。
实施方案4：优化多重检测体系并对多引物多模板体系灵敏度分析
根据多引物单模板灵敏度实验结果及扩增片段长度调整各对引物浓度，确定PCR体系中各对引物最佳引物浓度：PE2/PE120nmol/L，EV71(S/A)50nmol/L，CoxA16(S/A)40nmol/L，CA4(F2，F3/R2)80nmol/L，CA5(F4/R4)50nmol/L，CA9(F2/R2)70nmol/L，CA10(F2/R2，R3)100nmol/L，CB1(F1/R1，F2/R2)30nmol/L，CB3(F2/R2)100nmol/L，CB5(F1/R1，F2/R2)40nmol/L，Cy5-Tag-F和Tag-R各500nmol/L。将10种体外转录RNA等浓度混合成模拟混合样品，并梯度稀释至105、104、103、102、10copies/μL，其余反应成分和反应程序不变，于非同日三次重复进行，每次设两个复孔，检测多引物多模板灵敏度。对10种靶基因分别取三次重复试验检测的荧光信号值，计算各基因变异系数CV。
Figure ISA00000470534000011

Claims (5)

1.一种用于同时检测手足口病相关肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5的多重PCR技术，其中包括：用于检测的各个血清型肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5型特异性引物和检测所有肠道病毒的通用引物。
2.权力要求1所述的多重PCR技术的引物和通用引物包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权力要求1所述的多重PCR检测技术包括手足口病相关肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5。
4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，哨点医院用于手足口病相关肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5同时检测和分型。
5.权力要求1所述的同时检测手足口病相关肠道病毒HEV71，CVA16，CVA4，CVA5，CVA9，CVA10，CVB1，CVB3和CVB5的多重PCR技术的反应程序和检测程序。
CN 201110089404 2011-04-11 2011-04-11 GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用 Pending CN102732639A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110089404 CN102732639A (zh) 2011-04-11 2011-04-11 GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201110089404 CN102732639A (zh) 2011-04-11 2011-04-11 GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102732639A true CN102732639A (zh) 2012-10-17

Family

ID=46988934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201110089404 Pending CN102732639A (zh) 2011-04-11 2011-04-11 GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102732639A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074437A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种指导铂类药物用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
CN103789450A (zh) * 2014-01-12 2014-05-14 浙江大学 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒
CN104846117A (zh) * 2015-04-18 2015-08-19 湖北创瑞生物科技有限公司 一种肠道病毒多重rt-pcr试剂盒
CN105112407A (zh) * 2015-08-03 2015-12-02 博奥生物集团有限公司 一种用于检测肠道病毒的试剂盒及其应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074437A (zh) * 2013-01-25 2013-05-01 海尔施生物医药股份有限公司 一种指导铂类药物用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
CN103074437B (zh) * 2013-01-25 2014-08-13 海尔施生物医药股份有限公司 一种指导铂类药物用药的多重基因检测试剂盒及其检测方法
CN103789450A (zh) * 2014-01-12 2014-05-14 浙江大学 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒
CN103789450B (zh) * 2014-01-12 2015-09-09 浙江大学 一种检测柯萨奇病毒a2、a5型的荧光定量试剂盒
CN104846117A (zh) * 2015-04-18 2015-08-19 湖北创瑞生物科技有限公司 一种肠道病毒多重rt-pcr试剂盒
CN105112407A (zh) * 2015-08-03 2015-12-02 博奥生物集团有限公司 一种用于检测肠道病毒的试剂盒及其应用
CN105112407B (zh) * 2015-08-03 2018-01-09 博奥生物集团有限公司 一种用于检测肠道病毒的试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102839223B (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在16种常见呼吸道病毒分型检测中的应用
Thai et al. Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus
CN105624330B (zh) 同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法
Corman et al. Performance and clinical validation of the RealStar® MERS-CoV Kit for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus RNA
Zheng et al. Reverse transcription recombinase-aided amplification assay with lateral flow dipstick assay for rapid detection of 2019 novel coronavirus
CN111394513B (zh) 新型冠状病毒SARS-CoV-2荧光定量PCR检测方法及其应用
Hou et al. Development of a recombinase polymerase amplification combined with lateral-flow dipstick assay for detection of bovine ephemeral fever virus
CN105567871A (zh) 快速检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的rt-rpa检测试剂盒及其用途
CN102943129B (zh) 一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针
Nie et al. Visual detection of human enterovirus 71 subgenotype C4 and Coxsackievirus A16 by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with the hydroxynaphthol blue dye
CN102965451B (zh) 一种a组轮状病毒实时等温扩增检测试剂盒及其引物和探针
Volle et al. Quantitative real-time RT-PCR assay for research studies on enterovirus infections in the central nervous system
Telwatte et al. Novel RT-ddPCR assays for simultaneous quantification of multiple noncoding and coding regions of SARS-CoV-2 RNA
CN103614489A (zh) 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
Wang et al. Real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus
CN106086236A (zh) 同时检测流感病毒h1、h3、h5、h7的试剂盒及方法
CN102952893A (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用
CN105349697A (zh) 同时鉴别8种感染人不同亚型禽流感病毒HA基因的GeXP快速检测试剂盒及其应用
Xiao et al. Simultaneous detection and differentiation of highly virulent and classical Chinese‐type isolation of PRRSV by Real‐Time RT‐PCR
CN102732639A (zh) GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用
Xi et al. Development of a reverse transcription recombinase polymerase amplification assay for rapid detection of human respiratory syncytial virus
CN105154584B (zh) 一种快速区分prrsv经典毒株和变异毒株的hrm非标记探针方法及其引物和探针
Chen et al. Development of a minor groove binder assay for real-time PCR detection of porcine Sapelovirus
Xia et al. Rapid detection of Banna virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)
CN112593011A (zh) 一组检测柯萨奇病毒b组的引物和探针

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20121017