CN102943129B - 一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针。所述多重连接探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：12所示。使用本发明所述的引物、探针，和/或包含该引物和探针的多重连接探针扩增检测试剂盒可同时检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒5种重要猪病病原，节约了检测时间和成本，有利于疫病的及时确诊。
Description
技术领域
本发明提供了一种用于检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针，可实现一次采样，一次分析，同时检测5种猪病的目的，属于检验检疫领域。
背景技术
猪流感病毒（SIV）、猪繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、口蹄疫病毒（FMDV）是引起猪呼吸道疾病、繁殖障碍和消化道疾病的主要常见病原，是危害养猪业最为严重的几种病原，被世界动物卫生组织规定为跨界传播病原，也是我国动物及动物产品国际贸易中重要的检疫对象。
目前，针对上述5种猪病病原建立了多种分子检测技术，如PCR和荧光PCR技术等，在这些疫病的诊断和防控中发挥了重要的作用。但目前所建立的方法多是针对一种病原的单独检测技术，在实际检测中需要重复多次完成检测不同病原的目的，检测工作量大且时间长，不能满足大批量动物检疫快速通关的实际需要。且难以实现现地样品中大量存在的混合感染以及症状相似疫病的鉴别诊断。在建立单独疫病检测技术的同时，各国兽医机构也相继研制了可同时检测猪常见病毒的多重PCR及多重荧光PCR，但传统PCR技术灵敏度低、结果不易判定等缺点限制了其在多重检测中的应用，而荧光PCR由于不同探针采用的荧光集团所发射的荧光存在相互干扰，且荧光PCR仪对不同波长荧光分辨的局限性也限制了荧光PCR多重检测技术的发展。
多重连接探针扩增技术（Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）由荷兰的Schouten博士首先发明，是一种操作简便、成本低廉的新型技术，目前在遗传疾病、基因甲基化分析等多个领域中得到了广泛应用。MLPA的原理是将核酸的杂交检测和PCR链式扩增相结合，从而实现靶分子的高效特异性分析。其核心技术是合成序列特异的长探针和短探针。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒特异性序列。长探针由三段核苷酸组成，除了PCR扩增的通用引物和病毒特异性序列外，在两者之间还加入特定大小的填充序列（指纹序列）。当MLPA的两种探针结合到彼此相邻的靶序列上的时候，在连接反应时，长探针就和短探针发生连接，生成一条两端分别含有上下游通用引物的全长探针，并在通用引物的扩增之下，使模板成链式放大，实现靶分子的高灵敏度检测，其检测极限可达3000-6000个靶分子拷贝。MLPA并不是扩增病毒特异的靶序列，而是扩增与病毒靶序列结合的探针，换句话说，首先是给每种病毒的长探针加入特定大小的指纹序列，然后通过通用引物将不同的“指纹”扩增表现出来，最后通过对“指纹”的分析，实现多种核酸的检测，同时序列特异的两段探针确保了每种病原的指纹具有高度的特异性。MLPA在扩增灵敏性、特异性等方面是对传统PCR方法的显著改进，同时其良好的多重性能，一次反应可以实现45种以上靶分子的检测，也突破了实时荧光PCR在多重性方面的“瓶颈”。
本研究利用多重连接探针扩增技术（MLPA）在核酸检测方面具有的特异、敏感，适合多重检测等优点，建立了SIV、PRRSV、PRV、TGEV、FMDV五种猪病病原的MLPA检测方法并组装成试剂盒，在国内外首次实现一次采样，一次分析，检测5种重要猪病的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成疫病的检测，为疾病防制争得时间。
发明内容
本发明的第一个目的是提供特异性强、灵敏度高的同时检测猪流感病毒（SIV）、猪繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和口蹄疫病毒（FMDV）的多重连接探针及一对通用引物。
本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的同时检测猪流感病毒（SIV）、猪繁殖与呼吸道综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病病毒（PRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和口蹄疫病毒（FMDV）的多重连接探针扩增检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在序列比对分析的基础上，针对猪流感病毒M基因、猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因、伪狂犬病病毒gB基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因、口蹄疫病毒3D基因，分别设计一对长探针和短探针（序列见表1），同时设计一对PCR扩增的通用引物（序列见表2）。短探针由两段核苷酸组成，一段是PCR扩增的通用引物，一段是病毒特异性序列；长探针由三段核苷酸组成，除了PCR扩增的通用引物和病毒特异性序列外，在两者之间还加入特定大小的填充序列；且位于右侧的探针5′端进行磷酸化处理。通过在上述5种病毒的长探针中加入不同长度的填充序列，然后通过病毒模板变性、探针杂交、连接及通用引物PCR扩增得到不同大小的PCR产物，通过毛细管电泳分析后实现对5种病毒的同时检测。
表1 猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒短探针和长探针名称和序列
其中，上述SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的5’端进行磷酸化处理；
表2.通用引物序列
| 名称 | 序列（5’-3’） | 序列表编号 |
| P1 | 5′GGGTTCCCTAAGGGTTGGA 3′ | SEQ ID No：11 |
| P2 | 5′GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA 3′ | SEQ ID No：12 |
注：胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）。
我们采用多重连接探针扩增技术建立了同时检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒的检测方法并组装了试剂盒。
检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒多重连接探针扩增检测试剂盒，由以下组分组成：
（1）MLPA缓冲液；
（2）探针混合物，其包括检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的长、短探针，所述探针的序列见表1，其中，所述SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的5’端进行磷酸化处理；本发明的一个实施方案中，每种探针的浓度为1μM，使用时各取0.8μL，加水至终体积600μL；
（3）连接反应液，其包括：Ligase-65缓冲液A和Ligase-65缓冲液B，在本发明的一个实施方案中，连接反应液的配方如表3所示；
表3 连接反应液配方
| 组分 | 体积 |
| Ligase-65缓冲液A | 120uL |
| Ligase-65缓冲液B | 120uL |
| DEPC水 | 1000uL |
（4）Ligase-65连接酶；
（5）PCR反应液，其包括如序列表SEQ ID NO:11至SEQ ID NO：12所示的通用引物；
（6）无RNA酶的灭菌纯化水；
（7）阴性对照：无核酸灭菌水；
（8）阳性对照：为猪流感病毒M基因、猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因、猪传染性胃肠炎病毒S基因、口蹄疫病毒3D基因的体外转录RNA和伪狂犬病毒gB基因的阳性重组质粒DNA的混合物。
猪流感病毒M基因体外转录RNA的制备：回收猪流感病毒A/swine/2003(H1N1)株M基因的RT-PCR扩增产物，长度为982bp，与pGEM-T载体(购自PromeGA公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-SIV-M。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到猪流感病毒M基因的体外转录RNA，命名为SIV-M-RNA；猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1)株M基因序列如序列表中SEQ ID NO：13所示。
猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因体外转录RNA的制备：回收猪繁殖与呼吸道综合征病毒JXA1株N基因的RT-PCR扩增产物，长度为369bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PRRSV-N。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因的体外转录RNA，命名为PRRSV-N-RNA；猪繁殖与呼吸道综合征病毒JXA1株N基因序列如序列表中SEQ ID NO：14所示。
伪狂犬病毒gB基因的阳性重组质粒的制备：回收伪狂犬病毒南阳株GB基因的PCR扩增产物，长度为2745bp，与pGEM-T载体(购自PromeGA公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得伪狂犬病毒gB基因的阳性重组质粒，命名为PRV-gB-DNA；伪狂犬病毒南阳株gB基因序列如序列表中SEQ ID NO：15所示。
猪传染性胃肠炎病毒S基因体外转录RNA的制备：回收猪传染性胃肠炎病毒purdue115国际标准株S基因的RT-PCR扩增产物，长度为2137bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-TGEV-S。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到猪传染性胃肠炎病毒S基因的体外转录RNA，命名为TGEV-S-RNA；猪传染性胃肠炎病毒S基因如序列表中SEQ ID NO：16所示。
口蹄疫病毒3D基因体外转录RNA制备：回收O型口蹄疫病毒3D基因的RT-PCR扩增产物，长度为1410bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-FMDV-S。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到口蹄疫病毒3D基因的体外转录RNA，命名为FMDV-3D-RNA；口蹄疫病毒3D基因序列如序列表中SEQ ID NO：17所示。
本发明还提供了一种检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒多重连接探针检测方法，包括如下步骤：
1）提取样品RNA/DNA；
用QIAGEN公司的RNA/DNA提取试剂盒，同时提取获得样品中的DNA和RNA；亦可采用现有技术中已知的提取试剂或自制试剂进行RNA和DNA提取；
2）RNA反转录成cDNA
用Promega公司的M-MLV反转录试剂盒，利用随机引物，将样品RNA反转录后获得cDNA；反转录反应体系（20μL）：5×RT-缓冲4μL，dNTP（2.5mM）4μL，M-MLV反转录酶（(200U/μL)1μL，反转录酶抑制剂(40U/μL)0.5μL)，随机引物(0.5μg/μL)1μL，样品RNA9.5μL。反应条件：25℃/10min 42℃/60min 95℃/5min 0℃/5min。
3）MLPA检测
①DNA变性
取n个0.2mLPCR反应管（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），做好标记；每管加入5μL制备好的DNA溶液，98℃变性5min，然后冷却到25℃。
②杂交反应
每个杂交反应需要1.5μL MLPA Buffer和1.5μL探针混合物，根据需要配制好杂交反应液，充分混匀后，吸取3μL加入2.2的PCR反应管中。
反应条件：95℃温育1min，60℃杂交16-20h，54℃温育。
③连接反应
每个连接反应需要31μL连接反应液和1μL Ligase-65连接酶，根据需要配制好杂交反应液，充分混匀后，吸取32μL加入2.2的PCR反应管中。
反应条件：54℃连接15min，98℃灭活5min，20℃停留。
④PCR反应
每个PCR反应需要9.5μL PCR反应液和0.5ul SALSA聚合酶，根据需要配制好PCR反应液，充分混匀后，吸取10μL加入2.2的PCR反应管中。
反应条件：95℃30seC，60℃30seC，72℃60seC，35个循环；72℃孵育20min，15℃停留。
⑤毛细管电泳仪凝胶电泳：
将PCR扩增产物置于毛细管电泳仪加样板上电泳，并以15-500bp标定Marker和25bp DNA Marker作为对照，观察电泳结果并记录。
5）结果描述及判定
①质控标准：
阳性对照在142bp、128bp、117bp、106bp、96bp处有特异性扩增条带。
阴性对照无特异性扩增条带。
如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效。
②结果判断：
阳性：在142bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪流感病毒；在128bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪传染性胃肠炎病毒。在117bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪繁殖与呼吸道综合征病毒；在106bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在口蹄疫病毒；在96bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在伪狂犬病病毒。必要时对MLPA扩增产物测序，进行确认试验。
阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无猪流感病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒。
本发明的优点是：1）多重性：可同时检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒5种重要猪病病原，节约了检测时间和成本，有利于疫病的及时确诊。2）灵敏：在实现多重检测的同时，确保了检测方法的敏感性，检测极限可达3000-6000拷贝靶分子。3）特异：MLPA中两条特异性的探针，保证了检测的特异性。只有当两条探针与靶序列完全杂交，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链，并进行PCR扩增；此外五种病毒中的任何一组探针，只能从其对应的病毒模板中扩增出预期大小的目的片段，对其余四种病毒均无扩增信号。4）通用性好：本发明中设计的五组探针，分别针对猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒最保守的基因设计，可以实现每种病毒不同亚型或血清型之间的通用检测。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒多重连接探针扩增毛细管电泳峰图
1：15bp标定marker，2：引物二聚体，3：伪狂犬病病毒96bp处特异性扩增峰，4：口蹄疫病毒106bp处特异性扩增峰，5：猪繁殖与呼吸道综合征病毒117bp处有特异性扩增峰，6：猪传染性胃肠炎病毒128bp处特异性扩增峰，7：猪流感病毒142bp处有特异性扩增峰，8：500bp标定marker。
图2分别以五种病毒为模板，用SIV探针进行MLPA检测结果毛细管电泳胶图
Lane 1和2：以SIV为模板，Lane 3、4、5和6：分别以PRV、FMDV、TGEV和PRRSV为模板，NC：无模板对照，Marker：25bp DNA marker。
图3分别以五种病毒为模板，用PRRSV探针进行MLPA检测结果毛细管电泳胶图
Lane 1和2：以PRRSV为模板，Lane 3、4、5和6：分别以SIV、PRV、FMDV和TGEV为模板，NC：无模板对照，Marker：25bp DNA marker。
图4分别以五种病毒为模板，用PRV探针进行MLPA检测结果毛细管电泳胶图
Lane 1和2：以PRV为模板，Lane 3、4、5和6：分别以SIV、FMDV、TGEV和PRRSV为模板，NC：无模板对照，Marker：25bp DNA marker。
图5分别以五种病毒为模板，用TGEV探针进行MLPA检测结果毛细管电泳胶图
Lane 1和2：以TGEV为模板，Lane 3、4、5和6：分别以SIV、PRV、FMDV和PRRSV为模板，NC：无模板对照，Marker：25bp DNA marker。
图6分别以五种病毒为模板，用FMDV探针进行MLPA检测结果毛细管电泳胶图
Lane 1和2：以FMDV为模板，Lane 3、4、5和6：分别以SIV、PRV、TGEV和PRRSV为模板，NC：无模板对照，Marker：25bp DNA marker。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1、试剂盒的配制和使用
1、试剂盒的配制组成，见表4。
表4 试剂盒配制组成
| 组成（30Tests/盒） | 数量 |
| MLPA缓冲液 | 600μL×1管 |
| 探针混合物 | 600μL×1管 |
| 连接反应液 | 1240μL×1管 |
| Ligase-65连接酶(5U/μL) | 115μL×1管 |
| PCR反应液(包括通用引物) | 750μL×1管 |
| SALSA聚合酶（5U/μL） | 65μL×1管 |
| DEPC水 | 1mL×3管 |
| 阴性对照 | 1mL×3管 |
| 阳性对照 | 1mL×3管 |
其中，MLPA缓冲液，购自The MRC-Holland公司，其包括KCl，Tris-HCl，EDTA和PEG-6000，pH 8.5。
探针混合物，其包括猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的长、短探针，每种探针的序列见表1，其中，所述SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的5’端进行磷酸化处理；每种探针的浓度为1uM，所述探针混合物的配制方法为：每种探针各取0.8μL，加水至终体积600μL；
连接反应液，其包括：Ligase-65缓冲液A和Ligase-65缓冲液B，均购自MRC-Holland公司；所述连接反应液的配方如表3所示；
PCR反应液，其包括如序列表SEQ ID NO:11至SEQ ID NO：12所示的通用引物P1和P2，所述PCR反应液可以根据现有技术公知的方法自行配制也可以通过购买获得，例如，购自The MRC-Holland公司的PCR反应液，其包括dNTPs、Tris-HCl、KCl、EDTA、BRIJ (0.04%)、通用引物P1和P2；
Ligase-65连接酶，购自MRC-Holland公司；
SALSA聚合酶5U/μL，购自MRC-Holland公司。
2、试剂盒的使用方法
2.1DNA/RNA提取
2.2RNA反转录成cDNA
用Promega公司的M-MLV反转录试剂盒，利用随机引物，将样品RNA反转录后获得cDNA；反转录反应体系（20μL）：5×RT-缓冲4μL，dNTP（2.5mM）4μL，M-MLV反转录酶（(200U/μL)1μL，反转录酶抑制剂(40U/μL)0.5μL)，随机引物(0.5μg/μL)1μL，样品RNA9.5μL。反应条件：25℃/10min 42℃/60min 95℃/5min 0℃/5min。
2.2MLPA检测
2.2.1DNA变性
取n个0.2mLPCR反应管（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），做好标记；每管加入5μL制备好的DNA溶液，98℃变性5min，然后冷却到25℃。
2.2.2杂交反应
每个杂交反应需要1.5μL MLPA Buffer和1.5μL探针混合物，根据需要配制好杂交反应液，充分混匀后，吸取3μL加入2.2的PCR反应管中。
反应条件：95℃温育1min，60℃杂交16-20h，54℃温育。
2.2.3连接反应
每个连接反应需要31μL连接反应液和1μL Ligase-65连接酶，根据需要配制好杂交反应液，充分混匀后，吸取32μL加入2.2的PCR反应管中。
反应条件：54℃连接15min，98℃灭活5min，20℃停留。
2.2.4PCR反应
每个PCR反应需要9.5μL PCR反应液和0.5ul SALSA聚合酶，根据需要配制好PCR反应液，充分混匀后，吸取10μL加入2.2的PCR反应管中。
反应条件：95℃30seC，60℃30seC，72℃60seC，35个循环；72℃孵育20min，15℃停留。
2.2.5毛细管电泳仪凝胶电泳：
将PCR扩增产物置于毛细管电泳仪加样板上电泳，并以15-500bp标定Marker和25bp DNA Marker作为对照，观察电泳结果并记录。
2.3结果描述及判定
①质控标准：
阳性对照在142bp、128bp、117bp、106bp、96bp处有特异性扩增条带。
阴性对照无特异性扩增条带。
如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效。
②结果判断：
阳性：在142bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪流感病毒；在128bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪传染性胃肠炎病毒。在117bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪繁殖与呼吸道综合征病毒；在106bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在口蹄疫病毒；在96bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在伪狂犬病病毒。必要时对MLPA扩增产物测序，进行确认试验。
阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无猪流感病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒。
实施例2、试剂盒的灵敏度试验
1、材料：
猪流感病毒A/swine/2003(H1N1)、猪繁殖与呼吸道综合征JXA1株灭活病毒、伪狂犬病毒南阳株、猪传染性胃肠炎病毒purdue115国际标准株由实验室保存，O型口蹄疫灭活病毒由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
2、方法
1）体外转录RNA和质粒DNA的制备
猪流感病毒M基因体外转录RNA的制备：回收猪流感病毒A/swine/2003(H1N1)株M基因的RT-PCR扩增产物，长度为982bp，与pGEM-T载体(购自PromeGA公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-SIV-M。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到猪流感病毒M基因的体外转录RNA，命名为SIV-M-RNA，猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1)株M基因序列如序列表中SEQ ID NO：13所示。
猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因体外转录RNA的制备：回收猪繁殖与呼吸道综合征病毒JXA1株N基因的RT-PCR扩增产物，长度为372bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PRRSV-N。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA ProductionSystem-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到猪繁殖与呼吸道综合征病毒N基因的体外转录RNA，命名为PRRSV-N-RNA，猪繁殖与呼吸道综合征病毒JXA1株N基因序列如序列表中SEQ ID NO：14所示。
伪狂犬病毒gB基因的阳性重组质粒的制备：回收伪狂犬病毒南阳株GB基因的PCR扩增产物，长度2751bp，与pGEM-T载体(购自PromeGA公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得伪狂犬病毒gB基因的阳性重组质粒，命名为PRV-gB-DNA，伪狂犬病毒南阳株gB基因序列如序列表中SEQ ID NO：15所示。
猪传染性胃肠炎病毒S基因体外转录RNA的制备：回收猪传染性胃肠炎病毒purdue115国际标准株S基因的RT-PCR扩增产物，长度为2137bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-TGEV-S。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到猪传染性胃肠炎病毒S基因的体外转录RNA，命名为TGEV-S-RNA，猪传染性胃肠炎病毒S基因如序列表中SEQ IDNO：16所示。
口蹄疫病毒3D基因体外转录RNA制备：回收O型口蹄疫病毒3D基因的RT-PCR扩增产物，长度为1410bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化JM109感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-FMDV-S。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的R Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNAse除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到口蹄疫病毒3D基因的体外转录RNA，命名为FMDV-3D-RNA，口蹄疫病毒3D基因序列如序列表中SEQ ID NO：17所示。
2）RNA和DNA溶液拷贝数测定
取制备好的体外转录RNA和质粒DNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值（OD260和OD280），计算待测样品的浓度与纯度。纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染），纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）。DNA样品的浓度（μg/μL）：OD260×稀释倍数×50/1000，RNA样品的浓度（μg/μL）：OD260×稀释倍数×40/1000。同时根据测序结果，利用DNAMAN（Version 6）推算出RNA和DNA的分子量（MW），并按以下公式计算拷贝数(Copies/μL)=(6.02×1023Copies/mol)×(浓度μg/μL)/(MW g/mol)。
2）多重连接探针扩增方法检测极限的确定
取上述已知浓度的RNA和DNA溶液各10μL，充分混匀后，制成阳性标准品。将该标准品10倍梯度稀释后，按最佳条件进行MLPA检测，并用去离子水作为阴性标准。通过对不同稀释度标准品的检测，确定MLPA方法的检测极限。
3、结果
1）RNA和DNA溶液拷贝数测定结果
将制备好的质粒DNA和体外转录RNA，分别用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值并推算出拷贝数，详细见表5
表5：RNA和DNA纯度及含量测定
2）多重连接探针扩增方法检测极限的确定
利用建立的多重连接探针检测方法，对10倍系列稀释的阳性标准品进行检测，结果该方法最低可检测到约4.82×103拷贝猪流感病毒RNA、5.59×103拷贝猪繁殖与呼吸道综合征病毒RNA、3.84×103拷贝伪狂犬病毒DNA、4.12×103拷贝猪传染性胃肠炎病毒RNA、5.26×103拷贝口蹄疫病毒RNA。由此可见该检测方法的灵敏度可达3000~6000拷贝/反应。
实施例3、试剂盒的特异性试验
1、材料
表6 特异性试验研究过程中应用到的病毒和核酸
| 病毒 | 来源 |
| 猪流感病毒A/Swine/2003(H1N1) | 本实验室保存 |
| 猪繁殖与呼吸综合征JXA1株灭活病毒 | 本实验室保存 |
| 伪狂犬病毒南阳株 | 本实验室保存 |
| 猪传染性胃肠炎purdue115国际标准株 | 本实验室保存 |
| O型口蹄疫灭活病毒 | 兰州兽医研究所 |
| 猪细小病毒 | 本实验室保存 |
| 猪瘟灭活病毒 | 中国兽药监察所提供 |
| 猪流行性腹泻病毒 | 本实验室保存 |
2、方法
2.1用猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒五种病毒中的任何一组探针分别对其它4种病毒核酸进行MLPA检测，以验证方法的特异性。
2.2利用建立的多重连接探针扩增检测方法对表格6中的病毒进行检测，验证方法的特异性。
3、结果
3.1用五种病毒中的任意一组探针进行MLPA检测，只能从其对应的病毒模板中扩增出预期大小的目的片段，对其余四种病毒均无扩增信号，表明所建立的方法特异性良好，结果如图2~6所示。
3.2利用建立的多重连接探针扩增检测方法对表格6中的病毒进行检测，猪流感病毒在142bp处有特异性扩增条带、猪传染性胃肠炎病毒在128bp处有特异性扩增条带、猪繁殖与呼吸道综合征病毒在117bp处有特异性扩增条带、口蹄疫病毒在106bp处有特异性扩增条带、伪狂犬病病毒在96bp处有特异性扩增条带，其它病毒均无特异性的扩增信号，表明所建立的方法特异性良好。
实施例4：试剂盒对临床样品检测的实验报告
1、材料
我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品165份。
2、方法
对我国直属出入境检验检疫局提供的已知样品165份进行检测。在实际样品中验证方法的敏感性和特异性。
3、结果
对165份已知样品进行检测，结果显示建立的方法可检出其中所有的猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒阳性样品，而且未出现假阳性结果，结果见表7，表明建立的方法可靠实用。
表7 临床样品的检测结果
| 样品 | 数量 | MLPA检测结果 |
| 猪流感病毒阳性样品 | 10 | 10/10 |
| 猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性样品 | 48 | 48/48 |
| 伪狂犬病毒阳性样品 | 30 | 30/30 |
| 猪传染性胃肠炎病毒阳性样品 | 20 | 20/20 |
| 口蹄疫病毒阳性样品 | 7 | 7/7 |
| 阴性样品 | 50 | 0/50 |
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (3)
1.用于同时检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的引物和多重连接探针，其特征在于，所述多重连接探针如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示，所述引物如序列表SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：12所示；其中，
所述序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测猪流感病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别为检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别为检测伪狂犬病病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别为检测口蹄疫病毒的短探针和长探针，并且所述SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的5’ 端进行磷酸化处理。
2.一种检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒，其包括以下组分：
（1）MLPA 缓冲液；
（2）探针混合物，其包括如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO：10所示的用于检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的多重连接探针，其中，所述SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的5’ 端进行磷酸化处理；
（3）连接反应液，其包括：Ligase-65 缓冲液 A和Ligase-65 缓冲液 B；
（4）Ligase-65连接酶；
（5）PCR反应液，其包括如序列表SEQ ID NO:11至SEQ ID NO：12所示的引物；
（6）SALSA 聚合酶；
（7）无RNA酶的灭菌纯化水；
（8）阴性对照；
（9）阳性对照。
3.根据权利要求2所述的多重连接探针扩增检测试剂盒，其特征在于，所述序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测猪流感病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别为检测猪繁殖与呼吸道综合征病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别为检测伪狂犬病病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的短探针和长探针；所述序列SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别为检测口蹄疫病毒的短探针和长探针。
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