CN103275862A - 一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒 - Google Patents
一种检测甲型流感病毒h7n9亚型的荧光定量rt-pcr试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒，对甲型流感病毒及H7N9型进行检测。本试剂盒包含定量RT-PCR反应液、酶混合液、引物探针混合液、标准品（甲型流感病毒、H7、N9、RNaseP）、阳性对照品（甲型流感病毒、H7、N9、RNaseP）、阴性对照品。本发明根据甲型流感病毒、H7、N9的保守区序列设计特异性的引物和探针，引入RNaseP引物探针作为内参，采用一步法四重实时荧光定量RT-PCR技术，可快速、准确的从标本中检测甲型流感病毒及H7N9亚型流感病毒。该试剂盒设计合理，具有极高的特异性、灵敏性和重复性，可应用于甲型流感病毒H7N9亚型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查及发热呼吸道症候群中甲型流感病毒及H7N9亚型的流行病学的研究。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及荧光定量RT-PCR检测试剂盒，具体涉及一种一步法四重实时荧光定量RT-PCR在同一个反应管内检测患者鼻咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物等标本中甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型核酸检测方法，可应用于H7N9型禽流感引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查、临床诊断及发热呼吸道症候群患者中甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型的流行病学的研究。
背景技术
甲型流感病毒H7N9亚型是全球首次发现的新亚型流感病毒，于2013年3月在上海和安徽两地率先发现。H7N9亚型是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。甲型流感病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。基因组为分节段单股负链RNA。甲型流感病毒共有8个基因节段，依据其外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性不同，目前从禽类已鉴定出16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9）。目前从禽类已鉴定出16个H亚型（H1-H16），9个N亚型（N1-N9）。近一个世纪，在人间流行的流感病毒主要是H1、H2、H3和N1、N2等几种抗原构成的亚型，但禽流感病毒也可感染人，既往确认感染人的禽流感病毒有H5N1、H9N2、H7N2、H7N3、H7N7、H5N2、H10N7等。该病毒为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。
人感染H7N9禽流感是由甲型流感病毒H7N9亚型引起的急性呼吸道传染病。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。
目前人感染H7N9禽流感诊疗的实验室检查包括血常规、血生化、病原学及相关检测及胸部影像学检查等。病原学检测是人感染H7N9禽流感的筛查、确认至关重要的环节。由于病原分离培养条件及技术要求高、周期长；而甲型流感病毒H7N9亚型作为发现的新亚型流感病毒缺少抗原和抗体，市场上尚未有成熟的快速诊断试剂；实时荧光定量PCR技术以其全封闭单管扩增、简便快捷、重复性好、实时定量、污染少等优势，克服了以往临床诊断的缺陷，具有高度的特异性和敏感性，为临床诊断提供了准确可靠的实验室依据，可作为一种临床病原诊断的有效、快速的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒，即一种用于甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型检测的一步法四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本试剂盒由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、标准品管（共有4管）、阳性对照品管（共有4管）、阴性对照品管和盒体组成。定量RT-PCR反应液管装有定量RT-PCR反应液，酶混合液管装有酶混合液，引物探针混合液管装有引物探针混合液，4个标准品管分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P，4个阳性对照品管分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品。
其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，阳性对照为甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品。
引物探针混合液管需避光条件保存，选用棕色管。
四重荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：
上游引物Influenza A-F: 5’- GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC-3’
下游引物Influenza A-R：5’- GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC-3’
特异性探针Influenza A-P: 5’-ROX-AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT-BHQ2-3’
上游引物H7-F: 5’- GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3’
下游引物H7-R: 5’- CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA-3’
特异性探针H7-P: 5’-FAM- ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA--BHQ1-3’
上游引物N9-F: 5’- GCCCTGATAAGCTGGCCACT-3’
下游引物N9-R: 5- ACTAGTACTTGACCAMCCAATGCA-3’
特异性探针N9-P: 5’-VIC- TCACCRCCCACAGTRTACAAYAGCA-BHQ1-3’
上游引物RNase P-F: 5’- AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
下游引物RNase P-R：5’- GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
特异性探针RNase P-P: 5’-CY5- TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’
其中甲型流感病毒、H7、N9及RNase P的特异性探针分别采用ROX、FAM、VIC和CY5四种不同荧光标记。
所述标准品包括甲型流感病毒、H7、N9及核酶RNase P标准品，其保守区基因序列如下：
甲型流感病毒标准品序列为：
CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAACGCCCTAAATGGGAATGG
H7标准品序列为：
CACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACT
N9标准品序列为：
GATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTGTACAACAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAGTTGCCATGATGGCAAATCCAGG
RNase P标准品序列为：
CTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTGGTTGC
本发明提供的荧光定量试剂盒需于-20℃储存，尽量减少反复冻融；引物探针混合液需避光条件保存，选用棕色管。
本发明的另一个目的是提供上述的一步法四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，应用于甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型的核酸检测以及样本采集情况和核酸提取状态的判定。
本发明试剂盒检测对象为呼吸道标本、粪便标本、尿液标本或全血标本，呼吸道标本包括鼻咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物。
本发明试剂盒的使用方法：在每次标本检测中均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用TaKaRa公司的Easy Dilution（货号：9160）稀释为1×102-1×107copies/ml。
鼻咽拭子或痰液等样本核酸的提取：鼻咽拭子标本要在标本运输（保存）液中充分搅动至少40下，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等。痰液等如粘液成分较重，可进行液化（按1:1体积比加入1% pH7.6的胰蛋白酶溶液，室温消化15~30min）等处理。吸取200ul上清加到EP管中，进行核酸提取。核酸提取采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII或QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取, 取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。
本发明试剂盒检测对象为呼吸道标本、粪便标本、尿液标本或全血标本，呼吸道标本包括鼻咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物。
核酸的检测：取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。反应总体积为25 ml，其中定量RT-PCR反应液12.5 ml，酶混合液1 ml，引物探针混合液(20μmol/L，包含四组特异性引物和相应的四种荧光探针)共6ml，模板5ml，加水补足至25 ml。在ABI7500荧光定量PCR仪（或者其他四色荧光及以上的PCR仪）上进行检测，反应参数为：反转录50℃,30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。
荧光定量结果报告：①样本采集合格RNase P、Influenza A、H7、N9检测的各自CT值对应相应的荧光标记的探针，样本采集合格及核酸提取成功，则RNase P均为阳性；其余检测样本CT值为40、0和无数值时，报告为阴性。② 检测样本Influenza A 的CT值≤35时，报告为甲型流感病毒阳性；若同时H7、N9的CT值≤35，报告为甲型流感病毒H7N9亚型阳性。③ 检测样本CT值≥35且小于40的样本，建议复检，复检结果CT值＜38者，依据②的判断标准报告为相应病毒阳性。根据所获得的标准曲线，计算待测标本甲型流感病毒或者甲型流感病毒H7N9亚型的病毒量(copies/ml)。
本发明针对甲型流感高度保守的M蛋白设计可同时检测出所有流感病毒的通用引物探针；针对H7N9型禽流感病毒外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白分别设计可区分H7、N9亚型的引物探针；同时加入核酶RNase P的引物探针作为内参。采用单管一步法四重实时荧光定量RT-PCR，能够一管内一次反应同时检测出甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型，不仅极大的节省了试剂耗材，缩短了检测时间，内参的引入可很好地监控标本采集是否合格及核酸提取是否成功，协助检测结果的判断。另外，四重实时荧光定量RT-PCR同样具有极高的特异性和灵敏度。
本发明的有益之处是：运用一步法实时荧光定量RT-PCR技术，采用甲型流感病毒、H7、N9高度特异的引物和荧光标记探针，引入高度保守的管家基因RNase P作为内参，开发研制用于甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型检测及样本采集和核酸提取情况的判定的四重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。该发明是通过一个PCR反应，可以从鼻咽拭子或痰液等呼吸道标本中同时检测出是否有甲型流感病毒或甲型流感病毒H7N9亚型存在，比单重荧光定量PCR方法更便捷迅速、节约成本。同时，对检测的病毒进行实时准确定量，根据病毒感染的滴度，为临床上患者提供早期明确诊断，为临床治疗方案的制定提供参考依据；可应用于甲型流感病毒H7N9亚型引起暴发疫情的实验室应急诊断、快速筛查及发热呼吸道症候群中甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型的流行病学的研究。
附图说明
图1为本试剂盒结构示意图。
图2为本试剂盒用于检测确诊人感染H7N9禽流感病毒患者痰液标本H7N9病毒强阳性的实例。
图3为本试剂盒用于检测确诊人感染H7N9禽流感病毒患者咽拭子标本H7N9病毒弱阳性的实例。
图4为本试剂盒检测甲型流感病毒的灵敏度，从左到右（1-6）依次为107、106、105、104、103、102copies/ml。
图5为本试剂盒甲型流感病毒标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane M为DL2000 Marker ，Lane 1-6分别为甲型流感病毒标准品（107copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
图6为本试剂盒甲型流感病毒标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图7为本试剂盒检测H7的灵敏度，从左到右（1-6）依次为107、106、105、104、103、102 copies/ml。
图8为本试剂盒H7标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1-6分别为H7标准品（107copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
图9为本试剂盒H7标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图10为本试剂盒检测N9的灵敏度，从左到右（1-6）依次为107、106、105、104、103、102 copies/ml。
图11为本试剂盒N9标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1-6分别为N9标准品（107copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
图12为本试剂盒N9标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
图13为本试剂盒检测RNase P的灵敏度，从左到右（1-6）依次为107、106、105、104、103、102 copies/ml。
图14为本试剂盒RNase P标准品实时荧光定量RT-PCR产物凝胶电泳示意图，其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1-6分别为N9标准品（107copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
图15为本试剂盒RNase P标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
下面具体实施例结合附图对本发明进行进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明而不限制本发明的范围。
实施例1
参见图1，一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，由定量RT-PCR反应液管1、酶混合液管2、引物探针混合液管3、标准品管4（共有4管，分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P）、阳性对照品管5（共有4管，分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P）、阴性对照品管6和盒体7组成。定量RT-PCR反应液管1装有定量RT-PCR反应液，酶混合液管2酶混合液，引物探针混合液管3装有引物探针混合液，4个标准品管4分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P，4个阳性对照品管5分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品。
定量RT-PCR反应液管1装有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液管2装有耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液管3装有四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，4管标准品管4分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P，阴性对照管装有高温高压灭菌的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水，4管阳性对照管5分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品。
引物探针混合液管需避光条件保存，选用棕色管。
实施例2
1 材料与方法
1.1临床标本与病毒核酸：
甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型的临床样本来源于来源于浙江大学医学院附属第一医院及浙江省内其他几家医院甲型流感病毒H7N9亚型确诊患者及疑似患者的鼻咽拭子或痰液等标本，样本采集后运送到P3实验室。另外，其他甲型流感病毒如人季节性H1N1、新甲型H1N1、人季节性H3N2、H5N1，及乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、人类冠状病毒-HKU1、人类冠状病毒-NL63、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸由传染病诊治国家重点实验室提供。
1.2引物与探针
从NCBI基因库下载了涵盖国内外甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型的多条基因序列。利用DNAman软件对其进行了同源性比较，确定以上病毒基因组的保守区。使用Primer Express 3.0软件在其保守区设计高度特异性的引物与Taqman探针，引物和探针序列均通过Blast验证，具有较好特异性。引物和探针序列如下，：
上游引物Influenza A-F: 5’- GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC-3’
下游引物Influenza A-R：5’- GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC-3’
特异性探针Influenza A-P: 5’-ROX-AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT-BHQ2-3’
上游引物H7-F: 5’- GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3’
下游引物H7-R: 5’- CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA-3’
特异性探针H7-P: 5’-FAM- ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA--BHQ1-3’
上游引物N9-F: 5’- GCCCTGATAAGCTGGCCACT-3’
下游引物N9-R: 5- ACTAGTACTTGACCAMCCAATGCA-3’
特异性探针N9-P: 5’-HEX- TCACCRCCCACAGTRTACAAYAGCA-BHQ1-3’
上游引物RNase P-F: 5’- AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
下游引物RNase P-R：5’- GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
特异性探针RNase P-P: 5’-ROX- TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’
其中，RNase P的探针引物引自J. Clin. Microbiol. 2005, 43(4):1851。以上引物和探针委托生工生物工程（上海）有限公司合成。
1.3病毒核酸的提取与标准品定量标准：
鼻咽拭子标本要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等。痰液等如粘液成分较重，可进行液化（按1:1体积比加入1% pH7.6的胰蛋白酶溶液，室温消化15~30min）等处理。吸取200 ml上清加入到EP管中，采用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid extraction KitII或QIAGEN公司的Rneasy Mini Kit，按照试剂盒说明书进行提取, 取5ul已抽提的待测样品核酸作为模板。
合成各基因标准品片段，将其连接到质粒载体pMDTM19-T Simple Vector（TaKaRa公司）上。转化后培养。鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为标准品定量母液。根据实验需要，将标准品定量母液稀释至所需最高浓度，并做十倍稀释至最低浓度，低温保存备用。
1.4四重实时荧光定量RT-PCR反应体系和条件的优化：
反应总体积为25 ml，其中定量RT-PCR反应液12.5 ml，酶混合液1 ml，引物探针混合液(20μmol/l，包含四种病毒的特异性引物和相应的三种种荧光探针)共4.5ml，模板5ml，DEPC水补足至25 ml。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃,30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行四重荧光检测，共进行40个循环。结果判断：选择荧光检测模式FAM、HEX、CY5、ROX荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品的最高点，样本呈典型的扩增曲线，判断为阳性。无典型的扩增曲线，判断为阴性。体系的优化试验，在以相同浓度阳性核酸为模板的反应体系中，引物浓度从1～20μM，探针浓度从1～20μM，采用矩阵法优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值和最高荧光强度增加值（ΔRn）选择最佳引物和探针浓度。
1.5四重实时荧光定量RT-PCR特异性、敏感性和重复性试验
选择甲型流感病毒H7N9亚型的阳性核酸（均来自H7N9确诊患者标本核酸）和其他甲型流感病毒如人季节性H1N1、新甲型H1N1、人季节性H3N2、H5N1，及乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、人类冠状病毒-HKU1、人类冠状病毒-NL63、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的阳性核酸，用四重实时荧光定量RT-PCR方法验证方法的特异性；对已标定拷贝数（copies/ml）的甲型流感病毒合成片段（107copies/ml）、H7合成片段（107copies/ml）、N9合成片段（107copies/ml）和RNase P合成片段（107copies/ml）分别稀释后，通过平行进行荧光PCR反应及PCR产物电泳，比较其灵敏度。此外，对每一个指定浓度的阳性核酸稀释液作3次重复检测，得到的Ct值计算其标准差和变异系数，验证该方法的重复性。
1.6四重实时荧光定量RT-PCR标准曲线的建立
将已标定拷贝数的标准品合成片段（107copies/ml）分别十倍梯度稀释后，以浓度梯度的标准品为模板，在最佳反应条件下扩增。反应结束后以起始模板拷贝数的对数为x轴，以Ct值为y轴绘制标准曲线。
2结果
2.1四重实时荧光定量RT-PCR反应体系及条件
该方法的反应总体积为25 ml，其中其中定量RT-PCR反应液12.5 ml，酶混合液1 ml，引物探针混合液(20μmol/l，包含四组特异性引物和相应的四种种荧光探针)共6ml，模板5ml，DEPC水补足至25 ml。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测，反应参数为：反转录50℃,30min；95℃ 5min热启动，然后95℃ 15s，55℃ 45s，在55℃进行三重荧光检测，共进行40个循环。可获得最低Ct值和最高荧光强度。
2.2特异性试验
本发明建立的一步法四重荧光定量RT-PCR方法对甲型流感病毒及甲型流感病毒H7N9亚型具有极好的特异性，能完全检出近期采集的临床阳性标本。本发明中的四重引物探针与其他甲型流感病毒如人季节性H1N1、新甲型H1N1、人季节性H3N2、H5N1，及乙型流感病毒、呼吸道腺病毒、人偏肺病毒、冠状病毒HU1、冠状病毒NL63、呼吸道合胞病毒、博卡病毒等均无交叉反应。该方法检出痰标本的H7N9禽流感强阳性结果参见图2，其中甲型流感病毒的Ct值为18.926、H7的Ct值为19.880、N9的Ct值为19.884、RNase P的Ct值为19.135。该方法检出鼻咽拭子标本的H7N9禽流感弱阳性结果参见图3，其中甲型流感病毒的Ct值为32.885、H7的Ct值为33.120、N9的Ct值为33.426、RNase P的Ct值为32.978。
2.3 敏感性试验
对甲型流感病毒、H7、N9、RNase P敏感性检测试验，将已标定拷贝数（copies/ml）的甲型流感病毒合成片段（107copies/ml）、H7合成片段（107copies/ml）、N9合成片段（107copies/ml）和RNase P合成片段（1078copies/ml）分别十倍梯度稀释后，用本试剂盒进行检测，结果该方法检测敏感性分别达到102、102、102和102copies/ml。结果参见图4、图7、图10、图13。取实时荧光定量RT-PCR产物5ml，120V电压电泳20min，凝胶成像系统拍照。结果参见图5、图8、图11、图14，其中Lane M为DL2000 Marker，Lane 1-6分别为片段（108copies/ml）十倍梯度稀释后实时荧光定量RT-PCR产物，Lane 7为阴性对照。
2.4重复性试验
分别取甲型流感病毒合成片段（终浓度为106copies/ml）、H7合成片段（106copies/ml）N9合成片段（106copies/ml）和RNase P合成片段（106copies/ml），按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对每一个浓度的样本作3个重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在0.079～0.432之间，变异系数均低于1.55%，具有较好的重复性（结果见表1）。
2.5 标准曲线的建立
在上述扩增条件下，按以上方法进行扩增。反应结束后以以标准品浓度的对数值为x轴，以循环数为y轴绘制标准曲线。甲型流感病毒、H7、N9及RNase P合成片段建立的标准曲线分别参见图6、图9、图12、图15。
实施例3
采用本试剂盒对临床样本的检测主要依托“十二五”重大专项-传染病病原检测技术平台项目(2012ZX10004-210)。采集的临床样本主要来源于2013年3月至2013年4月间浙江大学医学院附属第一医院以及浙江省内其他几家医院近期发热门诊部分标本总共1039份：鼻咽拭子标本（971份）、痰液标本（68份）；浙江大学医学院附属第一医院H7N9确诊住院患者部分标本总共143份：鼻咽拭子标本（95份）、痰液标本（48份）和粪便标本（10份）。采用本方法中的四重实时荧光定量RT-PCR对收集到的标本进行验证，检测结果如下：发热门诊送检标本检出甲型流感病毒阳性112份，筛查出甲型流感病毒H7N9亚型阳性标本5份。H7N9确诊住院患者送检标本检出甲型流感病毒H7N9亚型阳性鼻咽拭子标本42份，痰液阳性标本29份。检测阳性结果与其已报告结果符合度达100%。
<110> 浙江大学
<120>一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒
<160> 16
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Influenza A病毒M基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 1
GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据据Influenza A病毒M基因设计的PCR检测下游引物序列
<400> 2
GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据据Influenza A病毒M基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列
<400> 3
AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT 23
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据Influenza A病毒M基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400> 4
CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAACGCCCTAAATGGGAATGG 120
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒HA基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 5
GATCAGCATGTGTGTTTTACACGA 24
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒HA基因设计的PCR检测下游引物序列
<400> 6
CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA 26
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒HA基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列
<400> 7
ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA 28
<210> 8
<211> 119
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒HA基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400> 8
CACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACT 119
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒NA基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 9
GCCCTGATAAGCTGGCCACT 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒NA设计的PCR检测下游引物序列
<400> 10
ACTAGTACTTGACCAMCCAATGCA 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒NA基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列
<400> 11
TCACCRCCCACAGTRTACAAYAGCA 25
<210> 12
<211> 120
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据H7N9病毒NA基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400> 12
GATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTGTACAACAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAGTTGCCATGATGGCAAATCCAGG 120
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酶RNase P基因设计的PCR检测上游引物序列
<400> 13
AGATTTGGACCTGCGAGCG 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酶RNase P基因设计的PCR检测下游引物序列
<400> 14
GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 20
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酶RNase P基因设计的TaqMan荧光定量检测探针序列
<400> 15
TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG 23
<210> 16
<211> 108
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酶RNase P基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400> 16
CTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTGGTTGC 108
Claims (7)
1.一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，该试剂盒由定量RT-PCR反应液管（1）、酶混合液管（2）、引物探针混合液管（3）、4个标准品管（4）、4个阳性对照品管（5）、阴性对照品管（6）和盒体（7）组成，定量RT-PCR反应液管（1）装有定量RT-PCR反应液，酶混合液管（2）装有酶混合液，引物探针混合液管（3）装有引物探针混合液，4个标准品管（4）分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P，4个阳性对照品管（5）分别装有甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品；
其中定量RT-PCR反应液含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合液含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶，引物探针混合液包含四组引物和相应的四种不同荧光标记的探针，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的阳性质粒样品；
荧光定量RT-PCR检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：
上游引物Influenza A-F: 5’- GGARTGGMTAAAGACAAGACCAATC-3’
下游引物Influenza A-R：5’- GGCRTTYTGGACAAASCGTCTAC-3’
特异性探针Influenza A-P: 5’-ROX-AGTCCTCGCTCACTGGGCACGGT-BHQ2-3’
上游引物H7-F: 5’- GAGGCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3’
下游引物H7-R: 5’- CCGAAGCTAAACCARAGTATCACA-3’
特异性探针H7-P: 5’-FAM- ACCCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTAYAA--BHQ1-3’
上游引物N9-F: 5’- GCCCTGATAAGCTGGCCACT-3’
下游引物N9-R: 5- ACTAGTACTTGACCAMCCAATGCA-3’
特异性探针N9-P: 5’-VIC- TCACCRCCCACAGTRTACAAYAGCA-BHQ1-3’
上游引物RNase P-F: 5’- AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’
下游引物RNase P-R：5’- GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’
特异性探针RNase P-P: 5’-CY5- TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’
所述标准品包括甲型流感病毒、H7、N9及核酶RNase P标准品，其保守区基因序列如下：
甲型流感病毒标准品序列为：
CGAGGCTCTCATGGAGTGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAACGCCCTAAATGGGAATGG
H7标准品序列为：
CACAGCAAATACAGGGAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACAGATTGACCCAGTCAAACTAAGCAGCGGCTACAAAGATGTGATACTTTGGTTTAGCTTCGGGGCATCATGTTTCATACT
N9标准品序列为：
GATAGGTCCCAGTATCGCGCCCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTGTACAACAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAGTTGCCATGATGGCAAATCCAGG
RNase P标准品序列为：
CTTCAGCATGGCGGTGTTTGCAGATTTGGACCTGCGAGCGGGTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGACTTGTGGAGACAGCCGCTCACCTTGGCTATTCAGTGGTTGC
所述甲型流感病毒、H7、N9及RNase P的特异性探针分别采用ROX、FAM、VIC和CY5四种不同荧光标记。
2.根据权利要求1所述的一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，其特异性的荧光探针5’端为包括ROX、FAM、VIC、CY5或CY3的荧光报告基团，3’端为包括BHQ1、 BHQ2或BHQ3的荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，阴性对照为高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，阳性对照为包含甲型流感病毒、H7、N9、RNase P的保守区基因序列的阳性质粒样品。
4.根据权利要求1所述的一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒,其特征在于，所述的试剂盒保存于-20℃，引物探针混合液管（3）选用棕色管。
5.根据权利要求1所述的一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒在甲型流感病毒及H7N9亚型流感病毒检测中的应用。
6.根据权利要求1所述的一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒在判断样本采集和核酸提取情况中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的一种检测甲型流感病毒H7N9亚型的荧光定量RT-PCR试剂盒的应用，其特征在于，所述的试剂盒检测对象为呼吸道标本、粪便标本、尿液标本或全血标本，呼吸道标本包括鼻咽拭子、痰液、鼻咽抽吸物。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |