CN107541570A - 检测高致病性h7n9突变病毒的引物和探针及其试剂盒 - Google Patents

检测高致病性h7n9突变病毒的引物和探针及其试剂盒 Download PDF

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高福
刘映霞
毕玉海
杨扬
郑海霞
李善琴
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Abstract

本发明公开了一种检测高致病性H7N9突变病毒的引物和探针及其试剂盒。所述引物的序列为SEQ ID NO:1‑2和5‑6，所述探针的序列为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，和SEQ ID NO:7；其中每条序列的5’端和3’端都带荧光标记，三条探针的5’端和3’端所带的荧光标记均不一样。采用本发明的引物和探针及其试剂盒进行检测，具有检测灵敏和快速，准确的特点。

Description

检测高致病性H7N9突变病毒的引物和探针及其试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种检测高致病性H7N9突变病毒的引物和探针及其试剂盒。
背景技术
高致病性H7N9突变病毒是今年新发现的病毒，目前还没有可靠的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测样本中是否有H7N9病毒，同时鉴定样本中的H7N9病毒是否为高致病性突变型病毒的引物和探针。
为实现上述目的，本发明提供一种检测高致病性H7N9突变病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物的序列为SEQ ID NO:1-2和5-6，所述探针的序列为SEQ ID NO:3，SEQID NO:4，和SEQ ID NO:7；其中每条序列的5’端和3’端都带荧光标记，三条探针的5’端和3’端所带的荧光标记均不一样。
本发明还提供一种检测高致病性H7N9突变病毒的试剂盒，其特征在于，含有所述的引物和探针。
本发明还提供一种高致病性H7N9突变病毒的检测方法，其特征在于，使用了所述的引物和探针或使用了所述的试剂盒。
进一步，步骤为，
提取待检物的DNA；
将上述DNA作为模板进行荧光PCR：使用权利要求1所述的引物和探针或使用权利要求2所述的试剂盒；
根据结果进行判断。
进一步，所述荧光PCR的反应体系为：
进一步，所述荧光PCR的反应程序为50℃2min；95℃10min；95℃15s,55℃1min,40个循环。
本发明所检测的高致病性H7N9突变病毒在HA基因的血凝素链接肽位置插入了12个碱基序列，使得H7N9病毒在禽类中从低致病性禽流感病突变为高致病性禽流感。本发明设计的突变型H7探针针对该插入的12个碱基设计得到，具有检测灵敏和快速，准确的特点。
本发明中所用的引物序列即探针序列分别如下：
H7上游引物(H7-F)：5’-GGRAAATGYCCRAGATATGTTAA-3’(R代表A或G，Y代表T或C)(SEQ ID NO：1)
H7下游引物(H7-R)：5’-AATTAGKCCTTCCCATCCATTT-3’(K代表A或G)
(SEQ ID NO：2)
通用型H7探针(H7-P-W)：5’-FAM-TTGGTGCYATAGCDGGTTTCATTGA-BHQ1-3’(Y代表T或C，D代表G或A或T)(SEQ ID NO：3)
突变型H7探针(H7-P-M)：5’-ROX-AAAACGGAYTGCGA-BHQ2-3’(Y代表T或C)
(SEQ ID NO：4)
N9上游引物(N9-F)：5’-GAAGAATGCTCATGTTACGG-3’(SEQ ID NO：5)
N9下游引物(N9-R)：5’-TGACTAGTGTGTGTCATTGCTA-3’(SEQ ID NO：6)
N9探针(N9-P)：5’-HEX-ACCTGCACATGCARGGACAATTGGC-TRAMA-3’(R代表A或G)
(SEQ ID NO：7)
附图说明
图1：检测不同稀释度野生型H7N9病毒RNA的结果图；
图2：检测不同稀释度高致病性H7N9突变病毒RNA的结果图；
图3：通用型H7探针检测灵敏度结果图；
图4：突变型H7探针检测灵敏度结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中的引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
实施例1：标准品的制备
1.构建标准品质粒
野生型H7N9病毒(毒株名：A/Anhui/1/2013(H7N9)，GISAID收录号：EPI_ISL_138739)和高致病性H7N9突变病毒(毒株名：A/Guangdong/Th005/2017(H7N9)，GISAID收录号：EPI_ISL_250312)RNA均由中科院流感研究与预警中心提供。采用Promega公司货号为A5001的GoScript Reverse Transcription System试剂盒的试剂并按照试剂盒说明书对上述RNA进行cDNA合成。上述合成的cDNA采用北京康为世纪公司的货号CW0690A的2×EsTaq Master Mix进行PCR扩增，退火温度为58℃，扩增30个循环，引物为H7-F和H7-R，浓度20μM，上下游各0.5μl，其它条件按照说明书进行，扩增完成后，取产物用2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定为阳性的产物片段用Thermo公司的Gene JET PCR purification进行纯化回收，并将产物片段克隆到Promega公司货号为A1360的pGEM-T载体中构建标准品质粒。
H7上游引物(H7-F)：5’-GGRAAATGYCCRAGATATGTTAA-3’(R代表A或G，Y代表T
或C)(SEQ ID NO：1)
H7下游引物(H7-R)：5’-AATTAGKCCTTCCCATCCATTT-3’(K代表A或G)
(SEQ ID NO：2)
以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2.样品制备
采用北京康为世纪公司的货号为CW0500A的质粒小量提取试剂盒的试剂并按照试剂盒说明书提取标准品质粒，用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定质粒的浓度，通过其分子量计算出拷贝数，然后依次制备10倍梯度稀释至个位拷贝数的样品，共计8个梯度，拷贝数为：1x108至1x101/μL。
实施例2：检测不同稀释度野生型H7N9病毒
检测样本：野生型H7N9(毒株名：A/Anhui/1/2013(H7N9)，GISAID收录号：EPI_ISL_138739)；病毒RNA由中科院流感研究与预警中心提供)
实时荧光PCR反应的反应体系如下：
2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μl
Takara Ex Taq HS 0.4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4μl
H7-F：浓度为20μM，0.4μl
H7-R：浓度为20μM，0.4μl
H7-P-W:浓度为20μM，0.4μl
H7-P-M:浓度为20μM，0.4μl
N9-F:浓度为20μM，0.4μl
N9-R:浓度为20μM，0.4μl
N9-P:浓度为20μM，0.4μl
DEPC水:3.9μl
233ng/μl病毒RNA：5μl。
所述2×One Step RT-PCR BufferⅢ、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RTEnzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II均来自Takara公司的货号为RR064A的OneStep PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒。
H7上游引物(H7-F)：5’-GGRAAATGYCCRAGATATGTTAA-3’(R代表A或G，Y代表T
或C)(SEQ ID NO：1)
H7下游引物(H7-R)：5’-AATTAGKCCTTCCCATCCATTT-3’(K代表A或G)
(SEQ ID NO：2)
通用型H7探针(H7-P-W)：5’-FAM-TTGGTGCYATAGCDGGTTTCATTGA-BHQ1-3’(Y代表T或C，D代表G或A或T)(SEQ ID NO：3)
突变型H7探针(H7-P-M)：5’-ROX-AAAACGGAYTGCGA-BHQ2-3’(Y代表T或C)
(SEQ ID NO：4)
N9上游引物(N9-F)：5’-GAAGAATGCTCATGTTACGG-3’(SEQ ID NO：5)
N9下游引物(N9-R)：5’-TGACTAGTGTGTGTCATTGCTA-3’(SEQ ID NO：6)
N9探针(N9-P)：5’-HEX-ACCTGCACATGCARGGACAATTGGC-TRAMA-3’(R代表A或G)(SEQID NO：7)
以上引物由上海生工生物工程有限公司合成。
荧光PCR反应的程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15s,55℃1min,40个循环。结果见图1。
图1为不同稀释度的野生型H7N9病毒的检测结果图；其中1表示病毒RNA原液样本(病毒滴度滴度为1.28×102HAU)；2表示稀释1000倍的病毒RNA样本(病毒滴度为1.28×10- 1HAU；3表示稀释1000000倍的病毒RNA样本(病毒滴度为1.28×10-4HAU)；从图1可以看出，通过该方法扩增野生型H7N9，我们可以看到只有采用通用型H7探针和N9探针(即H7-P-W和N9-P)才能看出有明显扩增，而突变型H7探针和N9探针(即H7-P-M和N9-P)则没有检测到荧光信号。说明通用型H7探针和N9探针能够检测到H7N9病毒，而突变型H7探针的特异性非常好。
实施例3：检测不同稀释度高致病性H7N9突变病毒
检测样本：高致病性H7N9突变病毒(毒株名：A/Guangdong/Th005/2017(H7N9)，GISAID收录号：EPI_ISL_250312，病毒RNA由中科院流感研究与预警中心提供)
实时荧光PCR反应的反应体系如下：
2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μl
Takara Ex Taq HS 0.4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4μl
H7-F：浓度为20μM，0.4μl
H7-R：浓度为20μM，0.4μl
H7-P-W:浓度为20μM，0.4μl
H7-P-M:浓度为20μM，0.4μl
N9-F:浓度为20μM，0.4μl
N9-R:浓度为20μM，0.4μl
N9-P:浓度为20μM，0.4μl
DEPC水:3.9μl
243ng/μl病毒RNA：5μl；
所述2×One Step RT-PCR BufferⅢ、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RTEnzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II均来自Takara公司的货号为RR064A的OneStep PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒。
荧光PCR反应的程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15s,55℃1min,40个循环。结果见图2。
图2为不同稀释度检测高致病性H7N9突变病毒的结果图；其中1表示病毒RNA原液样本(病毒滴度滴度为1.28×102HAU)；2表示稀释1000倍的病毒RNA样本(病毒滴度为1.28×10-1HAU；3表示稀释1000000倍的病毒RNA样本(病毒滴度为1.28×10-4HAU)；从图2可以看出，通过该方法扩增高致病性H7N9突变病毒，我们可以看到通用型H7探针、突变型H7探针和N9探针均有明显扩增，说明通用型H7探针和N9探针能够检测到H7N9病毒，而突变型H7探针的特异性非常好。
实施例4：通用型H7探针检测灵敏度
检测样本：实施例1所得不同拷贝数的标准品。
实时荧光PCR反应的反应体系如下：
2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μl
Takara Ex Taq HS 0.4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4μl
H7-F：浓度为20μM，0.4μl
H7-R：浓度为20μM，0.4μl
H7-P-W:浓度为20μM，0.4μl
DEPC水:5.5μl
标准品质粒：5μl；
所述2×One Step RT-PCR BufferⅢ、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RTEnzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II均来自Takara公司的货号为RR064A的OneStep PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒。
荧光PCR反应的程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15s,55℃1min,40个循环。结果见图3。
图3为通用型H7探针检测灵敏度结果图；其中108表示标准品的拷贝数为108；107表示标准品的拷贝数为107；106表示标准品的拷贝数为106，依次下去；从图3可以看出，采用通用型H7探针灵敏度检测结果显示该方法具有很好的灵敏度，能够检测到10个拷贝的病毒基因。
实施例5：突变型H7探针检测灵敏度
检测样本：实施例1所得不同拷贝数的标准品。
实时荧光PCR反应的反应体系如下：
2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μl
Takara Ex Taq HS 0.4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix 0.4μl
H7-F：浓度为20μM，0.4μl
H7-R：浓度为20μM，0.4μl
H7-P-M:浓度为20μM，0.4μl
DEPC水:5.5μl
标准品质粒：5μl；
所述2×One Step RT-PCR BufferⅢ、Takara Ex Taq HS、PrimeScript RTEnzyme Mix和ROX Reference Dye or Dye II均来自Takara公司的货号为RR064A的OneStep PrimeScriptTMRT-PCR Kit试剂盒。
荧光PCR反应的程序如下：50℃2min；95℃10min；95℃15s,55℃1min,40个循环。结果见图4。
图4为突变型H7探针检测灵敏度结果图。其中108表示标准品的拷贝数为108；107表示标准品的拷贝数为107；106表示标准品的拷贝数为106，依次下去；从图4可以看出，采用突变型H7探针，其灵敏度检测结果显示该方法具有很好的灵敏度，能够检测到10个拷贝的病毒基因。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 检测高致病性H7N9突变病毒的引物和探针及其试剂盒
<130> 1710176
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 碱基兼并
<222> (3)..(12)
<223> R代表A或G，Y代表T或C
<400> 1
ggraaatgyc cragatatgt taa 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 碱基兼并
<222> (7)..(7)
<223> K代表A或G
<400> 2
aattagkcct tcccatccat tt 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 碱基兼并
<222> (8)..(15)
<223> Y代表T或C，D代表G或A或T
<400> 3
ttggtgcyat agcdggtttc attga 25
<210> 4
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 碱基兼并
<222> (9)..(9)
<223> Y代表T或C
<400> 4
aaaacggayt gcga 14
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gaagaatgct catgttacgg 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tgactagtgt gtgtcattgc ta 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 碱基兼并
<222> (14)..(14)
<223> R代表A或G
<400> 7
acctgcacat gcarggacaa ttggc 25

Claims (6)

1.一种检测高致病性H7N9突变病毒的引物和探针，其特征在于，所述引物的序列为SEQID NO:1-2和5-6，所述探针的序列为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，和SEQ ID NO:7；其中每条序列的5’端和3’端都带荧光标记，三条探针的5’端和3’端所带的荧光标记均不一样。
2.一种检测高致病性H7N9突变病毒的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1的引物和探针。
3.一种高致病性H7N9突变病毒的检测方法，其特征在于，使用了权利要求1所述的引物和探针或使用了权利要求2所述的试剂盒。
4.权利要求3所述高致病性H7N9突变病毒的检测方法，其特征在于，步骤为，
提取待检物的DNA；
将上述DNA作为模板进行荧光PCR：使用权利要求1所述的引物和探针或使用权利要求2所述的试剂盒；
根据结果进行判断。
5.权利要求3所述高致病性H7N9突变病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR的反应体系为：
6.权利要求3所述高致病性H7N9突变病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR的反应程序为50℃2min；95℃10min；95℃15s,55℃1min,40个循环。
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