CN106319093A - 利用数字pcr检测马铃薯m病毒的方法及其专用成套试剂 - Google Patents

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CN106319093A CN201610972544.3A CN201610972544A CN106319093A CN 106319093 A CN106319093 A CN 106319093A CN 201610972544 A CN201610972544 A CN 201610972544A CN 106319093 A CN106319093 A CN 106319093A
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黄洁芳
付伟
朱鹏宇
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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Abstract

本发明公开了利用数字PCR检测马铃薯M病毒的方法及其专用成套试剂。本发明所提供的成套试剂由引物对X1和探针PVM‑p组成；所述引物对X1由引物PVM‑f和引物PVM‑r组成；引物PVM‑f是序列表中序列1所示的单链DNA分子；引物PVM‑r是序列表中序列2所示的单链DNA分子；探针PVM‑p的序列为序列表中序列3，探针PVM‑p的5′末端具有FAM荧光标记，3′末端具有TAMRA荧光标记。实验证明，采用本发明所提供的方法数字PCR检测马铃薯M病毒，特异性好且灵敏度高，适用于潜隐病症和病毒含量低的样品中PVM的检测，具有重要的应用价值。

Description

利用数字PCR检测马铃薯M病毒的方法及其专用成套试剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用数字PCR检测马铃薯M病毒的方法及其专用成套试剂。
背景技术
马铃薯是世界上种植和食用国家最多的作物，也是在全球经济中继水稻、小麦和玉米之后的第4大粮食作物。马铃薯是全世界的高产作物之一，中国种植马铃薯面积居全世界第一位。近年来，我国马铃薯产业发展迅速，马铃薯在我国国民经济增长中占有重要比重，但我国现阶段马铃薯整体生产水平低于世界平均水平，其主要原因便是受马铃薯病毒的影响。马铃薯M病毒(potato virus M，PVM)是一种马铃薯病毒，属香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，为正单链RNA病毒，其在马铃薯生产上引起重要的质量性病害，并造成严重的经济损失：PVM弱毒株系危害的症状为小叶脉间花叶，小叶尖端稍扭曲，叶缘呈波状，病株顶叶有些卷叶或叶面无光泽，造成的产量损失为10％-18％；PVM强毒株系危害的症状为幼苗期小叶表面带有油脂状光泽，同时小叶迅速开始向下卷曲，叶背出现条斑坏死，随着马铃薯生长发育，下部叶片出现不规则的坏死斑点，并很快黄化至干枯，枯叶下垂现象似马铃薯Y病毒的垂叶坏死症，病株严重萎缩和矮化，造成的产量损失可达40％-75％。因此，PVM是国际上重要的检疫性有害生物，是马铃薯产业发达国家种薯认证中严格管制的有害生物。
目前，针对马铃薯M病毒主要采用指示植物法、血清法和RT-PCR等方法进行检测。指示植物法技术准确、直观、易于操作，但耗时长，已不能适应生产需要。血清法中以ELISA应用最广，虽然ELISA可以在短时间内检测大量样品，但不同株系的抗体却不容易获得，同时季节性的变化常阻碍阳性与阴性样品的区分，存在着假阳性或假阴性现象。RT-PCR不用制备抗体，而且省时又省力，已经用于PVM的检测，但对病毒浓度低的样品(如韧皮部样品和休眠未出芽或自然老的块茎)却不足以做出可靠的诊断，即灵敏度较低。
数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的PCR检测方法，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，针对反应结果采用泊松分布(Poissondistribution)公式，便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测马铃薯M病毒。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测马铃薯M病毒的成套试剂。
本发明所提供的检测马铃薯M病毒的成套试剂，可由引物对X1和探针PVM-p组成；所述引物对X1可由引物PVM-f和引物PVM-r组成；所述引物对X1的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段可为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
y2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述探针PVM-p可为20-30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段中的部分区段相同。
上述成套试剂中，所述引物PVM-f可为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子。
上述成套试剂中，所述引物PVM-r可为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子。
上述成套试剂中，所述探针PVM-p可为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
上文中，所述y2)、所述a2)、所述b2)或所述c2)中，所述“经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加”可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述成套试剂中，所述探针PVM-p的末端可具有荧光标记。
上述成套试剂中，所述探针PVM-p的末端具有荧光标记具体可为所述探针PVM-p的5′末端具有FAM荧光标记和/或3′末端具有TAMRA荧光标记。
上述成套试剂中，所述引物PVM-f、所述引物PVM-r和所述探针PVM-p的摩尔比具体可为2：2：1。
上述成套试剂中，所述引物PVM-f、所述引物PVM-r和所述探针PVM-p的量具体可如下：0.5μmol所述引物PVM-f、0.5μmol所述引物PVM-r和0.25μmol所述探针PVM-p。
上述成套试剂中所述引物对X1也属于本发明的保护范围。
上述引物对X1中，所述引物PVM-f和所述引物PVM-r的摩尔比具体可为1：1。
上述引物对X1中，所述引物PVM-f和所述引物PVM-r的量具体可如下：0.5μmol所述引物PVM-f和0.5μmol所述引物PVM-r。
c1)或c2)也属于本发明的保护范围：
c1)上述成套试剂的制备方法，为将上述成套试剂中的所述引物PVM-f、所述引物PVM-r和所述探针PVM-p分别单独包装；
c2)上述引物对X1的制备方法，为将上述引物对X1中各引物分别单独包装。
上述成套试剂或上述引物对X1的应用也属于本发明的保护范围。上述成套试剂或上述引物对X1的应用可为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)制备用于检测或辅助检测马铃薯M病毒的试剂盒；
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯M病毒；
d3)制备用于鉴定或辅助鉴定马铃薯M病毒的试剂盒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯M病毒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了含有上述成套试剂或上述引物对X1的试剂盒。
所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的应用可为如下d2)或d4)：
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯M病毒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯M病毒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测样品是否含有马铃薯M病毒的方法。
本发明所提供的检测待测样品是否含有马铃薯M病毒的方法，为A1)或A2)：
A1)以待测样品的cDNA为模板，以所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述cDNA的数字PCR，则待测样品中含有或疑似含有马铃薯M病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述cDNA的数字PCR，则所述待测样品不含有或疑似不含有马铃薯M病毒；
A2)以待测样品的cDNA为模板，以所述引物对X1进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X1可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有马铃薯M病毒；如果所述引物对X1不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有马铃薯M病毒。
上述方法中，所述待测样品可为植物样品。所述植物样品具体可为感染了PVM的马铃薯叶片、感染了马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)的马铃薯叶片、感染了马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)的马铃薯叶片、感染了烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的烟草叶片或感染了黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的黄瓜叶片。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯M病毒的方法。
本发明所提供的鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯M病毒的方法，可为B1)或B2)：
B1)以待测病毒的cDNA为模板，以所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述cDNA的数字PCR，则待测病毒为候选的马铃薯M病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述cDNA的数字PCR，则待测病毒为候选的非马铃薯M病毒；
B2)以待测病毒的cDNA为模板，以所述引物对X1进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X1可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的马铃薯M病毒；如果所述引物对X1不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的非马铃薯M病毒。
上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”的反应体系可包括：2×SuperMix、所述引物PVM-f、所述引物PVM-r、所述探针PVM-p和模板。所述模板可为将待测样品的总RNA反转录得到的cDNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA。
上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”的反应体系具体可由2×SuperMix、所述引物PVM-f、所述引物PVM-r、所述探针PVM-p、模板和水组成。所述模板可为将待测样品的总RNA反转录得到的cDNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA。
上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”的反应体系具体可为体系1或体系2。
20μL所述体系1可由10μL 2×SuperMix、引物PVM-f(浓度为0.4-0.6μM)、引物PVM-r(浓度为0.4-0.6μM)、探针PVM-p(浓度为0.2-0.3μM)、模板和无核酸酶水组成。所述模板可为将待测样品的总RNA反转录得到的cDNA或待测病毒的总RNA反转录得到的cDNA。
20μL所述体系1具体可由10μL 2×SuperMix、1μL引物PVM-f(浓度为10μM)、1μL引物PVM-r(浓度为10μM)、0.5μL探针PVM-p(浓度为10μM)、2μL模板和5.5μL无核酸酶水组成。所述模板可为将待测样品的总RNA反转录得到的cDNA。
所述体系2可为向所述体系1中加入数字PCR反应用油得到的体系。
所述体系2可为20μL向所述体系1中加入70μL数字PCR反应用油得到的体系。
上文中，所述2×SuperMix和所述数字PCR反应用油均可为美国Bio-Rad公司的产品。
上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”和所述“进行PCR扩增”的退火温度可为55-60℃(如58℃)。
上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”的反应程序具体可为：50℃热激活5min；95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火及延伸60s，40个循环。
上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”可在数字PCR反应系统中进行。
上述任一所述的方法中，所述“进行数字PCR”具体可在Bio-Rad数字PCR反应系统(Bio-Rad QX200)中进行；Bio-Rad数字PCR反应系统(Bio-Rad QX200)为美国Bio-Rad公司的产品。
针对马铃薯M病毒设计检测马铃薯M病毒的成套试剂，并基于该成套试剂建立了利用数字PCR检测马铃薯M病毒的方法。实验证明，采用本发明所提供的方法数字PCR检测马铃薯M病毒，特异性好(可从PVM、PVX、PVY、TMV、CMV中准确鉴定出PVM)且灵敏度高(在20μL反应体系中，灵敏度可达9拷贝/μL)，适用于潜隐病症和病毒含量低的样品中PVM的检测，具有重要的应用价值。
附图说明
图1为特异性实验结果。
图2为灵敏度实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)为Takara公司的产品，产品目录号为RR064A。One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)在下文中简称实时荧光一步RT-PCR试剂盒。
PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)为Takara公司的产品，产品目录号为RR037A。PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)在下文中简称反转录试剂盒。
植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品，货号为DP432。
数字PCR相关反应试剂耗材和Bio-Rad数字PCR反应系统(Bio-Rad QX200)均为美国Bio-Rad公司的产品；数字PCR相关反应试剂耗材包括2×SuperMix、数字PCR微滴生成卡和数字PCR反应用油；Bio-Rad数字PCR反应系统(Bio-Rad QX200)包括PCR仪、DropletGenerator微滴生成器和Droplet Reader微滴读取仪。
马铃薯M病毒(Potato Virus M，PVM)记载于如下文献中：张永江，刘忠梅，燕照玲，刘洪义，马洁，陈林，辛言言，马云霞.宁夏固原地区马铃薯M病毒的检测鉴[J].河南农业科学，2013，08:79-81+85.。公众可从中国检验检疫科学研究院(即申请人)处获得。
马铃薯X病毒(potato virus X，PVX)和马铃薯Y病毒(potato virus Y，PVY)均记载于如下文献中：魏梅生，刘洪义，李桂芬，陈燕芳.马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒胶体金免疫层析试纸条的研制[J].植物保护，2006，32(6)：139-141.。公众可从中国检验检疫科学研究院(即申请人)处获得。
烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)记载于如下文献中：张永江，马荣群，辛言言，黄粤.烟草花叶病毒属条形码鉴定方法的建立[J].湖北农业科学，2015，54(11)：2624-2627.。公众可从中国检验检疫科学研究院(即申请人)处获得。
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)记载于如下文献中：李桂芬，朱水芳，周群，施宗伟，张永江，李明福.侵染紫松果菊的黄瓜花叶病毒分离物鉴定[J].植物保护2007，33(1)54-56.。公众可从中国检验检疫科学研究院(即申请人)处获得。
实施例1、检测马铃薯M病毒的成套试剂的制备
检测马铃薯M病毒的成套试剂由引物对X1和探针PVM-p组成。引物对X1由引物PVM-f：5′-CCGGAGCTCACTAGAGATTA-3′(序列表中序列1)和引物PVM-r：5′-CTGAAGAGGCACACATAGC-3′(序列表中序列2)组成。探针PVM-p为：5′-FAM-TGAAGGACGTAACCAAGGTGGCTTTACT-TAMRA-3′(序列表中序列3)。探针PVM-p的5′末端具有FAM荧光标记，3′末端具有TAMRA荧光标记。
检测马铃薯M病毒的成套试剂中，引物PVM-f、引物PVM-r和探针PVM-p分别独立包装。成套试剂中，引物PVM-f、引物PVM-r和探针PVM-p的摩尔比为2:2:1。
合成引物PVM-f、引物PVM-r和探针PVM-p。
实施例2、利用数字PCR检测马铃薯M病毒的方法的建立
1、待测样品的总RNA的提取
用植物总RNA提取试剂盒提取待测样品的总RNA，得到待测样品的总RNA。
2、待测样品的cDNA的获得
取待测样品的总RNA，按照反转录试剂盒说明书的步骤，采用实施例1合成的引物PVM-r进行反转录，获得待测样品的cDNA。
3、数字PCR扩增反应
(1)配制反应体系
反应体系甲为20μL，由10μL 2×SuperMix、1μL引物PVM-f、1μL引物PVM-r、0.5μL探针PVM-p、2μL待测样品的cDNA和5.5μL无核酸酶水组成；初始体系中，引物PVM-f的浓度为0.5μM，引物PVM-r的浓度为0.5μM，探针PVM-p的浓度为0.25μM。
反应体系乙(作为阴性对照)为20μL，用等体积的健康马铃薯的cDNA代替待测样品的cDNA，其它同反应体系甲。
健康马铃薯的cDNA的制备方法如下：用植物总RNA提取试剂盒提取健康马铃薯的叶片的总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书的步骤，采用实施例1合成的引物PVM-r进行反转录，得到健康马铃薯的cDNA。
反应体系丙(作为空白对照)为20μL，用等体积的无核酸酶水代替待测样品的cDNA，其它同反应体系甲。
(2)完成步骤(1)后，将反应体系(反应体系甲、反应体系乙或反应体系丙)转移至数字PCR微滴生成卡的体系加样孔中，并在反应用油加样孔中加入70μL的数字PCR反应用油(在加样过程中，应避免在孔底产生气泡)。
(3)完成步骤(2)后，将所述数字PCR微滴生成卡转移至Droplet Generator微滴生成器中，启动仪器，得到微滴体系。
(4)完成步骤(3)后，将所述微滴体系转移至96孔板中，封膜。
(5)完成步骤(4)后，将所述96孔板置于PCR仪中，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。反应程序：50℃热激活5min；95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火及延伸60s，40个循环。
(6)完成步骤(5)后，将所述96孔板取出，置于Droplet Reader微滴读取仪中进行微滴荧光读取，然后通过FAM单通道荧光收集单个微滴荧光信号。
(7)完成步骤(6)后，仪器通过分析热点图确定荧光阈值限并自动确定阴性微滴和阳性微滴。然后进行如下判断：
如果待测样品产生阳性微滴信号，则待测样品含有马铃薯M病毒；如果待测样品不产生阳性微滴信号，则待测样品不含有马铃薯M病毒。
实施例3、特异性检测
按照实施例2的方法，进行特异性检测。待测样品为0.1g感染了PVM的马铃薯叶片、0.1g感染了PVX的马铃薯叶片、0.1g感染了PVY的马铃薯叶片、0.1g感染了TMV的烟草叶片或0.1g感染了CMV的黄瓜叶片。2μL待测样品的cDNA中，DNA含量均为440ng/μL。
实验结果见图1(A09和B09均为PVM，C09和D09均为PVX，E09和F09均为PVY，G09和H09均为TMV，A08和B08均为CMV，C08为阴性对照，D08为空白对照)。结果表明，仅感染了PVM的马铃薯叶片产生阳性微滴，其它待测样品、阴性对照和空白对照均不产生阳性微滴(此时判定为阳性微滴的荧光阈值限为968，低于968的微滴仪器判断为阴性，高于968的微滴仪器判断为阳性)。因此，仅感染了PVM的马铃薯叶片含有马铃薯M病毒，与预期结果完全一致。
上述结果表明，实施例1所提供的检测马铃薯M病毒的成套试剂的特异性高。
实施例4、灵敏度检测
1、用植物总RNA提取试剂盒提取感染了PVM的马铃薯叶片的总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书的步骤，采用实施例1合成的引物PVM-r进行反转录，获得感染了PVM的马铃薯叶片的cDNA。将感染了PVM的马铃薯叶片的cDNA命名为稀释液1(稀释度记为100)。
2、完成步骤1后，取1体积份稀释液1，加入9体积份的无核酸酶水，混合均匀，得到稀释液2(稀释度记为10-1)；以此类推制成稀释液3(稀释度记为10-2)、稀释液4(稀释度记为10-3)、稀释液5(稀释度记为10-4)、稀释液6(稀释度记为10-5)、稀释液7(稀释度记为10-6)、稀释液8(稀释度记为10-7)和稀释液9(稀释度记为10-8)。
3、完成步骤2后，按照实施例2步骤3的方法，进行灵敏度检测。待测样品的cDNA为步骤2制备的稀释液6、稀释液7、稀释液8或稀释液9。
实验结果见图2(A02和B02均为稀释液6，C02和D02均为稀释液7，E02和F02均为稀释液8，G02和H02均为稀释液9，C03和D03为空白对照)。结果表明，稀释液6、稀释液7和稀释液8中均产生阳性微滴，稀释液9和空白对照均不产生阳性微滴(此时判定为阳性微滴的的荧光阈值限为0，低于0的微滴仪器判断为阴性，高于0的微滴仪器判断为阳性)。稀释液6、稀释液7、稀释液8和稀释液9中含有PVM模板的拷贝数依次分别为900拷贝/μL、90拷贝/μL、9拷贝/μL和0.9拷贝/μL，因此，实施例1所提供的检测马铃薯M病毒的成套试剂在上述反应体系中的的灵敏度为9拷贝/μL。
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 利用数字PCR检测马铃薯M病毒的方法及其专用成套试剂
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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ccggagctca ctagagatta tgtaaagtct aatagaaaat gaaggacgta accaaggtgg 60
ctttacttat agcgagagct atgtgtgcct cttcag 96

Claims (10)

1.检测马铃薯M病毒的成套试剂，由引物对X1和探针PVM-p组成；所述引物对X1由引物PVM-f和引物PVM-r组成；所述引物对X1的靶序列含有特异DNA片段；所述特异DNA片段为如下y1)或y2)：
y1)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
y2)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述探针PVM-p为20-30个核苷酸组成的单链DNA分子，与所述特异DNA片段中的部分区段相同。
2.如权利要求1所述成套试剂，其特征在于：
所述引物PVM-f为如下a1)或a2)：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
所述引物PVM-r为如下b1)或b2)：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
所述探针PVM-p为如下c1)或c2)：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
3.如权利要求1或2所述成套试剂，其特征在于：所述探针PVM-p的末端具有荧光标记。
4.权利要求1或2所述成套试剂中的所述引物对X1。
5.c1)或c2)：
c1)权利要求1至3任一所述成套试剂的制备方法，为将权利要求1至3任一所述成套试剂中的所述引物PVM-f、所述引物PVM-r和所述探针PVM-p分别单独包装；
c2)权利要求4所述引物对X1的制备方法，为将权利要求4所述引物对X1中各引物分别单独包装。
6.权利要求1至3任一所述成套试剂或权利要求4所述引物对X1的应用，为如下d1)或d2)或d3)或d4)：
d1)制备用于检测或辅助检测马铃薯M病毒的试剂盒；
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯M病毒；
d3)制备用于鉴定或辅助鉴定马铃薯M病毒的试剂盒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯M病毒。
7.含有权利要求1至3任一所述成套试剂或权利要求4所述引物对X1的试剂盒。
8.权利要求7所述试剂盒的应用，为如下d2)或d4)：
d2)检测或辅助检测待测样品中是否含有或疑似含有马铃薯M病毒；
d4)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯M病毒。
9.一种检测待测样品是否含有马铃薯M病毒的方法，为A1)或A2)：
A1)以待测样品的cDNA为模板，以权利要求1至3任一所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述cDNA的数字PCR，则待测样品中含有或疑似含有马铃薯M病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述cDNA的数字PCR，则所述待测样品不含有或疑似不含有马铃薯M病毒；
A2)以待测样品的cDNA为模板，以权利要求4所述引物对X1进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X1可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测样品中含有或疑似含有马铃薯M病毒；如果所述引物对X1不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则所述待测样品不含有或疑似不含有马铃薯M病毒。
10.一种鉴定待测病毒是否为候选的马铃薯M病毒的方法，为B1)或B2)：
B1)以待测病毒的cDNA为模板，以权利要求1至3任一所述成套试剂进行数字PCR，然后进行如下评判：如果所述成套试剂可以实现对所述cDNA的数字PCR，则待测病毒为候选的马铃薯M病毒；如果所述成套试剂不能实现对所述cDNA的数字PCR，则待测病毒为候选的非马铃薯M病毒；
B2)以待测病毒的cDNA为模板，以权利要求4所述引物对X1进行PCR扩增，然后进行如下评判：如果所述引物对X1可以实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的马铃薯M病毒；如果所述引物对X1不能实现对所述cDNA的PCR扩增，则待测病毒为候选的非马铃薯M病毒。
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