CN105803092A - 转基因苜蓿草kk179-2品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

转基因苜蓿草kk179-2品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了转基因苜蓿草KK179‑2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。本发明基于转基因苜蓿草KK179‑2的5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计检测引物和探针，建立了转基因苜蓿草KK179‑2品系特异性实时定量荧光PCR检测方法，该检测方法定量检测下限为20copy/μL的转基因苜蓿草品系KK179‑2基因组DNA，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为105％，重复性好，具有特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确并可定量检测的优点，适用对转基因苜蓿草KK179‑2进行品系特异性筛查，可为我国出入境口岸对进境转基因苜蓿草的监管提供有力技术支撑。

Description

转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
苜蓿草(Alfalfa)是美国继玉米、小麦、大豆后第四大农作物，因其蛋白含量约占总干草质量的17％～20％，在美国及全球都是一种重要的饲料作物，全球种植面积约3000万公顷，转基因苜蓿草KK179-2是由孟山都公司和Forage Genetics International(FGI)开发的转基因低木质素苜蓿品种，商品名为HarvXtraTM，2014年11月10日获得美国农业部(USDA)动植物卫生检疫局(APHIS)批准种植。2014年5月1日，澳新食品标准局(FSANZ)批准转基因苜蓿草KK179-2用于食品。转基因苜蓿草KK179-2目前尚未获得我国农业部转基因生物安全证书。
与传统苜蓿相比，KK179-2的木质素最高可减少22％，更加容易被草食动物消化。低木质素的苜蓿品系KK179-2不同于传统的苜蓿之处在于其基因组中插入了一个咖啡酰CoA甲基转移酶(Caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase,CCOMT)编码序列，CCOMT是参与G型木质素生物合成路径的酶。该片段引入的方式为反向重复序列，表达时可以产生双链RNA，从而产生RNA干扰(RNA interference,RNAi)，抑制内源CCOMT RNA的翻译及CCOMT酶的水平，导致KK179-2的G木质素含量降低进而减少苜蓿木质素整体含量。
目前我国奶牛存栏数为1500万头，对优质饲草需求量非常大。转基因苜蓿草通过饲料进入动物养殖的食物链，存在一定食品安全风险。为保障消费者的知情权，转基因产品标识制度在30多个国家和地区应用。凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。目前各国强制标识的转基因限量各不相同。欧盟和俄罗斯为0.9％，韩国和日本分别是3％和5％，中国目前实施无阀值的强制性标识制度。
转基因产品标识制度的实施需要相应检测方法作为支撑。品系特异性检测方法是基于外源插入片段和宿主基因接合区的边界序列建立特异性的检测方法，品系特异性检测可以区分转化于同一类质粒的不同基因品系，如油菜的Rf1和Rf2，被认为是最适合转基因标识的检测判定方法。zimmmermanm等首次使用inverse PCR策略获得Bt11的接合区序列并建立品系特异性检测方法。目前已有多种转基因作物品系如大豆A2704-12、A5547-127、转基因油菜品系Topasl9/2、转基因棉花GHB119、转基因水稻B2A68等建立了相关的品系特异性检测方法。
目前对转基因产品的检测应用最广泛的是荧光PCR检测技术，相较普通PCR技术，它具更高的灵敏度、特异性和稳定性。可通过荧光信号的积累实现实时监测整个PCR进程，而后通过扩增曲线和标准曲线对未知模板进行定性或定量分析。
有效的检测方法是转基因监管的技术支撑，而目前缺少转基因苜蓿草KK179-2品系特异性的检测方法，因此急需开发相应的检测方法以满足转基因苜蓿草KK179-2品系监管的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。
本发明基于KK179-2的5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针，建立了转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时定量荧光PCR检测方法，适用于对转基因苜蓿草KK179-2进行品系特异性筛查。
本发明的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'(如SEQ ID NO.1所示)；
KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明还提供了转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'(如SEQ ID NO.3所示)，检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
优选，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为TAM。
本发明的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'(如SEQ ID NO.1所示)；
KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'(如SEQ ID NO.2所示)；
所述的检测探针如下所示：
KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'(如SEQ ID NO.3所示)，检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
本发明的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA的作为模板；
(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因苜蓿草KK179-2。
优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，10μmol/L检测引物KK179-2-F和KK179-2-R各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，检测探针KK179-2-P 0.6μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.4μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因苜蓿草KK179-2的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品中含有转基因苜蓿草KK179-2；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品中不含有转基因苜蓿草KK179-2。
本发明还提供转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取转基因苜蓿草KK179-2基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物、检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应；
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始浓度的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到转基因苜蓿草KK179-2标准曲线；
(3)提取待检样品的DNA，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物、检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入转基因苜蓿草KK179-2标准曲线，计算得到待检样品中转基因苜蓿草KK179-2基因组DNA的量。
本发明根据转基因苜蓿草品系KK179-2 5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针，建立的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法定量检测下限为20copy/μL的转基因苜蓿草品系KK179-2基因组DNA，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为105％，重复性实验显示本方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，具有特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确并可定量检测的优点，适用对转基因苜蓿草KK179-2进行品系特异性筛查，可以满足转基因苜蓿草KK179-2品系监管的需求，可为我国出入境口岸对进境转基因苜蓿草的监管提供有力技术支撑。
附图说明
图1是转基因苜蓿草KK179-2品系外源插入片段示意图，其中，Genome:苜蓿草基因组DNA；LB和RB:质粒的左和右边界序列；PAL2:苯丙氨酸解氨酶基因启动子；CCOMThp:咖啡酰CoA甲基转移酶序列；nos:nos终止子；A为本发明扩增边界片段。
图2是实时荧光PCR特异性测试，A为采用acc-F/R/P引物和探针进行实时荧光PCR的结果，其中：1为acc-KK179-2，2为非转基因大叶苜蓿，3为转基因苜蓿草J101，4为转基因苜蓿草J163，5-12依次分别为：转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系NK63、转基因玉米品系BT11、转基因大豆GTS40-3-2、转基因大米cry IA(a/b)、非转基因小麦和非转基因油菜籽；B为采用KK179-2-F/R/P引物和探针进行实时荧光PCR的结果，其中：1为acc-KK179-2，2-12依次分别为：非转基因大叶苜蓿、转基因苜蓿草J101、转基因苜蓿草J163、转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系NK63、转基因玉米品系BT11、转基因大豆GTS40-3-2、转基因大米cry IA(a/b)、非转基因小麦和非转基因油菜籽。
图3是转基因苜蓿草KK179-2品系特异性序列扩增曲线及标准曲线，A为转基因苜蓿草KK179-2品系特异性序列扩增曲线，其中1-8依次分别为以2×107copy/μL～2×100copy/μL起始浓度的acc-KK179-2质粒DNA为模板得到的扩增曲线；B为KK179-2品系特异性序列扩增标准曲线。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系NK63、转基因玉米品系BT11、转基因大豆GTS40-3-2、转基因大米cry IA(a/b)、非转基因大叶苜蓿、小麦和油菜籽由本实验室储备，转基因苜蓿草J101、转基因苜蓿草J163由广东出入境检验检疫局保存。本实验室将acc和KK179-2双基因片段(该片段序列如SEQ ID NO.4所示，含本发明检测方法所需的acc基因和KK179-2检测序列共449bp)克隆入的PUC57质粒载体，得到的重组质粒命名为acc-KK179-2质粒，备用。
主要试剂：Premix Ex Taq TM(TaKaRa)；质粒DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；引物和探针由英潍捷基公司合成，稀释为终浓度为10μmol/L的工作液使用。
主要仪器：ABI7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)、微量分光光度计(nanodrop2000c，美国)、研磨机(IKA,德国)。
农作物材料样品基因组DNA采用常规方法提取与纯化。
acc-KK179-2质粒DNA的制备：吸取2mL含acc-KK179-2质粒的菌液，使用天根质粒DNA提取试剂盒并按照其操作说明书提取质粒DNA，用微量分光光度计nanodrop2000c测定其浓度。4℃保存备用。
选择苜蓿内源基因acc(acetyl CoA carboxylase)(参考文献：Alexander TW et al.,2007)引物和探针acc-F/R/P用于检测苜蓿样品基因组DNA是否成功提取以及是否适于进行实时荧光PCR扩增；其序列(参考文献：Charlene Levering et al.,2014)信息详见表1。
实施例1：建立转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法
转基因苜蓿草KK179-2外源插入片段元件组成见图1。
基于转基因苜蓿草KK179-2品系基因组DNA的5’端外源插入片段与苜蓿基因组DNA之间的邻接区序列分析，使用PrimerEXpress 3.0软件(AppliedBiosystems，USA)设计引物和探针，将设计的引物和探针在NCBI网站数据库中进行Blast比对，确定引物和探针理论上的特异性，由此设计了多对品系特异性引物和探针。引物和探针均由英潍捷基公司合成。以acc-KK179-2质粒DNA为模板，通过对引物和探针的反应效率、扩增曲线和扩增效果进行筛选和分析，最终选择KK179-2-F/R/P引物和探针建立转基因苜蓿草KK179-2品系特异性检测方法，其序列信息详见表1。
表1引物和探针序列
所采用的实时荧光PCR检测反应体系为20μL：Premix Ex TaqTM 10μL，10μmol/L检测引物KK179-2-F和KK179-2-R各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，检测探针KK179-2-P 0.6μL，acc-KK179-2质粒DNA模板2μL和ddH2O 6.4μL。实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环；并于60℃收集荧光信号；反应在荧光PCP仪上进行。
实施例2
1、实时荧光PCR检测方法的特异性
利用转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系NK63、转基因玉米品系BT11、转基因大豆GTS40-3-2、转基因大米cry IA(a/b)、非转基因大叶苜蓿、小麦、油菜籽、转基因苜蓿草J101、转基因苜蓿草J163和acc-KK179-2质粒DNA为模板，利用实施例1的实时荧光PCR检测反应体系(Premix Ex TaqTM 10μL，10μmol/L检测引物KK179-2-F和KK179-2-R各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，检测探针KK179-2-P 0.6μL，acc-KK179-2质粒DNA模板2μL和ddH2O 6.4μL)和程序(95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，并于60℃收集荧光信号)进行扩增，进行特异性检测。
采用acc-F/R/P引物和探针(实时荧光PCR检测反应体系和程序同实施例1，只是检测引物和检测探针为acc-F、acc-R和acc-P)对所有提取的农作物材料DNA样品进行实时荧光PCR，只有非转基因大叶苜蓿，转基因苜蓿草J101，转基因苜蓿草J163和acc-KK179质粒来源的DNA模板出现扩增曲线，其他无典型扩增曲线，表明苜蓿内源基因acc扩增结果正确(图2A)。采用KK179-2品系特异性KK179-2-F/R/P引物和探针进行实时荧光PCR时，只有acc-KK179质粒的DNA模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料DNA为模板的均无典型荧光扩增曲线(图2B)。
2、实时荧光PCR检测方法标准曲线建立
为了对样品中转基因苜蓿草KK179-2成分进行相对定量分析，对KK179-2品系特异性片段建立了标准曲线。将提取的acc-KK179-2质粒DNA溶液用TE缓冲液梯度稀释至2×107copy/μL～2×100copy/μL，以稀释的不同浓度的质粒DNA为模板进行实时荧光PCR扩增(实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1，只是模板量不同)，建立KK179-2品性特异性实时荧光PCR标准曲线。
结果表明，KK179-2品系特异性序列扩增的线性回归方程为y＝-3.2092x+42.429(其中y对应为Ct值，x对应为lg(copy)，此处copy表示DNA模板起始浓度即每μL中的copy数)，线性相关系数(R2)为0.99，扩增效率E为105％(图3A，B)，表明标准曲线的线性良好，扩增效率良好。标准曲线的R2大于0.98，高于定量检测标准曲线相关系数的要求，因此说明本发明建立的方法适合于转基因苜蓿草KK179-2的定量分析。
3、实时荧光PCR检测方法检测KK179-2的灵敏度测试
将提取的acc-KK179质粒DNA溶液用TE缓冲液梯度稀释至2×107copy/μL～2×100copy/μL，对这8个浓度DNA进行实时荧光PCR扩增(实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1，只是模板量不同)，每个浓度设置9个平行重复，利用本研究设计的KK179-2品系特异性检测引物和探针KK179-2-F/R/P和苜蓿内源基因acc引物和探针acc-F/R/P进行实时荧光PCR扩增，得到定量检测下限(LOQ)。
结果如表2所示。以20copy/μL浓度的DNA为模板时，9次平行扩增反应均出现扩增，Ct值标准偏差(SD)值为0.4，以2copy/μL浓度的DNA为模板时，无扩增曲线，即本研究建立的KK179-2品系特异性荧光PCR检测方法的定量下限LOQ为20copy/μL的acc-KK179质粒DNA。
表2实时荧光PCR检测KK179-2品系的重复性和灵敏度试验
4、实时荧光PCR检测方法检测KK179-2的可重复性测试
采用10倍稀释浓度梯度2×105copy/μL～2×102copy/μL的acc-KK179质粒DNA共4个浓度为模板，分别进行实时荧光PCR(实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1，只是模板量不同)，每个浓度采用9个平行，对本发明建立的方法的可重复性进行了测试，对平行重复的标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)进行了统计分析。
结果表明，4组9次平行重复Ct值的标准偏差(SD)介于0.06～0.15，相对标准偏差(RSD)介于0.18％～0.53％均在可接受的范围之内，表明本发明建立的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法具有很好的可重复性，数据见表2。

Claims (8)

1.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'；
KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'。
2.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：
KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'，检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为TAM。
4.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
KK179-2-F：5’-TCGAATCAAACCACAATTGATA-3'；
KK179-2-R：5’-TGACCATCATACTCATTGCTGA-3'；
所述的检测探针如下所示：
KK179-2-P：5’-TTCCCGGACATGAAGCCATTTACA-3'，检测探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
5.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品的DNA作为模板；
(2)加入权利要求1所述的的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因苜蓿草KK179-2。
6.根据权利要求5所述的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：Premix Ex TaqTM 10μL，10μmol/L检测引物KK179-2-F和KK179-2-R各0.4μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，检测探针KK179-2-P 0.6μL，DNA模板2μL和ddH2O 6.4μL；所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
7.根据权利要求5所述的转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品中是否含有转基因苜蓿草KK179-2的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品中含有转基因苜蓿草KK179-2；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品中不含有转基因苜蓿草KK179-2。
8.一种转基因苜蓿草KK179-2品系特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取转基因苜蓿草KK179-2基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应；
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始浓度的常用对数(lg)呈线性关系，据此得到转基因苜蓿草KK179-2标准曲线；
(3)提取待检样品的DNA，加入与步骤(1)中相同体系的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入转基因苜蓿草KK179-2标准曲线，计算得到待检样品中转基因苜蓿草KK179-2基因组DNA的量。
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