CN112195260B - 一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112195260B
CN112195260B CN202011096570.7A CN202011096570A CN112195260B CN 112195260 B CN112195260 B CN 112195260B CN 202011096570 A CN202011096570 A CN 202011096570A CN 112195260 B CN112195260 B CN 112195260B
Authority
CN
China
Prior art keywords
alfalfa
detection
real
pcr
fluorescent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011096570.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112195260A (zh
Inventor
刘二龙
李志勇
卢丽
关丽军
王毅谦
郑冠津
牟桂萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huangpu Customs Technical Center
Guangzhou Customs Technology Center
Original Assignee
Huangpu Customs Technical Center
Guangzhou Customs Technology Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huangpu Customs Technical Center, Guangzhou Customs Technology Center filed Critical Huangpu Customs Technical Center
Priority to CN202011096570.7A priority Critical patent/CN112195260B/zh
Publication of CN112195260A publication Critical patent/CN112195260A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112195260B publication Critical patent/CN112195260B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、方法和试剂盒。本发明筛选苜蓿单拷贝基因PO22特异性序列设计引物和探针，建立苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高、可重复性良好等优点，最低定量检测下限为24拷贝。该方法可应用于苜蓿易混品中苜蓿成分的鉴别检测，还可作为苜蓿内源基因检测方法应用于转基因苜蓿定性及定量检测。

Description

一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法。
背景技术
紫花苜宿(Medicago sativa.)作为优质的豆科牧草，其蛋白含量约占总干草质量的17％～20％，广泛应用于奶牛、肉牛、赛马等动物的饲养中，有“牧草之王”之称。
目前在鉴别苜蓿易混样品方面，如农业中苜蓿种子纯度检测，因草木犀种子与苜蓿种子在形态学较难区分，有研究者建立了检测草木犀和紫花苜蓿的普通PCR方法[1]，但其仅用于确认苜蓿品种，未提供该引物与其他物种的鉴别检测的数据，此外采用该普通PCR进行苜蓿鉴定，需进行PCR后进行琼脂糖凝胶电泳等步骤，检测周期长且灵敏度相较实时荧光PCR方法无优势。
此外，目前在转基因苜蓿定性检测中，通常需要同时检测该物种的内源基因识别测试样品中的植物种类，监控DNA提取的质量起到阳性质控作用；另外在转基因定量检测特别是数字PCR定量检测中，需测定内源基因拷贝数，通过外源基因和内源基因拷贝数比值进而对转基因产品进行定量。
ALEXANDER等[2]研究了苜蓿acetyl CoA carboxylase(acc)基因作为苜蓿转基因检测的内源参考基因，据Southern Blot分析，该基因在每个单倍体基因组中以2个拷贝存在[3]。通常转基因检测时均选择低拷贝数或单拷贝的基因作为内源参考基因，该内源基因具2个拷贝而不是单拷贝基因，在拷贝数定量时需进行换算，对于背景不清楚的检测者可能误算而造成定量检测结果有误，因此给检测者带来不便；此外低拷贝基因通常表明该基因在不同品系之间的拷贝数变化较小，突变率较低，具有较强的稳定性[4]，目前苜蓿转基因检测中尚无可靠的单拷贝内源基因。
[1]刘志鹏，马利超，王彦荣.鉴定紫花苜蓿种子真伪的试剂盒及其检测方法[P].CN102643896A,2012-08-22.
[2]Qualitative and Quantitative Polymerase Chain Reaction Assays foran Alfalfa(Medicago sativa)-Specific Reference Gene To Use in MonitoringTransgenic Cultivars.
[3]Shorrosh,B.S.；Dixon,R.A.；Ohlrogge,J.B.Molecular cloning,characterization,and elicitation of acetyl-CoA carboxylase from alfalfa.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1994,91,4323-4327.
[4]Hernandez,M.；Duplan,M.-N.；Berthier,G.；Vaitilingom,M.；Hauser,W.；Freyer,R.；Pla,M.；Bertheau,Y.Development and comparison of four real-timepolymerase chain reaction systems for specific detection and quantificationof Zea mays L.J.Agric.Food Chem.2004,52,4632-4637.
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴别苜蓿成分的实时荧光PCR检测引物、探针、试剂盒和检测方法。
本发明的第一个目的是提供一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测引物，所述的检测引物如下所示：
M1-PO22-F：5'-GATCGAATCTGCACTTCCTCAA-3'(如SEQ ID NO.1所示)
M1-PO22-R：5'-CTCAAATCCTATCCGTCACCACTT-3'(如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测探针，所述的检测探针如下所示：M1-PO22-P：5'-AAACCGCACAAAGATGGTGAATCACAAAA-3'(如SEQ ID NO.3所示)，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
优选地，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
本发明的第三个目的是提供一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，所述的检测引物如下所示：
M1-PO22-F：5'-GATCGAATCTGCACTTCCTCAA-3'；
M1-PO22-R：5'-CTCAAATCCTATCCGTCACCACTT-3'；
所述的检测探针如下所示：
M1-PO22-P：5'-AAACCGCACAAAGATGGTGAATCACAAAA-3'，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
本发明的第四个目的是提供一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测方法，该检测方法包括以下步骤：
(1)提取样品的基因组DNA作为模板；
(2)加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为苜蓿。
所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex Taq 12.5μL，ROXReference Dye II 0.2μL，10μmol/L检测引物M1-PO22-F和M1-PO22-R各0.5μL，10μmol/L检测探针M1-PO22-P 0.5μL，DNA 模板2μL和ddH2O 8.8μL。
所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为苜蓿的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为苜蓿；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是苜蓿。
本发明的第五个目的是提供一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR定量检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)提取苜蓿的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应；
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数lg呈线性关系，据此得到该线性范围内苜蓿的标准曲线及线性方程；
(3)提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤(1)中相同体系的权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤(2)获得的苜蓿的标准曲线方程，计算得到待检样品中苜蓿基因组DNA的含量(拷贝数或质量)。
本发明的第六个目的是提供上述的检测引物和检测探针在制备检测苜蓿成分的试剂盒中的应用。
本发明的第七个目的是提供上述的检测试剂盒在鉴别苜蓿成分中的应用。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
1、本发明针对苜蓿特异性序列设计引物和TaqMan探针，建立苜蓿实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本发明的方法进行检测发现其定量检测下限为24拷贝，建立的标准曲线线性相关系数(R2)为0.98，扩增效率E为110％，重复性实验显示本方法的标准偏差(SD)及相对标准偏差(RSD)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强，可满足对苜蓿进行品系特异性检测鉴定的需求。
2、采用本发明的实时荧光PCR方法，可应用于苜蓿易混品中苜蓿成分的鉴别检测，还可作为苜蓿内源基因检测方法应用于转基因苜蓿定性及定量检测，可以解决苜蓿从种子到干草各种形态及加工产品的鉴别问题，不但可适用于种子如草木犀种子等形态相似的种子的鉴别检测，也可适用于形态学难以区分的干草，如燕麦草及其加工品鉴别；或其加工压制的颗粒物等难以依靠形态学鉴定的产品中苜蓿成分的鉴别检测，根据本发明建立的苜蓿含量与Ct值的线性关系，可实现苜蓿成分的定量检测。
附图说明
图1是苜蓿特异性检测灵敏度试验扩增图；从左至右1～6分别为300000、30000、3000、300、60和12copies/μL DNA。
图2是实时荧光PCR检测苜蓿的标准曲线，Quantity表示DNA模板量(拷贝数)对数。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
主要材料：苜蓿、草木犀、高梁、剪股颖、燕麦、高羊芽、结缕草、马尼拉、天堂草、早熟禾、大豆、大麦、小麦为本实验室购置和储备。
选择苜蓿PO22基因特异性片段设计引物和探针，其序列信息详见表1
主要试剂：Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大连宝生物；DNA提取试剂盒，北京天根公司；引物和探针由闪晶生物公司合成，稀释为终浓度为10μM的工作液使用。
主要仪器与设备：
ABI7500，ABI7500FAST实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；QX 200微滴式数字PCR系统，美国伯乐公司；nanodrop2000c微量分光光度计，美国Thermo公司；研磨机，德国IKA。
作物材料样品基因组DNA采用常规方法提取与纯化。
实施例1：实时荧光PCR检测方法的建立
根据苜蓿PO22基因特异性片段(如SEQ ID NO.4所示)(参考文献：Yongzhong Wu,Xiao Qui,Sarah Du,Larry Erickson.Cloning and characterization of PO22,apollen-expressed gene in alfalfa[J].Plant Molecular Biology,1996,32(6))，应用Primer Primer 5.0软件设计引物和探针。具体引物探针信息见表1。
表1实时荧光PCR的引物、探针
扩增反应体系为25μL：包括Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II 0.2μL，10μmol/L上游引物和下游引物各0.5μL，10μmol/L检测探针0.5μL，DNA模板2μL和ddH2O8.8μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
实施例2：实时荧光PCR方法特异性测试
采用苜蓿、草木犀、高梁、剪股颖、燕麦、高羊芽、结缕草、马尼拉、天堂草、早熟禾、大豆、大麦、小麦基因组DNA为模板，阳性样品为恰特草DNA，阴性对照为玉米DNA，空白对照为不加DNA模板。对苜蓿内源基因实时荧光PCR检测方法的特异性进行测试。实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。
结果显示，采用苜蓿特异性引物M1-PO22-F/R和探针M1-PO22-P对所有提取的样品的DNA进行实时荧光PCR时，只有苜蓿样品的DNA模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料DNA为模板的均无典型荧光扩增曲线(表2)。表明本发明的检测方法特异性良好。
表2引物及探针特异性测试结果
注：+，阳性；-，阴性。
实施例3：灵敏度测试、可重复性测试
将提取的苜蓿DNA溶液加TE缓冲液分别稀释至300000、30000、3000、300、60和12copies/μL作为模板，进行线性范围测试及可重复性测试，每个梯度进行3次重复实验，水为空白对照，实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。测试结果显示(表3和图1)，在600000-24copies范围内6个浓度梯度3个平行均能有典型扩增曲线。在模板量24-600000copies范围内6个梯度的对数值与所得Ct值建立标准曲线(图2)，线性回归方程为：y＝-3.1058x+41.214，R2＝0.9872，扩增效率为110％(介于90％～110％)，表明在24-600000copies范围线性相关性和扩增效率良好，均符合相关要求[Definition of MinimumPerformance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing]。表3中6个浓度各3个平行所得Ct值的SD介于0.17～0.73，RSD介于0.48～2，均小于25％，显示重复性良好，其LOQ可达24拷贝。
表3实时荧光PCR方法的灵敏度及可重复性测试
本发明针对苜蓿单拷贝基因PO22特异性序列设计引物和探针，建立的苜蓿特异性实时荧光PCR检测方法，可对苜蓿进行特异性快速、高通量的定性及定量检测，也可作为数字PCR及实时荧光PCR定量检测时的内参基因，满足检测、监管部门对其进行标识和定量检测的需求。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广州海关技术中心
黄埔海关技术中心
<120> 一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatcgaatct gcacttcctc aa 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcaaatcct atccgtcacc actt 24
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaccgcaca aagatggtga atcacaaaa 29
<210> 4
<211> 180
<212> DNA
<213> 苜宿(Medicago)
<400> 4
gatcgaatct gcacttcctc aaatctaatc tttcaatttg gatcgaataa acaccacatt 60
gagaatggaa aataaaaaac aaaccgcaca aagatggtga atcacaaaat cgaaaatatc 120
tgaaaatcac ttatttaact aaataagaaa gaaaagtggt gacggatagg atttgagaag 180

Claims (9)

1.一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测引物探针组，其特征在于，包括检测引物和检测探针，所述的检测引物如下所示：
M1-PO22-F：5'-GATCGAATCTGCACTTCCTCAA-3'；
M1-PO22-R：5'-CTCAAATCCTATCCGTCACCACTT-3'；所述的检测探针如下所示：
M1-PO22-P：5'-AAACCGCACAAAGATGGTGAATCACAAAA-3'，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测引物探针组，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1。
3.一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：
M1-PO22-F：5'-GATCGAATCTGCACTTCCTCAA-3'；
M1-PO22-R：5'-CTCAAATCCTATCCGTCACCACTT-3'；
所述的检测探针如下所示：
M1-PO22-P：5'-AAACCGCACAAAGATGGTGAATCACAAAA-3'，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
4.一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取样品的基因组DNA作为模板；
（2）加入权利要求1所述的检测引物探针组，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；
（3）将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为苜蓿。
5.根据权利要求4所述的苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）的扩增反应体系为：25 μL，包括Premix Ex Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye II0.2 μL，10 μmol/L 检测引物M1-PO22-F和M1-PO22-R各0.5 μL，10 μmol/L 检测探针M1-PO22-P 0.5 μL，DNA 模板2 μL和ddH2O 8.8 μL；
所述的步骤（3）的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
6.根据权利要求4所述的苜蓿成分特异性实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（3）的根据扩增曲线判断样品是否为苜蓿的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为苜蓿；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是苜蓿。
7.一种苜蓿成分特异性实时荧光PCR定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取苜蓿的基因组DNA进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，加入权利要求1所述的检测引物探针组，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应；
（2）反应后得到各起始浓度模板对应的Ct值，该Ct值与起始模板量的常用对数lg呈线性关系，据此得到该线性范围内苜蓿的标准曲线及线性方程；
（3）提取待测样品的基因组DNA为模板，加入与步骤（1）中相同体系的权利要求1所述的检测引物探针组，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应后得到Ct值，将其代入步骤（2）获得的苜蓿的标准曲线方程，计算得到待检样品中苜蓿含量。
8.权利要求1所述的检测引物探针组在制备检测苜蓿成分的试剂盒中的应用。
9.权利要求3所述的检测试剂盒在鉴别苜蓿成分中的应用。
CN202011096570.7A 2020-10-14 2020-10-14 一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法 Active CN112195260B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011096570.7A CN112195260B (zh) 2020-10-14 2020-10-14 一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011096570.7A CN112195260B (zh) 2020-10-14 2020-10-14 一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112195260A CN112195260A (zh) 2021-01-08
CN112195260B true CN112195260B (zh) 2023-09-29

Family

ID=74010048

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011096570.7A Active CN112195260B (zh) 2020-10-14 2020-10-14 一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112195260B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803092A (zh) * 2016-05-04 2016-07-27 黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心 转基因苜蓿草kk179-2品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN108411030A (zh) * 2018-05-25 2018-08-17 兰州大学 引物对及包含其的试剂盒、用途和检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105803092A (zh) * 2016-05-04 2016-07-27 黄埔出入境检验检疫局综合技术服务中心 转基因苜蓿草kk179-2品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN108411030A (zh) * 2018-05-25 2018-08-17 兰州大学 引物对及包含其的试剂盒、用途和检测蒺藜苜蓿生态型a17和r108的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cloning and characterization of PO22, a pollen-expressed gene in alfalfa;Yongzhong Wu等;Plant Molecular Biology;第第32卷卷;第1205-1207页 *
Yongzhong Wu等.Cloning and characterization of PO22, a pollen-expressed gene in alfalfa.Plant Molecular Biology.1996,第第32卷卷第1205-1207页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112195260A (zh) 2021-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Passricha et al. Assessing zygosity in progeny of transgenic plants: current methods and perspectives
CN108728581B (zh) 同时检测5种甘蔗病毒的多重rt-pcr方法及其引物和试剂盒
CN112195260B (zh) 一种苜蓿成分鉴定检测用引物、探针、试剂盒和检测方法
CN102134602A (zh) 转Xa21基因水稻或其制品检测用引物和探针、试剂盒及方法
EP1335027B1 (en) Method of quantifying genetic modification and standard molecule to be used therein
Mano et al. Development and validation of event-specific quantitative PCR method for genetically modified maize MIR604
US9797004B2 (en) Methods and compositions for determination of vector backbone in a nucleic acid sample
CN105112538A (zh) 转基因玉米mir162双重数字pcr荧光定量检测方法
CN105112530A (zh) 转基因玉米bt176双重数字pcr荧光定量检测方法
CN107142322A (zh) 转基因玉米mon87403品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
CN107254526A (zh) 转基因玉米mon87411品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
CN107475391B (zh) 北极苹果特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
CN109628632A (zh) 一种用于转基因玉米mon87419品系特异性检测的引物组合、探针、试剂盒及方法
CN112251519A (zh) 鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的特异性引物和探针、试剂盒及方法
KR101218435B1 (ko) 유전자 변형 식물의 스크리닝 방법
CN117431333A (zh) 一种转基因马铃薯特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
CN114350833A (zh) 转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
CN115976250A (zh) 转基因大豆mon87712品系实时荧光定量检测引物、检测方法和试剂盒
CN102482697B (zh) 用于定量生物样品中dna的改良方法
CN113957159B (zh) 一种用于检测西伯利亚鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN107164514A (zh) 转基因甜菜gtsb77品系特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
CN114507750B (zh) 一种检测玉米转基因品系的引物组、试剂盒及检测方法
CN114657276B (zh) 检测水稻转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法
CN113957158B (zh) 一种用于检测施氏鲟线粒体基因的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN111733280B (zh) 一种转基因棉花cot102品系的双重荧光定量pcr检测

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant