CN111733280B

CN111733280B - 一种转基因棉花cot102品系的双重荧光定量pcr检测

Info

Publication number: CN111733280B
Application number: CN202010736864.5A
Authority: CN
Inventors: 李想; 钱昌元; 左翠花; 尹璐; 潘志霖
Original assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Current assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2040-07-28
Also published as: CN111733280A

Abstract

本发明提供了一种转基因棉花COT102品系的双重荧光定量PCR检测。本发明的方法包括同时针对两种目标基因进行扩增，所述的两种目标基因包括COT102基因和ACP1基因，根据扩增情况来确定棉花COT102转基因品系的存在情况或存在量，或测定转基因品系的存在比例。本发明的方法一方面解决了现有技术中没有针对棉花COT102品系的双重PCR定量检测方法的问题；另一方面针对该转基因品系的特点，确立了效果优异的检测试剂、优化了检测方法，检测效率非常高。本发明对构建和完善中国转基因产品定量检测技术体系具有重要的实用价值和示范作用，可作为阈值管理的技术储备。

Description

一种转基因棉花COT102品系的双重荧光定量PCR检测

技术领域

本发明属于PCR荧光检测领域，更具体地，本发明涉及一种转基因棉花COT102品系的双重荧光定量PCR检测方法。

背景技术

转基因作物自1996年开始商业化规模种植，截至2018年底，全球累积种植面积达25亿hm²。至2018年底，全球共有26个国家和地区种植转基因作物，面积达1.917亿hm²，约是1996年的113倍；另有44个国家和地区进口转基因农产品。其中，转基因棉花种植面积为2490万hm²，占全球棉花总种植面积的76％。随着转基因作物在全球范围内的大规模种植和消费，越来越多的转基因作物用于食品或饲料的生产加工。由于公众对转基因产品潜在生物安全性和食用安全性的持续关注，为了保障消费者的知情权和选择权，越来越多的国家和地区开始实施转基因产品标识管理制度，并设定了标识阈值。目前，中国实行最严格的零阈值转基因产品强制标识制度。为了保障标识制度的顺利实施，建立转基因产品检测方法至关重要。

棉花是一种重要的经济作物，在食品和工业领域有诸多用途。棉籽油工业的主产品成品棉籽油是一种优质的食用植物油，含有大量人体必需的脂肪酸，同时又具有很好的起酥性，被誉为不含反式脂肪酸的天然起酥油；其副产品脱酚棉籽蛋白和饲用棉籽粕是重要的饲用蛋白原料；副产品棉籽壳是中国食用菌行业最主要的培养基原料。

目前，中国转基因植物种植面积位居世界第7位。中国一直重视转基因产品管理，目前仅有转基因棉花和番木瓜在中国批准商业化种植。同时，为了维护中国进境转基因农产品的安全性，中国农业转基因生物安全管理办公室会对进口转基因作物进行严格的安全性评估，通过后颁发农业转基因生物安全证书，而进口的转基因产品只能用作加工原料。随着中国棉籽(粕)进口量的逐年增加，口岸急需对各转基因品系进行检测监管，以防止农业转基因生物安全证书上未标明品系非法进入中国。同时，因目前国家标准和行业标准中均没有该品系的检测方法，因此针对COT102品系建立检测方法也为棉花及其来源产品转基因成分检测相关标准的完善提供技术支撑。

转基因棉花COT102品系是瑞士先正达公司研发的具有抗虫性状的转基因棉花品系，自2005年起陆续在美国、澳大利亚、新西兰等11个国家被批准用作食用或饲用原料，分别于2005、2017和2018年在美国、哥斯达黎加和澳大利亚被批准种植。该品系于2015年获得中国农业转基因生物安全证书，批准进口用作食用和饲用原料。目前针对该品系的检测方法仅有农业部2630号公告-9-2017。该标准规定了COT102品系的普通PCR和实时荧光PCR定性检测方法。

为了满足口岸检得快、检得准的要求，需开发针对转基因棉花COT102品系的高效率检测方法，尤其是能够实现定量和转基因组分含量比例计算的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转基因棉花COT102品系的双重荧光定量PCR检测方法及其应用。针对现有技术缺乏针对转基因棉花COT102品系的高效率检测方法，本发明建立了转基因棉花COT102品系双重定量检测方法，实现该品系成分的定性、定量检测，提高检测效率，降低检测成本，提升通关效率，为进境转基因棉花及其制品的有效监管和标识制度的顺利实施提供有效的技术保障。

在本发明的第一方面，提供一种同时检测两种目标基因以确定棉花成分及其种型的方法，包括：以待测样品的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系中包括：外源基因试剂组(a)：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的探针(COT102-3-FP/RP/P)；和内源基因试剂组(b)：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的引物和SEQ ID NO:24所示的探针(ACP1-F/R/P)；若试剂组(a)和试剂组(b)发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因棉花COT102品系的成分；若试剂组(a)不发生特异性扩增，试剂组(b)发生特异性扩增，则表明待测样品含有棉花成分，但不包含转基因棉花COT102品系的成分；若试剂组(a)和试剂组(b)均不发生特异性扩增，则表明待测样品中不存在棉花成分。

在一个优选例中，所述的方法为定量方法，当试剂组(a)和试剂组(b)发生特异性扩增时，分别确定试剂组(a)和试剂组(b)的扩增量，从而得出转基因棉花COT102品系的成分的含量或含量比例。

在另一优选例中，通过PCR扩增反应后产生的荧光强度来确定扩增量。

在另一优选例中，所述的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针携带荧光标记，且两者的荧光标记不同。

在另一优选例中，SEQ ID NO:6所示的探针，以FAM作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团。

在另一优选例中，SEQ ID NO:24所示的探针，以HEX作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团。

在另一优选例中，扩增体系中，试剂组(a)中引物和探针的用量比试剂组(b)中引物和探针的用量多20～80％；较佳地多30～70％；更佳地多40～60％。

在另一优选例中，所述的引物和探针的用量以摩尔数(如mol或umol)计。

在另一优选例中，扩增体系中，以HR qPCR Master Mix作为PCR预混液。

在另一优选例中，所述的待测样品包括(但不限于)：植物(棉花)活体、植物加工材料(加工品，如食品、饲料或服装等)、植物提取物或活性部位。

在另一优选例中，PCR扩增体系主要由PCR预混液、引物以及探针组成；较佳地，所述的PCR预混液中含有实时荧光PCR反应所需的试剂，包括MgCl₂、聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液。

在本发明的另一方面，提供一种用于同时检测两种目标基因以确定棉花成分及其种型的试剂盒，其中包括：外源基因试剂组(a)：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的探针(COT102-3-FP/RP/P)；和，内源基因试剂组(b)：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的引物和SEQ ID NO:24所示的探针(ACP1-F/R/P)。

在一个优选例中，所述的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针携带荧光标记，且两者的荧光标记不同。

在另一优选例中，该试剂盒中，试剂组(a)中引物和探针的量比试剂组(b)中引物和探针的量多20～80％；较佳地多30～70％；更佳地多40～60％。

在另一优选例中，所述的引物、探针被独立地分装于不同容器中，或被混合配制于容器中。

在另一优选例中，其中还包括(但不限于)选自下组的一种或多种：PCR预混液；DNA提取试剂；PCR缓冲液；或使用说明书。较佳地所述PCR预混液为HR qPCRMaster Mix。

在另一优选例中，所述PCR扩增中，退火温度59±1℃；较佳地59±0.5℃。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的试剂盒的应用，用于：同时检测两种目标基因以确定棉花成分及其种型，所述的目标基因为COT102基因(外源基因)以及ACP1(内源基因)。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的试剂盒的应用，用于：定性或定量地鉴定待测样品种是否存在转基因棉花COT102品系的成分，或确定转基因棉花COT102品系在待测样品中的比例。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、植物内源基因18S rDNA扩增曲线。

图2、外源基因引物和探针扩增曲线，除了引物探针有异，PCR体系其它条件均相同；

A为引物和探针COT102-FP/RP/P的扩增结果；

B为引物和探针COT102-3-FP/RP/P的扩增结果；

C为引物和探针COT102-5-FP1/RP/P的扩增结果。

图3、特异性测试扩增曲线；

A为棉花内源基因ACP1的扩增结果的特异性测试；

B为转基因棉花COT102品系特异性序列的扩增结果。

图4、根据本发明实施例3建立的标准曲线扩增曲线；

A为棉花内源基因ACP1的标准曲线扩增曲线；

B为转基因棉花COT102品系的标准曲线扩增曲线。

图5、根据本发明实施例3建立的标准曲线；

A为棉花内源基因ACP1标准曲线；

B为转基因棉花COT102品系标准曲线。

图6、根据本发明实施例4建立的盲样测试扩增曲线。

图7A-B、COT102-3-FP/RP/P组和COT102-FP/RP/P组的双重扩增的扩增曲线。

具体实施方式

PCR被广泛地运用于各种核酸样本的检测中，但随着人们对于检测准确性要求的趋高，以及不同检测对象自身基因的复杂性，其稳定性、准确性常常会无法满足精细检测的需要。

在实时荧光PCR的建立过程中，一方面，对感兴趣的基因进行扩增的靶区段对于检测效果有极大的影响；对于棉花品系的检测而言，鉴于棉花品系的多样性、目前本领域存在大量转基因棉花品系，以及野生型棉花和转基因棉花在基因序列上仍有高度的相似性，基因的同源性很高，找到一种适用于高效鉴定特定转基因品系的方法仍然是具有很高的技术难度的。本发明的技术方案的研究前期，本发明人发现针对靶基因的不同区段，进行PCR扩增时，扩增效率差距很大，利用常规设计软件设计的引物进行PCR扩增时特异性较差，易于发生非特异性结合，灵敏度降低，这就对筛选特异性且灵敏度好的检测试剂提出了很高的要求。

另一方面，引物和探针的设计也是难度很大的。不同基因之间由于引物和探针不同，导致与模板的结合效率或多或少有差异，这种差异在多重PCR中极易于被放大，直接影响扩增效率的优化。本技术方案的研究前期，本发明人也发现，引物对于不同的目标基因的结合效率存在差距，这阻碍了PCR的反应效率的提高，以及阻碍了检测的准确性、灵敏度等，易于造成假阳性或假阴性。

此外，引物选择的不合理或PCR体系的不合理，还会造成其它问题，例如引物二聚体的产生。特别是在双重或多种PCR检测体系中，正反向引物之间、两对或几对引物之间，需要避免它们之间形成二聚体。引物探针法检测时，尽管产生二聚体对信号的产生仅有一定影响、也能产生信号，但是扩增效率必然受影响，这阻碍了双重或多重PCR的推广。同时，探针尽管只需能在理论上识别扩增产物，但其常常由于AT含量不合适等原因导致与反应体系不匹配。

为了解决上述这些现有技术问题及其引申的问题，本发明人经过了反复的研究以及大量实验，建立了转基因棉花COT102品系特异性双重实时荧光定量PCR检测方法。本发明的方法包括同时针对两种目标基因进行扩增，根据扩增情况来确定棉花COT102转基因品系的存在情况或存在量，所述的两种目标基因包括COT102基因和ACP1基因。本发明的方法也可以用于测定转基因品系的存在比例。本发明的方法一方面解决了现有技术中没有针对棉花COT102品系的双重PCR定量检测方法的问题，可同时对棉花内源基因和转基因棉花COT102品系特异性序列进行定量检测以及进行后续分析；另一方面针对该转基因品系的特点，找到了特别有异的检测试剂、优化了检测方法，检测效率非常高。本发明对构建和完善中国转基因产品定量检测技术体系具有重要的实用价值和示范作用，可作为阈值管理的技术储备。

术语

如本文所用，“待测样本”、“待测样品”或“待测核酸(如DNA)样品”是指待检测的核酸样本，其中含有一种核酸或多种核酸，需要了解其中是否存在目标核酸。本发明中，所述的待测样品可包括(但不限于)：植物(棉花)活体、植物加工材料(加工品，如食品、饲料或服装等)、植物提取物或活性部位。

如本文所用，“目标基因”与“目标核酸”可互换使用，是指感兴趣的核酸/基因，或其片段。

如本文所用，“探针”是指一种具有已知核苷酸序列的单链核酸(本发明中优选RNA)，其具有与目标核酸基本上互补的核苷酸序列结构，可以与“目标核酸”形成双链。所述的“探针”可以携带标记物。例如，标记物可以连接在探针的5’末端或3’末端。

试剂及试剂盒

本发明人通过分析转基因棉花COT102品系的基因组、其转基因区域及其两端侧翼序列，对多种多样的位点区域进行研究排摸、以及与其它转基因与非转基因的物种进行序列比较。经过深入分析，选定了一些感兴趣的位置。本发明的试剂盒，可以实现双重PCR检测，从而实现对于转基因棉花COT102品系的定性和定量检测，具有很高的扩增效率。本发明的技术方案，不会因体系复杂而导致假阳性以及假阴性，特异性和灵敏度均非常理想。

基于本发明人的优化设计，提供了一系列引物和探针组合，该组合主要包括：外源基因试剂组(a)：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的探针(COT102-3-FP/RP/P)；以及，内源基因试剂组(b)：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的引物和SEQ ID NO:24所示的探针(ACP1-F/R/P)。

本发明的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。

本发明的探针携带有荧光标记物，从而便于进行荧光的甄别或检测。探针的前端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团，其中淬灭基团可淬灭荧光基团发出的荧光。当PCR扩增反应进行时，利用聚合酶的正向外切活性将带有荧光基团的碱基切离，游离后的荧光基团不再受淬灭基团的影响，在激发光的作用下可发射一定波长的荧光信号。随着PCR产物的不断积累，荧光信号不断地增强，从而可以检测到特定DNA的存在。

作为本发明的优选方式，SEQ ID NO:6所示的探针以FAM作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团；SEQ ID NO:24所示的探针，以HEX作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团。

本发明还提供了一种用于同时检测两种目标基因以确定棉花成分及其种型的试剂盒，所述试剂盒中含有外源基因试剂组(a)：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的探针(COT102-3-FP/RP/P)；以及，内源基因试剂组(b)：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的引物和SEQ ID NO:24所示的探针(ACP1-F/R/P)；其中，所述的两种目标基因包括COT102基因和ACP1基因。

此外，所述的试剂盒还可含有其它用于辅助鉴定转基因成分的核酸提取或PCR试剂，如(但不限于)：

(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等或它们的混合物；或PCR预混液，优选地HR qPCR Master Mix；或

(B)各种提取DNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或

(C)提取DNA的试剂盒。

此外，所述的试剂盒中还可含有鉴定棉花成分的使用说明书和/或标准操作程序，和/或核酸序列分析软件等。

本发明所述的试剂盒可实现快速检测、批量检测棉花成分的目的。

PCR方法

基于本发明所提供的适用于同时检测两种目标基因以确定棉花成分及其种型的特异性引物及探针，本发明还提供了一种鉴定方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系中包括：外源基因试剂组(a)：SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的探针(COT102-3-FP/RP/P)；和内源基因试剂组(b)：SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23所示的引物和SEQ ID NO:24所示的探针(ACP1-F/R/P)；若试剂组(a)和试剂组(b)发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因棉花COT102品系的成分；若试剂组(a)不发生特异性扩增，试剂组(b)发生特异性扩增，则表明待测样品含有棉花成分，但不包含转基因棉花COT102品系的成分；若试剂组(a)和试剂组(b)均不发生特异性扩增，则表明待测样品中不存在棉花成分。

利用所述的方法，可以进行定性测定和定量测定，也可以分析出待测样本中转基因棉花COT102品系成分的含量比例(占比)。在优选的方式中，当试剂组(a)和试剂组(b)发生特异性扩增时，分别确定试剂组(a)和试剂组(b)的扩增量，从而的得出转基因棉花COT102品系的成分的含量或含量比例；较佳地，通过PCR扩增反应后产生的荧光强度来确定扩增量。

聚合酶链反应(PCR)技术是本领域技术人员熟知的技术，其基本原理是体外酶促合成特异DNA片段的方法。本发明中，对PCR的体系、检测试剂均进行了优化改进。

针对前期研究中所发现的引物对于不同的目标基因的结合效率存在差距，从而影响扩增效率，阻碍检测的准确性和灵敏度的问题，本发明人提出了解决方案。因此，在本发明的优选的扩增体系中，试剂组(a)中引物和探针的用量比试剂组(b)中引物和探针的用量多20～80％；较佳地多30～70％；更佳地多40～60％；如多50％。

本发明人也发现，不同的PCR预混液对于PCR的荧光强度以及Ct值具体显著的影响。因此，作为本发明的优选方式，扩增体系中，以HR qPCR Master Mix作为PCR预混液。

在本发明的具体实施例中，以转基因棉花COT102品系为研究对象，根据其外源插入片段与基因组DNA的两端侧翼序列设计引物和探针，经筛选和优化后，建立了转基因棉花COT102品系特异性双重实时荧光定量PCR检测方法。该方法检测转基因棉花COT102品系特异性强，检测下限为5拷贝基因组DNA，定量下限为5拷贝基因组DNA。采用该方法对4个含有不同转基因棉花COT102品系成分的盲样进行了定量分析，检测结果的标准偏差、相对标准偏差、绝对误差和相对误差均在可接受范围内。

因此，本发明采用根据转基因棉花COT102品系3’端侧翼序列设计的引物和探针，建立了该品系特异性双重实时荧光定量PCR检测方法。该方法可同时对棉花内源基因和转基因棉花COT102品系特异性序列进行检测，检测效率高。对方法的适用性测试结果表明，建立的转基因棉花COT102品系双重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性、灵敏度、重复性、稳定性、精密度和准确度，能够有效地对转基因棉花COT102品系及其制品进行定性和定量检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

试验材料

转基因棉花(Gossypium)COT102(1012-C)、MON1445(0804-B)、MON15985(0804-D)、MON88913(0906-D)、LLCotton25(0306-E)和GHB614(1108-A)品系；转基因大豆(Glycinemax)MON87769(0809-B)品系；转基因油菜(Brassica campestris L.)GT73(48778)、MS8(0306-F5)和RF3(0306-G)品系以及常规非转基因棉花品种(0804-A)标准物质购自美国油脂化学家协会(American Oil Chemists’Society,AOCS)。转基因棉花T304-40(ERM-BF429c)品系；转基因玉米(Zea mays L.)MON810(ERM-BF413d)、NK603(ERM-BF415f)、Bt11(ERM-BF412f)和Bt176(ERM-BF411f)品系以及转基因大豆DAS44406-6(ERM-BF436e)品系标准物质购自欧盟联合研究中心标准物质与测量研究所(Institute for ReferenceMaterials and Measurements(IRMM),Joint Research Center(JRC)of EuropeanCommission)。转基因大米(Oryza sativa)TT51-1和LLRice62品系阳性品来自本实验室储备。

主要试剂

食品中核酸提取试剂盒Dneasy mericon Food Kit(50)购自德国QIAGEN GmbH公司。

实时荧光PCR预混液HR qPCR Master Mix购自上海辉睿生物科技有限公司；Hot-Start qPCR Mix购自上海纽思格生物科技有限公司；TaqMan Gene Expression MasterMix购自美国Applied Biosystems公司。

引物和探针购自宝生物工程(大连)有限公司。

无RNA酶和DNA酶的双蒸水(ddH₂O)购自美国Invitrogen公司。

DNA提取

取各转基因植物品系和常规非转基因棉花品种标准物质约200mg粉末，采用食物核酸提取试剂盒Dneasy mericon Food Kit(50)，根据试剂盒中的说明书，提取各植物材料基因组DNA。用微量分光光度计测定提取的DNA溶液的浓度，并通过OD₂₆₀/OD₂₈₀比值确定提取的DNA的纯度。提取的DNA溶液置于-20℃保存。

实时荧光PCR反应体系和条件

单重实时荧光PCR反应体系包括实时荧光PCR预混液；内(外)源基因引物和探针；DNA模板和ddH₂O。

双重实时荧光PCR反应体系包括实时荧光PCR预混液；内源基因引物和探针；外源基因引物和探针；DNA模板和ddH₂O。

实时荧光PCR扩增在AB ViiA 7实时荧光定量PCR仪上进行，反应参数为：50℃/2min；95℃/10min；95℃/15s，58℃/59℃/60℃/61℃/1min，40个循环。每一个循环产生的荧光信号在58℃/59℃/60℃/61℃/1min步骤收集。

得到的试验数据使用数据分析软件QuantStudio Real-Time PCR Software v1.2(Applied Biosystems公司)进行分析。

检测体系筛选和优化

首先对6对转基因棉花COT102品系特异性序列(即外源基因)引物和探针进行筛选。以同一转基因棉花COT102品系基因组DNA为模板进行双重实时荧光PCR扩增，每个反应体系设置4个平行重复。随后，将筛选出的转基因棉花COT102品系特异性序列引物和探针与3种棉花内源基因引物和探针分别进行不同比例的组合，筛选出适宜的组合。以同一转基因棉花COT102品系基因组DNA为模板进行双重实时荧光PCR扩增，每个反应体系设置4个平行重复，反应体系如表3所示。之后，对筛选出的引物和探针组合进行引物探针浓度和反应条件优化。以同一转基因棉花COT102品系基因组DNA为模板进行双重实时荧光PCR扩增，每个反应体系设置4个平行重复。

此外，考虑到双重实时荧光PCR扩增中预混液对扩增效率的影响，本发明对3种实时荧光PCR预混液HR qPCR Master Mix(Cat：SJ-2101B)、TaqMan Gene Expression MasterMix和Hot-Start qPCR Mix进行了比较。采用优化的内外源基因引物和探针组合，以同一转基因棉花COT102品系基因组DNA为模板进行双重实时荧光PCR扩增，每个反应体系设置4个平行重复。综合各试验结果，以获取优化的双重实时荧光PCR反应体系。

外源基因引物和探针筛选PCR反应体系如表1。内外源基因引物和探针筛选PCR反应体系如表2。

表1、外源基因引物和探针筛选PCR反应体系

表2、内外源基因引物和探针筛选PCR反应体系

特异性测试

为测试建立的转基因棉花COT102品系双重荧光定量PCR检测方法的特异性，本发明以19种植物材料，包括非转基因棉花品种；转基因棉花COT102、MON1445、MON15985、MON88913、LLCotton25、GHB614和T304-40品系；转基因大米TT51-1和LLRice62品系；转基因玉米Bt11、Bt176、MON810和NK603品系；转基因大豆MON87769和DAS44406-6品系及转基因油菜GT73、MS8和RF3品系的基因组DNA为模板分别进行双重实时荧光PCR扩增。

灵敏度测试

检测下限(LOD，检出率超过95％时能检测到的最低模板浓度)和定量下限(LOQ，在准确度和精密度处于可接受范围内时，可稳定定量的最低模板浓度)是评价检测方法优劣的两个重要指标，反映了方法的灵敏度。为测定建立的定量检测方法的LOD和LOQ，本发明采用0.1×Buffer EB(Dneasy mericon Food Kit中试剂)将同一转基因棉花COT102品系基因组DNA稀释至4个浓度，以COT102成分进行计算，则4个浓度分别对应5拷贝/μL、4拷贝/μL、2拷贝/μL和1拷贝/μL转基因棉花COT102品系基因组DNA。以4个浓度的转基因棉花COT102品系基因组DNA为模板，进行双重实时荧光PCR扩增，每个浓度设置4个平行重复，整个试验重复5次，即每个浓度均进行了20次反应。对试验结果进行统计分析，确定LOD和LOQ。

标准曲线建立和重复性测试

为对混合样品中转基因棉花COT102品系成分进行定量分析，本发明首先分别针对筛选出的棉花内源基因和转基因棉花COT102品系制备标准曲线。将提取的转基因棉花COT102品系标准品DNA用0.1×Buffer EB连续稀释至6个浓度：50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL和0.5ng/μL。根据DNA浓度和棉花单倍体基因组大小计算基因组DNA拷贝数，则上述6个浓度分别对应21540拷贝/μL、10770拷贝/μL、4308拷贝/μL、2154拷贝/μL、430.8拷贝/μL、215.4拷贝/μL单倍体棉花基因组DNA。采用优化的反应体系，以6个浓度的转基因棉花COT102品系基因组DNA为模板进行双重实时荧光PCR扩增，每个浓度设置4个平行重复，整个试验重复3次。去除与平均值之间偏差较大的Ct值(荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数)之后，以DNA拷贝数的以10为底的对数作为横坐标，相对应的Ct值作为纵坐标，分别建立筛选出的棉花内源基因和转基因棉花COT102品系的标准曲线。分别采用判定系数(R²)和扩增效率(E)对建立的标准曲线进行评价。同时，对试验结果进行统计分析，得到标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)数值，对方法的重复性进行了测试。

扩增效率可参照式(2-1)进行计算：

式中：slope——标准曲线的斜率。

盲样测定

制备4个含有不同转基因棉花COT102品系成分的混合样品S1、S2、S3和S4。分别称取0.50g转基因棉花COT102品系标准品(90.66％，m/m)粉末和4.03g非转基因棉籽粉末，充分混匀得到10％(m/m)样品S1；接着，分别称取0.50g样品S1和0.75g非转基因棉籽粉末，充分混匀得到4％(m/m)样品S2；然后，分别称取样品S2和非转基因棉籽粉末各0.50g，充分混匀后得到2％(m/m)样品S3；最后，分别称取样品S3和非转基因棉籽粉末各0.50g，充分混匀后得到1％(m/m)样品S4。随后，对4个混合样品进行定量检测，每个样品设置4个平行重复。对结果的SD值、RSD值、绝对误差和相对误差进行统计分析，验证建立的转基因棉花COT102品系双重荧光定量PCR检测方法的精密度和准确度。

转基因成分百分含量可参照式(2-2)进行计算：

转基因棉花COT102品系成分百分含量＝(转基因棉花COT102品系特异性片段拷贝数/棉花内源基因拷贝数)×100％(2-2)。

实施例1、DNA提取

所有提取的植物材料(包括前述“材料和方法”的“试验材料”中列举的所有植物材料)基因组DNA样品经微量分光光度计测定，浓度在30～200ng/μL之间，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间，DNA的浓度和纯度均良好。随后，为了确定提取的DNA样品是否适合PCR扩增，对植物内源基因18S rDNA进行了扩增，反应体系如表3所示，扩增曲线如图1所示。

表3、植物内源基因18S rDNA扩增PCR反应体系

结果显示，当采用引物和探针18S rDNA-F/R/P，以提取的各植物材料基因组DNA为模板进行单重实时荧光PCR扩增时，所有DNA样品均出现显著的扩增曲线，表明提取的DNA完整性良好。

实施例2、检测试剂、检测体系的筛选和优化

1、引物和探针优化筛选

本发明人分析了转基因棉花COT102品系(Genbank登录号CQ814630.1)的基因组、其转基因区域及其两端侧翼序列，对多种多样的位点区域进行研究排摸、以及与其它转基因与非转基因的物种进行序列比较。经过深入分析，选定了一些感兴趣的位置，主要如下：

针对3’端特异性侧翼序列部分区域，设计并合成了引物COT102-3-FP/RP和探针COT102-3-P。

针对5’端特异性侧翼序列部分区域、设计并合成了引物COT102-5-FP1/RP1、COT102-5-FP12/RP12、COT102-5-FP13/RP13和COT102-5-FP2/RP2，以及探针COT102-5-P1和COT102-5-P2。

此外，发明人进一步合成了用于检测转基因棉花COT102品系特异性序列：引物COT102-FP/RP和探针COT102-P。

发明人用荧光报告基团FAM标记探针18S rDNA-P、COT102-P、COT102-3-P、COT102-5-P1和COT102-5-P2的5’端；用荧光报告基团HEX标记探针ACP-P和AdhC-P的5’端。相应地，用淬灭基团BHQ1标记探针18S rDNA-P、ACP-P、AdhC-P、COT102-P、COT102-3-P和COT102-5-P1的3’端；用淬灭基团MGB标记探针COT102-5-P2的3’端。

经过上述的研究筛选，发明人感兴趣的并用于后续进一步筛选研究的引物和探针序列如表4所示。引物和探针用ddH₂O配制成100μmol/L的储备液，置于-20℃保存，使用时用ddH₂O将储备液稀释至终浓度为10μmol/L的工作液。

表4、实时荧光PCR引物和探针序列

对上述经深入分析后感兴趣的多对转基因棉花COT102品系特异性序列引物和探针进行进一步分析和筛选。外源基因引物和探针筛选PCR反应体系如前述表1(其中，预混液HR qPCR Master Mix，添加内源上下游引物各1uL，探针0.5uL，ddH₂O为5uL)。本实施例的检测中针对的DNA模板为：转基因棉花COT102品系DNA。

以Ct值与荧光信号综合分析，引物和探针COT102-FP/RP/P的扩增效果如图2A，曲线约在第22个循环后起跳，其荧光值(ΔRn)在后续达到约1,800,000。引物和探针COT102-5-FP1/RP/P的扩增效果如图2C，其曲线约在第22个循环后起跳，其荧光值(ΔRn)在后续达到约1,800,000。引物和探针COT102-3-FP/RP/P的扩增效果相对而言出乎意料地理想，其扩增曲线如图2B所示，曲线起跳早，约在第20个循环起跳，其荧光值(ΔRn)在后续可达到近2,750,000。而其它几组的引物和探针的检测结果，曲线起跳显著晚于COT102-3-FP/RP/P组，与COT102-5-FP1/RP/P近似。

在另一次实验中，本发明人比较了COT102-3-FP/RP/P组和COT102-FP/RP/P组的双重扩增效果。如图7A-B，外源(COT102-3-FP/RP/P)箭头所示的线是COT102-3-FP/RP/P组的扩增效果，外源(COT102-FP/RP/P)箭头所示的线是COT102-FP/RP/P组的扩增效果。明显看出，COT102-FP/RP/P组引物探针对外源基因的扩增曲线已经不是S型，而且无论外源还是内源基因的Ct值明显滞后，荧光值也低了很多。用两个PCR扩增Mix进行扩增，均得到了相同的结果。

2、双重实时荧光PCR反应体系优化

本发明将筛选出的转基因棉花COT102品系特异性序列引物和探针与多种棉花内源基因分别进行组合，进行双重实时荧光PCR扩增，以筛选出优选的组合。一些内源基因及其引物探针如下：

用于检测植物内源基因18S rDNA：引物18S rDNA-F/R和探针18S rDNA-P；

用于检测棉花内源基因ACP1：引物ACP1-F/R和探针ACP1-P；

用于检测棉花内源基因AdhC：合成了引物AdhC-F/R和探针AdhC-P。

本实施例的检测中针对的DNA模板为：转基因棉花COT102品系DNA。

具体的内源基因引物探针序列如表5。

表5

进行双重实时荧光PCR反应体系的反应，需要考虑两种目标基因在一个体系中的兼容性，应考虑互不干扰且尽可能促进扩增效果，这就对于应用于扩增两种目标基因的引物/探针试剂的设计提出较高的要求。根据发明人的综合分析以及实验论证，当引物和探针ACP1-F/R/P与COT102-3-FP/RP/P组合，并且该两种基因的引物探针浓度体积比为1:1.5时，扩增效果最好。

发明人在反复的实验观测中，发现反应体系中，针对ACP1以及COT102-3的扩增，其引物探针在有些比例下效果相对不够理想。这可能是由于两种目标基因自身条件、外源基因对内源基因存在抑制作用或两者存在相互抑制，在同一体系中产生扩增效率差异、使得荧光信号不是最理想而导致。因此，发明人对反应体系中引物和探针ACP1-F/R/P与COT102-3-FP/RP/P的体积比进行了多种比例的设计调整，对该组合进行了优化。结果表明，引物和探针ACP1-F/R/P与COT102-3-FP/RP/P体积比为1:1.5时，荧光信号最强且外源基因对内源基因的抑制作用也最小。

本发明人也考察了PCR扩增的退火温度，优化结果显示，59℃最佳，包括反应效率最高，荧光信号最强，S型曲线最明显，Ct值相对更小。

3、荧光PCR预混液比较

发明人还对3种实时荧光PCR预混液进行了比较。根据Ct值与荧光信号综合分析，采用HR qPCR Master Mix扩增效果最好，Ct值显著小，其能够显著提前曲线的起跳时间约1～2个循环数；并且，扩增曲线的荧光值高，反应效率非常高。因此，采用HR qPCR MasterMix作为预混液，实验测定操作中简便、节约时间、扩增效果最好。

综合各试验结果，得到优化的双重实时荧光PCR反应体系如表6所示。

表6、优化的双重实时荧光PCR反应体系

除非另外说明，后续的PCR扩增采用表6的优选体系。

实施例3、特异性及敏感性测定

本发明分别以19种植物材料(见前述“材料和方法”的“试验材料”部分)基因组DNA为模板，对建立的检测方法的特异性进行了测试，扩增曲线如图3所示。

1、特异性测试(双重PCR体系)

分别以19种植物材料基因组DNA为PCR扩增的模板。

棉花内源基因ACP1的扩增结果显示，只有棉花品系基因组DNA样品才有明显的扩增曲线，而其它植物品系基因组DNA样品均未出现扩增曲线(图3A)。利用转基因棉花COT102品系特异性序列的扩增结果显示，只有转基因棉花COT102品系基因组DNA样品才有显著的扩增曲线，而其它植物品系基因组DNA样品均未出现扩增曲线(图3B)。

结果表明，建立的转基因棉花COT102品系双重荧光定量PCR检测方法特异于该品系的检测。

2、灵敏度测试(双重PCR体系)

检测下限(LOD，检出率超过95％时能检测到的最低模板浓度)和定量下限(LOQ，在准确度和精密度处于可接受范围内时，可稳定定量的最低模板浓度)是评价检测方法优劣的两个重要指标，反映了方法的灵敏度。

以COT102品系DNA为PCR扩增的模板，对建立的定量检测方法的LOD和LOQ进行了测定，结果如表7所示。

表7、灵敏度测试结果

在4个不同模板量(25拷贝、20拷贝、10拷贝和5拷贝)的20次PCR反应中，当模板量≥5拷贝基因组DNA时，均得到20次阳性结果，表明低至5拷贝的模板DNA也可以稳定扩增出阳性曲线，且Ct值均小于35，表明扩增反应效率很高。棉花内源基因ACP1和转基因棉花COT102品系特异性序列的扩增结果表明，当模板量≥5拷贝COT102单倍体基因组DNA时，其RSD值均小于5％，也就是扩增的20次重复之间变异度非常小。

结果表明，本发明建立的定量检测方法的LOD为低于5拷贝基因组DNA，LOQ为低于5拷贝基因组DNA，能够达到针对极低浓度棉花检测体系中的检测和定量。

3、标准曲线的建立(双重PCR体系)

以6个不同浓度(50ng/μL、25ng/μL、10ng/μL、5ng/μL、1ng/μL和0.5ng/μL)的转基因棉花COT102品系基因组DNA为模板，分别建立了棉花内源基因ACP1和转基因棉花COT102品系的标准曲线，扩增曲线如图4所示，建立的标准曲线如图5A-B所示。棉花内源基因ACP1标准曲线的线性回归方程为y＝-3.23x+36.83，R²为0.99，反应效率E为104.03％；转基因棉花COT102品系标准曲线的线性回归方程为y＝-3.25x+37.08，R²为0.99，E为103.03％。两条标准曲线的R²均＞0.99，线性关系很好；反应效率E非常接近100％，效率很高。

结果表明，建立的两条标准曲线线性程度和扩增效率均接近理想值，适用于对转基因棉花COT102品系成分的定量分析。

4、可重复性分析

对上述6个不同浓度DNA的扩增结果进行统计分析，从而对建立的检测方法的重复性进行分析，结果如表8所示。

表8、检测方法重复性分析

分别统计分析6个DNA模板浓度在4次平行重复试验之间的标准偏差(SD^r)和相对标准偏差(RSD^r)以及3次重复试验之间的标准偏差(SD^R)和相对标准偏差(RSD^R)。

对于棉花内源基因ACP1，其SD^r值介于0.07至0.61之间，RSD^r值介于0.27％至2.68％之间；SD^R值介于0.01至0.24之间，RSD^R值介于0.02％至1.07％之间。对于转基因棉花COT102品系，其SD^r值介于0.05至0.55之间，RSD^r值介于0.23％至1.89％之间；SD^R值介于0.01至0.33之间，RSD^R值介于0.01％至1.18％之间。SD和RSD值均较低，表明各重复之间和多次实验之间数据变化小，可重复性非常好。

结果表明，建立的检测方法具有很好的重复性和稳定性。

实施例4、盲样测定

按照重量百分比制备4个含有不同含量转基因棉花COT102品系成分的盲样S1-S4(百分含量分别为10％，4％，2％，1％)，采用建立的检测方法对其中转基因棉花COT102品系成分的含量进行定量检测，扩增曲线如图6所示。

根据建立的标准曲线和转基因成分百分含量计算公式，计算出盲样中转基因棉花COT102品系成分的含量，并对结果进行了统计分析，如表9所示。

表9、盲样测定结果

根据表8，每个盲样4次重复之间的SD值介于0.05至0.41之间；RSD值介于4.05％至6.94％之间；4个盲样测定值与设定值之间的绝对误差分别为0.20、-0.11、-0.02和0.47；相对误差分别为2.03％、-2.69％、-0.87％和7.75％，均小于±25％，在可接受的理想范围内；说明建立的转基因棉花COT102品系双重荧光定量PCR检测方法可对低至1％含量的样品进行准确的定量检测。

结果表明，建立的转基因棉花COT102品系双重荧光定量PCR检测方法在对该品系成分进行定量时具有很高的精密度和准确性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 一种转基因棉花COT102品系的双重荧光定量PCR检测

<130> 204711

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

ccttaattct ccgctcat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

aaaacatgtg cagttgtg 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 3

cgtctccgag tccttctgtg a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Promer)

<400> 4

cgctcatgat cagattgtcg t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Promer)

<400> 5

cagaatcagt ctaggccgga 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 6

tcggtgtagg gaaagattgc ccat 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

ggcttcaaaa tgtagcgaca g 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

aaaaacgtcc gcaatgtgtt a 21

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 9

atggccgacg tcctcaaaag agaa 24

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

catgagattg tagagagata ccttgg 26

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

cgcaatgtgt tattaagttg tctaag 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 12

atggccgacg tcctcaaaag agaa 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

tgtagagaga taccttgggt ttga 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

tgtctaagcg tcaatttgtt tacc 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 15

atggccgacg tcctcaaaag agaa 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

tgccaaagca aaagatgagt aa 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

cgtccgcaat gtgttattaa gt 22

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 18

aaactttgaa agaaaac 17

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

cctgagaaac ggctacca 18

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

cgtgtcagga ttgggtaat 19

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 21

tgcgcgcctg ctgccttcct 20

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

attgtgatgg gacttgagga aga 23

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

cttgaacagt tgtgatggat tgtg 24

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 24

attgtcctct tccaccgtga ttccgaa 27

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

cacatgactt agcccatctt tgc 23

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

cccacccttt tttggtttag c 21

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 探针(Probe)

<400> 27

tgcaggtttt ggtgccactg tgaatg 26

Claims

1.一种同时检测两种目标基因以确定棉花成分及其种型的方法，所述目标基因为外源基因COT102及内源基因ACP1，所述方法包括：

以待测样品的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系中包括：

外源基因试剂组(a)：SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示的引物和SEQ ID NO: 6所示的探针；和

内源基因试剂组(b)：SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23所示的引物和SEQ ID NO: 24所示的探针；

若试剂组(a)和试剂组(b)发生特异性扩增，则表明待测样品中包含转基因棉花COT102品系的成分；

若试剂组(a)不发生特异性扩增，试剂组(b)发生特异性扩增，则表明待测样品含有棉花成分，但不包含转基因棉花COT102品系的成分；

若试剂组(a)和试剂组(b)均不发生特异性扩增，则表明待测样品中不存在棉花成分；

扩增体系中，试剂组(a)中引物和探针的用量比试剂组(b)中引物和探针的用量多40～60%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为定量方法，当试剂组(a)和试剂组(b)发生特异性扩增时，分别确定试剂组(a)和试剂组(b)的扩增量，从而得出转基因棉花COT102品系的成分的含量或含量比例。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，通过PCR扩增反应后产生的荧光强度来确定扩增量。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，SEQ ID NO: 6所示的探针，以FAM作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团；SEQ ID NO: 24所示的探针，以HEX作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增体系中，试剂组(a)中引物和探针的用量比试剂组(b)中引物和探针的用量多50%。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增体系中，以HR qPCR Master Mix作为PCR预混液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品包括：植物活体。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测样品包括：植物加工材料、植物提取物或活性部位。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中，退火温度59±1℃。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中，退火温度59±0.5℃。

11. 试剂盒在同时检测两种目标基因以确定棉花成分及其种型中的应用，所述目标基因为外源基因COT102及内源基因ACP1；所述试剂盒中包括：

其中，试剂组(a)中引物和探针的量比试剂组(b)中引物和探针的量多40～60%。

12. 如权利要求11所述的应用，其特征在于，SEQ ID NO: 6所示的探针，以FAM作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团；SEQ ID NO: 24所示的探针，以HEX作为特异性的荧光基团，以BHQ1作为对应的猝灭基团。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，该试剂盒中，试剂组(a)中引物和探针的量比试剂组(b)中引物和探针的量多50%。

14.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自下组的一种或多种：PCR预混液、DNA提取试剂、PCR缓冲液或使用说明书。

15. 如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述PCR预混液为HR qPCR Master Mix。

16.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述应用包括：定性或定量地鉴定待测样品种是否存在转基因棉花COT102品系的成分，或确定转基因棉花COT102品系在待测样品中的比例。