CN106086164A - 特异性检测转基因大豆gts 40‑3‑2的标准质粒分子及其应用 - Google Patents

特异性检测转基因大豆gts 40‑3‑2的标准质粒分子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性检测转基因大豆GTS 40‑3‑2的标准质粒分子，是以SEQ ID NO.1所示的大豆内源标准基因Lectin序列片段、SEQ ID NO.2所示的转基因大豆GTS 40‑3‑2结构和品系特异性序列35S‑CTP4，以及作为调控元件的部分CaMV35S启动子序列和部分NOS终止子序列作为外源序列，构建到pEASY‑T1质粒载体中形成的人工重组质粒分子pEASY‑T1‑GTS 40‑3‑2。本发明构建的标准质粒分子可以完全替代转基因大豆GTS 40‑3‑2阳性标准品，对转基因大豆GTS 40‑3‑2进行特异性核酸定性和定量检测，并可用于转基因调控元件CaMV35S和NOS序列片段的筛查。

Description

特异性检测转基因大豆GTS 40-3-2的标准质粒分子及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测转基因作物的标准质粒，特别是涉及一种特异性定性和定量检测转基因大豆GTS 40-3-2的标准质粒分子。
背景技术
转基因作物在全球范围内的广泛种植，促进了作物产量增加，缓解了人类贫困和饥饿以及因使用杀虫剂而带来的环境污染等问题，为全球特别是发展中国家和地区的经济、环境以及社会福利带来了持续可观的巨大利益。然而，生物安全性问题从转基因作物诞生之日起就与之相伴，其争论从未停止过。由于转基因作物及其产品的安全性仍然存在争议，世界各国在不同程度上加强了转基因生物安全的管理，相继制定法规并对转基因生物及其产品进行标识，各国标识的目的主要是为了保护消费者的知情权和选择权。
目前，基于核酸的检测方法已成为转基因生物检测的主要技术手段，这主要是由于核酸分子，特别是DNA分子的稳定性很强的缘故。转基因作物及其产品的核酸检测方法主要依据目的DNA所具有的特定功能表达基因以及其调控元件。主要的核酸检测方法包括实时荧光定量和定性PCR。PCR检测(依据不同的外源DNA)可以被归纳为四种类型：筛选通用元件检测(CaMV 35S启动子、FMV 35S启动子、NOS 终止子和NOS 启动子等)、基因特异性序列检测(Cry1Ab/Cry1Ac、CP4-EPSPS、pat和bar等)、构建特异性序列检测(MON 531、MON89788、TT 51-1和GA 21等)和品系特异性序列检测(GTS 40-3-2、Bt 176、GT 73和MON 1445等)。
在转基因成分的检测过程中，阳性标准物质非常重要，是定性和定量PCR检测中必需的对照。目前，获得商业化的转基因植物标准阳性样品非常困难，主要是由于知识产权和费用问题以及我国所批准的商业化种植转基因作物主要来源于国外一些公司。在实际检测中，阳性标准物质的缺乏是长期困扰我国转基因作物及其产品检测研究的主要原因。
标准分子是一种重组质粒分子，其包含转基因作物检测的外源基因或品系特异性片断以及物种特异性片断。由于操作简便，生产成本低、容易获得高纯度和高浓度DNA样品，且在一个标准分子中可以同时容纳多个目标序列，标准分子被认为是解决转基因作物及其产品检测标准物质缺乏的有效途径之一。
目前许多国内企业生产大豆油使用的大豆原料多是从美国、加拿大、巴西等国进口的转基因大豆。我国2014年进口大豆超过7100万吨，其中大部分是转基因大豆GTS 40-3-2。转基因大豆GTS 40-3-2品系由美国孟山都公司研发，是全球种植最广泛的转基因大豆品系。2004年，我国批准允许转基因大豆GTS 40-3-2进口用作食品或饲料加工原料。
为了给我国转基因大豆GTS 40-3-2品系监管提供必要的技术支撑，有必要开发适于转基因大豆GTS 40-3-2品系特异性定性和定量检测的稳定可靠的标准分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性检测转基因大豆GTS 40-3-2的标准质粒分子，将其作为阳性标准品，应用于转基因大豆GTS 40-3-2的定性定量检测和安全评价。
本发明通过对转基因大豆GTS 40-3-2品系的外源插入基因序列进行分析，设计重叠引物PCR扩增其结构特异性序列和品系特异性序列及大豆内源标准基因序列的特异性片段，通过分子克隆的方法插入到质粒载体中，构建人工重组质粒分子。
具体地，本发明是以pEASY-T1质粒载体作为标准质粒分子的骨架质粒，导入外源序列构建出特异性检测转基因大豆GTS 40-3-2的标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2，所述标准质粒分子的外源序列由SEQ ID NO.1所示的大豆内源标准基因Lectin序列片段、SEQID NO.2所示的转基因大豆GTS 40-3-2结构和品系特异性序列35S-CTP4，以及作为调控元件的部分CaMV 35S启动子序列和部分NOS终止子序列构成，其中，在特异性序列35S-CTP4中含有SEQ ID NO.3所示的转基因大豆GTS 40-3-2的品系特异性序列。
进一步地，所述调控元件中的部分CaMV 35S启动子序列如SEQ ID NO.4所示，部分NOS 终止子序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明最终构建的标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2重组质粒的大小为4647bp，其中含有如SEQ ID NO.6所示的，由所述4个基因序列片段融合形成的基因序列。
本发明所述标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2的构建方法是以标准GTS 40-3-2的DNA为模板，分别扩增Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4和NOS四个基因片段与pEASY-T1质粒载体连接，转入感受态细胞扩大培养得到所述四个基因的质粒DNA；利用重叠PCR引物扩增所述四个基因的质粒DNA，等比例混合后与pEASY-T1质粒载体连接，转入感受态细胞扩大培养，提取融合基因的质粒DNA，得到标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2。
其中，所述用于扩增Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4和NOS四个基因片段的引物分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.14所示，具体为：
Lectin S：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3’，
Lectin A：5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’；
CaMV 35S S：5’-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3’，
CaMV 35S A：5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3’；
NOS S：5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’，
NOS A：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’；
35S-CTP4 S：5’-TGATGTGATATCTCCACTGACG-3’，
35S-CTP4 A：5’-TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT-3’。
进一步地，所述重叠PCR引物的序列分别如SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.22所示：
Lectin F：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATC-3’，
Lectin R：5’-CAATGATGGCATTTGTAGGAGCGAAGGCAAGCCCATCTGCAAG-3’；
CaMV 35S F：5’-GCTCCTACAAATGCCATCATTG-3’，
CaMV 35S R：5’-GTCAGTGGAGATATCACATCAGATAGTGGGATTGTGCGTCATC-3’；
35S-CTP4 F：5’-TGATGTGATATCTCCACTGAC-3’，
35S-CTP4 R：5’-CTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATTGTATCCCTTGAGCCATGTTGTTA ATTTG-3’；
NOS F：5’-ATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3’，
NOS R：5’-TATCCTAGTTTGCGCGCTATATT-3’。
本发明采用重叠PCR技术，并设计特异性引物，通过基因的克隆、转化和表达，将转基因大豆GTS 40-3-2的结构特异性序列、品系特异性序列、调控元件及大豆内标准基因特异性片段构建在一个pEASY-T1质粒载体中，形成人工重组质粒分子pEASY-T1-GTS40-3-2。本发明构建的标准质粒分子高度特异于转基因大豆GTS 40-3-2结构、品系及筛选通用元件(部分启动子和终止子序列片段)的定性与定量PCR检测，能够完全替代转基因大豆GTS 40-3-2阳性标准品，用于特异性核酸定性和定量检测转基因大豆GTS 40-3-2，检测转基因大豆GTS 40-3-2品系的存在与否以及存在量，并用于其他含有转基因调控元件CaMV 35S和NOS序列片段的作物及其产品的筛查。
进而，本发明还提供了用于定性或定量检测转基因大豆GTS 40-3-2品系的试剂盒。
本发明所述的试剂盒中含有所述的标准质粒分子，以及用于扩增转基因大豆GTS40-3-2品系的定性和/或定量PCR引物，用于扩增调控元件CaMV 35S启动子和NOS终止子序列片段的定性和/或定量PCR引物。所述试剂盒中还含有PCR扩增相关试剂、电泳相关试剂、DNA分子量标记等必要的试剂。
附图说明
图1为本发明构建的标准质粒分子的结构示意图。
图2为4个基因片段的PCR产物电泳图。
图中：A为Lectin和CaMV 35S，B为35S-CTP4和NOS。
图3为由4个基因片段形成的融合基因的PCR产物电泳图。
图4为Lectin(A上半部)、CaMV 35S(A下半部)、NOS(B上半部)和35S-CTP4(B下半部)基因产物电泳图。
图5为CaMV 35S(A)、Lectin(B)、NOS(C)和35S-CTP4(D)基因特异性检测的检测极限。
图中：泳道1～9分别为空白对照、10%、5%、3%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的标准质粒分子DNA样品，M为DNA Marker。
图6为1～5号饲料Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4和NOS基因的定性PCR检测结果。
图中：A为Lectin、B为CaMV 35S、C为35S-CTP4、D为NOS。
图7为6～11号饲料Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4和NOS基因的定性PCR检测结果。
图中：A为Lectin、B为CaMV 35S、C为35S-CTP4、D为NOS。
图8为Lectin基因的标准曲线图(A)和扩增曲线图(B)。
图9为GTS 40-3-2基因的标准曲线图(A)和扩增曲线图(B)。
图10为CaMV 35S基因的标准曲线图(A)和扩增曲线图(B)。
图11为NOS基因的标准曲线图(A)和扩增曲线图(B)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：标准质粒分子的构建。
针对目前转基因产品检测标准物质缺乏的难题，本发明经过深入研究，构建了适于转基因大豆GTS 40-3-2品系特异性检测的标准质粒分子(重组质粒)，其中包含有大豆内源标准基因Lectin序列片段，转基因大豆GTS 40-3-2的结构和品系特异性序列，以及调控元件部分CaMV 35S启动子和部分NOS终止子。
标准质粒分子的构建分为三个步骤，依次为单个基因序列的分离、多个基因序列的体外拼接以及分子克隆。期间，本发明所采用的标准质粒分子的示意图见图1。
1 材料与方法。
1.1 实验材料。
转基因大豆GTS 40-3-2购自欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院(IRMM)（Soya seed powder-GTS 40-3-2 Soya(10%)，Catalog Number：ERM-BF410GK）；TransTaq-T DNA Polymerase(目录号：AP122)、pEASY-T1 Cloning Kit载体(目录号：CT101)、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell(目录号：CD501)：购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱法)和质粒小提试剂盒(离心柱法，BPI01008)：购自北京华大蛋白质研发中心有限公司；高纯度质粒大提试剂盒，购自TIANGEN BIOTECH(BEIJING)CO.，LTD(目录号：DP116)。其它生化试剂均为分析纯。
1.2 转基因大豆GTS 40-3-2品系基因组DNA提取(改良CTAB法提取DNA)。
1) 取0.1g 10%抗草甘膦转基因大豆GTS 40-3-2阳性标准物质，加入400μL 4℃保存的CTAB提取缓冲液I，500μL室温放置的CTAB提取缓冲液以及1μL 2-巯基乙醇，上下颠倒混匀(可用枪头吸打混匀)，在恒温金属浴中65℃保温30min，期间不时颠倒混匀(3次)。
2) 到时间后取出冷却至室温(5min)。放入冷冻离心机中离心11min，离心速度设为15000r/min。
3) 离心后取上清600μL，加入600μL混合液苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，混匀后再离心，离心条件同上。
4) 离心后，取上清500μL，加入500μL混合液苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1，混匀，离心，离心条件同上。
5) 离心后取上清400μL，加入400μL混合液氯仿∶异戊醇=24∶1，混匀，离心，离心条件同上。
6) 离心后，取上清300μL，加入乙酸钠45μL，异丙醇300μL，-20℃冷冻5min，15000r/min 4℃离心11min。
7) 离心后，弃上清，在沉淀中加入300μL冷76%乙醇，摇匀，离心(离心条件同上)。
8) 离心后，弃上清，沉淀物干燥5min，加入灭菌超纯水100μL和8μL RNA酶，摇匀，离心4min，温度4℃，离心速度设为12000r/min。
9) 离心后，取上清95μL，转入200μL离心管中，测浓度和纯度并-20℃保存。
1.3 普通定性PCR引物。
采用表1的定性PCR引物(由北京擎科新业生物技术有限公司合成)，以上述标准物质10% GTS 40-3-2的DNA为模板，扩增相应的目的基因片断。
1.4 重叠PCR引物。
采用重叠PCR方法，将上述通过割胶回收产物转到大肠杆菌中的四个目的基因提取质粒DNA，克隆到一个pEASY-T1质粒载体中，构建标准质粒分子。设计重叠PCR的引物序列见表2。
1.5 试验方案。
第一轮PCR：分别以Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4及NOS的正反向引物（S和A）扩增GTS 40-3-2的DNA模板，得到Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4和NOS四个基因的PCR片段，割胶回收，与pEASY-T1载体连接、转入Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受态细胞扩大培养，小量提取四个基因的质粒DNA。
第二轮PCR：分别利用相应基因的F和R引物扩增上述4个质粒DNA，得到4个PCR片段，割胶回收。
第三轮PCR：以Lectin F和NOS R为引物，将上述4个割胶回收的PCR产物以1∶1∶1∶1混合作为PCR反应模板，反应结束后割胶回收融合有4个基因片段的PCR产物，与pEASY-T1载体连接、转入感受态细胞中扩大培养，大量提取融合基因的质粒DNA。
1.6 扩增4个基因特异性目的片段的反应体系。
依照定性PCR反应体系，使用高保真DNA聚合酶，扩增四个目的基因片段。PCR反应体系见表3。
PCR反应时，Taq DNA Polymerase PCR扩增产物可自动加Poly A尾。
1.7 割胶回收DNA。
反应结束后，1%琼脂糖电泳分析，利用北京华大蛋白质研发中心有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱法)割胶回收DNA。
1.8 目的片段连接pEASY-T1 Cloning Vector克隆载体。
胶回收PCR产物4μL加pEASY-T1 Cloning Vector 1μL轻轻混合，室温反应5min后，将离心管置于冰上。
1.9 转化。
1) 在上述连接产物中加入50μL刚解冻的Trans1-T1 Phage ResistantChemically Competent Cell感受态细胞，轻轻混匀，并立即冰浴放置30min。
2) 于提前设置的42℃ PCR仪中热激恰好30s，立即置于冰上放置2min(勿摇动)。
3) 加500μL不加氨苄青霉素的LB液体培养基，130r/min，37℃孵育复苏1h。
4) 取250μL均匀涂于准备好的抗性平板上(2副)，37℃放置30min，培养过夜(约12h)，形成圆润光滑中等大小的单个菌落。
5) 每个基因对应挑取6个选择性平板上的单个菌落，在加有3mL LB液体培养基(加氨苄青霉素)的离心管中搅动数次，将离心管置于37℃摇床中130r/min振荡过夜。另外，按表4体系进行菌体PCR反应，所用引物见表1。
6) PCR产物进行电泳检测，与标准Marker比较，观察是否含有目的基因片段。在含有目的基因片段对应的离心管中按15～20%的量加入甘油，并进行测序。
1.10 质粒DNA的提取、纯化与鉴定。
测序正确的基因，按照北京华大蛋白质研发中心有限公司生产的质粒小提试剂盒(离心柱法，BPI01008)说明书操作纯化质粒DNA，并以四个质粒基因组DNA为模板，PCR方法进行进一步确证。
1.11 重叠PCR单个基因的获得。
依照重叠PCR反应体系(表5)，使用高保真DNA聚合酶，应用重叠PCR引物扩增四个目的基因片段。PCR反应时，Taq DNA Polymerase PCR扩增产物可自动加Poly A尾。
重叠PCR单个基因获得后依次进行割胶回收。
1.12 融合基因的获得。
使用高保真DNA聚合酶，将4个PCR产物混合物作为模板，PCR引物为Lectin F和NOS R，反应体系见表6。PCR反应时，Taq DNA Polymerase PCR扩增产物可自动加Poly A尾。
1.13 质粒的大提取与浓度纯度检测。
融合基因质粒的大提取依据天根高纯度质粒大提试剂盒说明书(DP116)进行。之后eppendorf核酸蛋白浓度检测仪测定所提质粒的浓度(ug/mL)与纯度(OD260/OD280)。
2 结果。
2.1 四个目的基因的电泳和铺板结果。
将Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4和NOS四个基因各自按表3的3倍体系即75μL(割胶回收)体系进行基因扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，所得电泳图如图2所示。将图2中四个目的基因Lectin、CaMV 35S、NOS和35S-CTP4的PCR产物割胶回收，回收产物与pEASY-T1质粒载体连接后转入Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受态细胞，混合物进行铺板。
2.2 测序。
将上述铺板后长出的菌各挑取白斑10个，按表4进行PCR扩增验证，验证正确的菌体进行测序(由北京华大中生科技发展有限公司测序)，完全正确的菌测序结果如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
2.3 融合基因电泳和铺板。
将上述Lectin、CaMV 35S、35S-CTP4和NOS四个基因测序正确的菌液小量提取质粒DNA，各按表5的3倍体系即75μL(割胶回收)体系进行基因扩增，1%琼脂糖凝胶电泳（见图3），割胶回收PCR产物后按表6体系进行扩增，电泳结果割胶回收，产物与pEASY-T1质粒载体连接后转入Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受态细胞，混合物进行铺板。
2.4 PCR鉴定。
随机挑取铺板的6个菌，扩大培养，加入表1引物PCR扩增Lectin、CaMV 35S、35S- CTP4和NOS四个目的基因，每个菌落两次重复，电泳图见图4。
从图中可知，6个菌全部扩增出Lectin、CaMV 35S和NOS基因，6号菌落扩增NOS基因条带较弱。 只有1～4号菌扩增出35S-CTP4基因。把1～4号菌扩大培养后测序。
2.5 重组质粒(融合基因)测序结果。
挑取定性PCR鉴定正确的4个菌落，扩大培养后由北京华大中生科技发展有限公司测序，4次质粒的全基因测序结果与目标序列一致，测序结果如SEQ ID NO.6，表明标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2构建成功。
实施例2：标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2用于定性PCR检测的灵敏度测试。
将标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2的标准DNA样品分别稀释至10%、5%、3%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%，作为PCR扩增的模板，分别扩增CaMV 35S启动子(195bp)、大豆内源标准基因Lectin(118bp)、NOS终止子(180bp)和35S-CTP4基因(171bp)，以确定标准质粒分子在PCR检测中的检测极限(LOD值)。
反应体系为：总体积25μL，其中10倍的PCR反应液2.5μL，dNTPs 2μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5μL，模板1μL，Taq DNA聚合酶0.125μL，用ddH2O补足至25μL。
反应程序为：95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 60s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸7min。
经过上述多组不同转基因含量的标准DNA样品的重复测试，CaMV 35S定性PCR检测方法的DNA样品LOD值为0.05%；Lectin定性PCR检测方法的DNA样品LOD值为0.05%；NOS定性PCR检测方法的DNA样品LOD值为0.01%；35S-CTP4定性PCR检测方法的DNA样品LOD值为0.05%，具体结果见图5。
实施例3：标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2用于定量PCR检测的检测极限(LOD值)和定量极限(LOQ值)。
使用大提试剂盒提取构建的标准质粒分子的DNA，所提取质粒的浓度与纯度见表7，则质粒的平均浓度为195.0μg/mL。
登陆http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/CurPro3Tool/toolId-8.html网站的DNA/RNA/Protein Molecular Weight Calculator工具，在网站Sequencelength选项中输入重组质粒序列大小4637(试验所用全式金CD101载体单链序列为3938bp，目的基因单链序列为709bp，合计序列大小为4637bp)，在Estimate based on sequencelength项下拉表中的Molecule type项选择dsDNA，得到质粒的摩尔质量为2865542g/mol。代入公式：质粒拷贝数(/μL)=质粒浓度(g/μL)×6.02×1023(/mol)/质粒摩尔质量(g/mol)，根据所提取质粒DNA的浓度，计算出质粒的拷贝数为4.097×1010copies/μL。质粒的模板量为加2μL，则质粒拷贝数为8.19×1010copies/2μL。稀释质粒DNA，最终得到质粒拷贝数5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5、2.5copies/2µL的7个梯度作为模板的标准品，测试Lectin、GTS 40-3-2、CaMV 35S和NOS四个基因定量PCR检测方法的LOD值和LOQ值(每个反应重复三次)。根据定量PCR扩增的标准曲线与扩增荧光信号间的线性关系，确定用构建的标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2代替阳性标准物质时，该定量PCR检测方法的LOD和LOQ。
实验显示体系的LOD和LOQ分别为2和20copies/µL，说明构建的pEASY-T1-GTS 40-3-2标准质粒分子可以代替转基因大豆GTS 40-3-2阳性标准品来定量检测转基因大豆GTS40-3-2及其加工产品转基因成分含量。
实施例4：标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2定量检测体系的重复性和重演性。
分别以不同浓度(5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5、2.5copies/2µL)的标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2的7个梯度作为模板进行重复性和复现性测试(每个反应重复三次)。根据定量PCR扩增的标准曲线，确定根据质粒标准分子pEASY-T1-GTS 40-3-2建立的转基因大豆GTS 40-3-2定量PCR反应的可重复性和重演性。
实验结果显示，分别以不同浓度的标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2进行重复性和复现性测试，3个平行反应间和3次不同重复实验间获得的Ct值标准偏差小于0.2，说明pEASY-T1-GTS 40-3-2标准质粒分子建立的转基因大豆GTS 40-3-2定量PCR反应的重复性和重演性好，可以用于实际样品的进一步定量分析。
实施例5：10%和1%的转基因大豆GTS 40-3-2标准物质的定量分析。
应用标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2，对分别含有10%和1%转基因大豆GTS40-3-2的标准物质进行定量分析，确定构建的转基因大豆GTS 40-3-2定量检测标准质粒分子是否可以有效地应用于实际转基因大豆GTS 40-3-2样品的定量检测。
实验结果表明，通过对含有10%和1%转基因大豆GTS 40-3-2的标准物质进行分析，根据绘制的定量PCR标准曲线，定量分析结果显示两个转基因大豆GTS 40-3-2标准物质的转基因含量分别为10.23%和1.07%，偏差分别为2.3%和7%，检测结果偏差在允许范围内(ISO转基因食品检测标准允许为0～0.25范围)，表明本发明构建的标准质粒分子pEASY-T1-GTS40-3-2适用于转基因大豆GTS 40-3-2的定量PCR分析和检测。
实施例6：应用标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2定性定量PCR检测饲料样品。
随机选择山西省太谷县周边3个养猪厂(每户存栏300头)、一个蛋鸡厂(1万只)、一个肉鸡厂(9000只)和一个奶牛厂(100头)，共收集11份饲料进行相关基因的定性及定量检测，具体饲料类型见表8。
一、饲料样品的定性PCR检测。
1 材料与方法。
1.1 主要试剂及耗材。
适用于普通PCR的Trans Taq-T DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司；DL2,000 DNA Marker(Cat#3427A)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。其他试剂均为进口或国产分析纯或优级纯。
1.2 引物。
转基因调控元件部分CaMV 35S启动子和部分NOS终止子序列引物参照农业部1782号令-3-2012；大豆特异基因Lectin和GTS 40-3-2引物参照农业部1861号令-2-2012；引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成，引物序列见表9。
1.3 PCR扩增体系。
以0.5%的标准质粒分子pEASY-T1-GTS 40-3-2 DNA样品作为阳性对照、非转基因大豆A5403作为阴性对照，以水代替DNA作为空白对照，检测所用PCR反应体系见表10，每个反应体系设置两个平行反应。
1.4 提取饲料中的DNA。
称取10g(颗粒性)饲料样品，在美的多功能食物搅拌器中磨碎至颗粒大小小于2mm。采用改良CTAB法提取饲料中的DNA，用核酸蛋白浓度检测仪对所提取的饲料DNA进行浓度及纯度检测。
1.5 PCR反应。
进行PCR反应的循环参数见表11。
2 结果。
2.1 饲料的DNA浓度和纯度。
采用改良CTAB法对11份饲料进行提取，所提DNA的浓度和纯度见表12。
由上表可以看出，所有样液的浓度均在25μg/mL以上，纯度也在1.7～2.0之间，表明提取DNA的浓度和纯度较好。
2.2 产物电泳结果。
所有11个样品两次重复，P为阳性对照(加入0.5%构建的标准质粒分子)，N为阴性对照(大豆亲本A5403)，B为空白对照。
2.2.1 1～5号饲料电泳结果。
利用构建的标准质粒分子作为阳性对照，进行1～5号饲料的扩增，见图6。1～10泳道依次是饲料样品1～5号，每个样品两次重复，M为DNA Marker。
2.2.2 6～11号饲料电泳结果。
利用构建的标准质粒分子作为阳性对照，进行6～11号饲料的扩增，见图7。1～12泳道依次是饲料样品6～11号，每个样品两次重复，M为DNA Marker。
二、饲料样品的定量PCR检测。
1 材料与方法。
1.1 主要试剂。
Premix ExTaq TM(Probe qPCR)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司(Code NO.RR390A)；TaqMan探针及定性定量PCR引物：由北京擎科新业生物技术有限公司合成。其他试剂为实验室常规分析纯试剂。
1.2 实时荧光定量PCR引物与探针。
所用的荧光定量PCR引物与探针序列见表13。
1.3 标准曲线的建立。
将提取的标准质粒分子倍比稀释，最终得到质粒拷贝数5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5、2.5copies/2µL的7个梯度作为模板的标准品，测试饲料样品中Lectin、GTS40-3-2、CaMV 35S和NOS四个基因(每个反应重复三次)的含量。
1.4 反应体系。
按表14反应体系加入荧光定量PCR 96孔反应板中。
按以下程序进行PCR反应：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火30s，收集荧光信号，40个循环；4℃保温。
1.5 观察并分析标准曲线与扩增曲线，计算转化体含量。
2 结果。
2.1 Lectin基因实时荧光定量PCR检测。
试验对11份饲料进行Lectin基因实时荧光定量PCR检测，所得标准曲线和扩增曲线见图8，11个饲料样品Lectin基因的Ct值和拷贝数见表15。
从图8可以看出，Lectin基因标准品有典型扩增曲线，扩增效率97.6%，R2为0.991＞0.98，标准曲线斜率-3.380，＞-3.6且＜-3.1，阴性对照(鲑鱼精子DNA)和空白对照(水)均无典型扩增曲线，其Ct值和拷贝数都为0，可进行样品的判定。
2.2 GTS 40-3-2基因实时荧光定量PCR检测。
试验对饲料中GTS 40-3-2基因进行实时荧光定量PCR检测，所得标准曲线和扩增曲线见图9。11个饲料样品GTS 40-3-2基因的Ct值和拷贝数见表16。
从图9可以看出，GTS 40-3-2基因标准品有典型扩增曲线，扩增效率99.5%，R2为0.989＞0.98，标准曲线斜率-3.333，＞-3.6且＜-3.1，阴性对照(鲑鱼精子DNA)和空白对照(水)均无典型扩增曲线，Ct值和拷贝数都为0，可进行样品的判定。
2.3 CaMV 35S基因实时荧光定量PCR检测。
试验对饲料中CaMV 35S基因进行实时荧光定量PCR检测，所得标准曲线和扩增曲线见图10。11个饲料样品CaMV 35S基因的Ct值和拷贝数见表17。
从图10可以看出，CaMV 35S基因标准品有典型扩增曲线，扩增效率96.2%，R2为0.981＞0.98，标准曲线斜率-3.417，＞-3.6且＜-3.1，阴性对照(鲑鱼精子DNA)和空白对照(水)均无典型扩增曲线。
2.4 NOS基因实时荧光定量PCR检测。
试验对饲料中NOS基因进行实时荧光定量PCR检测，所得标准曲线和扩增曲线见图11。11个饲料样品NOS基因的Ct值和拷贝数见表18。
从图11可以看出，NOS基因标准品有典型扩增曲线，扩增效率97.4%，R2为0.987＞0.98，标准曲线斜率-3.385，＞-3.6且＜-3.1，阴性对照(鲑鱼精子DNA)和空白对照(水)均无典型扩增曲线。
2.5 饲料中GTS 40-3-2转化体的含量。
饲料中GTS 40-3-2转化体的含量按下列公式计算：
C=（nGTS 40-3-2/n Lectin ）×100。
其中：nGTS 40-3-2为GTS 40-3-2转化体的拷贝数，n Lectin 为Lectin基因的拷贝数。
通过上述公式计算，可得到饲料中GTS 40-3-2转化体的含量，具体见表19。
因此，本发明构建的标准质粒分子pEASY -T1-GTS 40-3-2高度特异于转基因大豆GTS 40-4-2品系检测，利用本发明构建的标准质粒分子pEASY -T1-GTS 40-3-2可以很好的替代植物来源的阳性标准品，用于转基因大豆GTS 40-3-2及其来源产品品系特异性定性和定量检测以及含有调控基因CaMV 35S启动子和NOS 终止子的定性和定量筛查。

Claims (9)

1.特异性检测转基因大豆GTS 40-3-2的标准质粒分子pEASY -T1-GTS 40-3-2，所述标准质粒分子的外源序列由SEQ ID NO.1所示的大豆内源标准基因Lectin序列片段、SEQ IDNO.2所示的转基因大豆GTS 40-3-2结构和品系特异性序列35S-CTP4 ，以及作为调控元件的部分CaMV35S启动子序列和部分NOS 终止子序列构成，其中，在特异性序列35S-CTP4 中含有SEQ ID NO.3所示的转基因大豆GTS 40-3-2的品系特异性序列，所述外源序列被构建在质粒载体pEASY-T1上。
2.根据权利要求1所述的标准质粒分子，其特征是所述调控元件中的部分CaMV 35S启动子序列如SEQ ID NO.4所示，部分NOS 终止子序列如SEQ ID NO.5所示，所述标准质粒分子的外源序列如SEQ ID NO.6所示。
3.权利要求2所述标准质粒分子的构建方法，是以标准GTS 40-3-2的DNA为模板，分别扩增Lectin、CaMV35S、35S-CTP4和NOS四个基因片段与pEASY -T1质粒载体连接，转入感受态细胞扩大培养得到所述四个基因的质粒DNA；利用重叠PCR引物扩增所述四个基因的质粒DNA，等比例混合后与pEASY -T1质粒载体连接，转入感受态细胞扩大培养，提取融合基因的质粒DNA，得到标准质粒分子pEASY -T1-GTS 40-3-2。
4.根据权利要求3所述的标准质粒分子的构建方法，其特征是所述用于扩增Lectin 、CaMV35S、35S-CTP4 和NOS 四个基因片段的引物分别为：
Lectin S：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3’，
Lectin A：5’-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3’；
CaMV35S S：5’-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3’，
CaMV35S A：5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3’；
NOS S：5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’，
NOS A：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’；
35S-CTP4 S：5’-TGATGTGATATCTCCACTGACG-3’，
35S-CTP4 A：5’-TGTATCCCTTGAGCCATGTTGT-3’。
5.根据权利要求3所述的标准质粒分子的构建方法，其特征是所述重叠PCR引物分别为：
Lectin F：5’-GCCCTCTACTCCACCCCCATC-3’，
Lectin R：5’-CAATGATGGCATTTGTAGGAGCGAAGGCAAGCCCATCTGCAAG-3’；
CaMV35S F：5’-GCTCCTACAAATGCCATCATTG-3’，
CaMV35S R：5’-GTCAGTGGAGATATCACATCAGATAGTGGGATTGTGCGTCATC-3’；
35S-CTP4 F：5’-TGATGTGATATCTCCACTGAC-3’，
35S-CTP4 R：5’-CTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATTGTATCCCTTGAGCCATGTTGTTA ATTTG-3’；
NOS F：5’-ATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3’，
NOS R：5’-TATCCTAGTTTGCGCGCTATATT-3’。
6.权利要求1或2所述标准质粒分子在转基因大豆GTS 40-3-2的核酸定性PCR检测中的应用。
7.权利要求1或2所述标准质粒分子在转基因大豆GTS 40-3-2的核酸定量PCR检测中的应用。
8.转基因大豆GTS 40-3-2的核酸定性PCR检测用试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求2所述的标准质粒分子。
9.转基因大豆GTS 40-3-2的核酸定量PCR检测用试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求2所述的标准质粒分子。
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