CN100422341C

CN100422341C - 基因重组体的定量检测方法和用于该方法的标准分子

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Publication number: CN100422341C
Application number: CNB018180752A
Authority: CN
Inventors: 日野明宽; 松冈猛; 栗原秀夫; 吉村伦彰; 进藤洋一郎; 布藤聪; 小川真智子
Original assignee: NAT FOOD RES INST; Nippon Flour Mills Co Ltd; Asahi Breweries Ltd
Current assignee: NAT FOOD RES INST; Asahi Group Holdings Ltd; NIPPN Corp
Priority date: 2000-10-26
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2008-10-01
Anticipated expiration: 2021-10-24
Also published as: AU2002212678B8; KR20030051740A; WO2002034943A1; CN1623002A; AU2002212678B2; JPWO2002034943A1; US20040005605A1; US7709232B2; KR100624667B1; EP1335027A4; EP1335027B1; AU1267802A; BR0114928A; EP1335027A1; JP4291568B2; CA2427126A1; HK1076487A1; DE60134168D1; MXPA03003731A; ATE396281T1

Abstract

本发明涉及一种利用PCR方法检测基因重组体的方法。提供了一种定量检测方法，利用该方法能够定量测定含有多种基因重组系的群体中基因重组体的总含量比和各基因重组体的分别的含量比。本发明的方法包括：用一种在单个分子上含有重组体特异的DNA序列和该重组体相应的种共有的内源DNA序列的分子作为标准分子，对重组体特异的DNA序列和对应于该重组体的物种所共有的内源DNA序列进行PCR，并确定其分子数的含量比。

Description

基因重组体的定量检测方法和用于该方法的标准分子

技术领域

本发明涉及一种应用PCR(聚合酶链反应)检测基因重组体的方法。具体而言，本发明涉及一种应用PCR检测对基因重组体特异的DNA序列的分子生物学方法。更具体而言，本发明涉及一种方法，用来检测在含有携带不同重组DNA序列的多种基因重组体的群体中可能存在的各种基因重组系的含量比。此外，本发明还涉及在这种检测基因重组体的分子生物学方法中使用的标准分子。

发明背景

利用基因重组技术生产的基因重组体在全世界的实际应用正在进行。作为已经实际应用的基因重组体，已知例如以产干扰素细菌为代表的基因重组微生物和以昆虫抗性玉米为代表的基因重组作物。例如，在以前培育的基因重组作物中曾经使用昆虫抗性基因，如来自苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的CryIA(b)蛋白编码区(下文称为cryIA(b))，或除草剂抗性基因，如膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)蛋白编码区(下文称为pat)。在这些情况中，这些转基因作为与各种DNA序列合的表达单位被导入，使得该转基因能在作物中表达。

能够使用的DNA序列包括：来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(下文称为CaMV35S启动子)，来自玉米的磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶(PEPC)基因启动子，来自玉米的钙依赖蛋白激酶(CDPK)启动子；内含子，如含有玉米乙醇脱氢酶1S基因第6个内含子(Adh1-S IVS6)的区域，含有玉米乙醇脱氢酶1S基因第2个内含子(Adh1-S IVS2)的区域，PEPC的第9个内含子(PEPC#9)，或来自玉米的热休克蛋白70(hsp70)的内含子区；以及终止子，如来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂氨酸合成酶终止子(下文称为NOS终止子)或来自花椰菜花叶病毒的35S终止子。对于玉米，实际商业销售的基因重组作物包括，例如：Novartis的Bt11系的子代品种、Novartis的Event176的子代品种、Monsanto的MON810系的子代品种、Monsanto的GA21系的子代品种，和Aventis的T25系的子代品种。对于大豆，包括，例如Roundup ReadySoy系的子代品种。向这些品种内导入的DNA的构建如图1所示。

通常研制一种基因重组体，是为了与初始生物相比，给初始生物赋予工业优选的特性。用于这一目的的主要方法是：从固有地显示该特性的生物中分离表达该特性的基因，并将该基因导入目的生物中，使得该基因能在该生物中表达。因此，来自基因重组体的DNA包括已经导入该重组体内的这些重组DNA序列。

例如，已经培育了基因重组作物，它们被赋予作为农产品的优选特性，如昆虫抗性和除草剂抗性等，这些作物的生产方法是，以基因能够在作物中表达的形式将负责昆虫抗性或除草剂抗性等的基因导入原作物中。因此，来自基因重组体的DNA包括已经导入该重组体内的这些重组DNA序列。

然而，在这些作物实际商品化时，这些作物可能是基因重组作物的子代杂种。因此，应当证实导入的DNA序列在这些作物中稳定存在。

另外，欧盟(EU)已经颁布了关于标注基因重组体和由它们生产的加工食品的法规(法规(EC)号EC/258/97，委员会法规(EC)号1139/98)，日本也颁布了关于标注基因重组体和由它们生产的加工食品的法规，这使得食品工业及其相关领域需要关于作物或食品中重组体的存在及含量的信息。

因此需要一种技术，它可测定食品、饲料及其来源作物中基因重组体的存在或含量，特别是在原料中的含量比。当预计含有多种基因重组系时，希望有一种技术能分别检测它们，并能确定每个系的含量比，也就是说，希望发展一种高灵敏度的实用定量技术，来检测基因重组体的各个系。

虽然有许多报告表明，为了检测基因重组体，使用应用聚合酶链反应(PCR)的分子生物学技术是有利的(Science Vol.230，1350-1354(1985)，Science Vol.239，487-491(1988))，但是这些技术只能定性地确定基因重组体的存在与否，而无法获得关于样品中所含基因重组体的含量比的信息(参见，例如：Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.203，339-344(1996)，Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg.，Vol.87，307-367(1996)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.93，Jahrg.，Heft2，35-38(1997)，Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.205，442-445(1997)，Zeitschrift fur Ernahrungwissenscaft Vol.36，155-160(1997)、BGVV Hefte 1，115-117(1997)、Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg.，Vol.88，164-175(1997)，Mitt.Gebiete Lebensm.Hyg.，Vol.88，515-524(1997)、Food Additives and Contaminants，Vol.15，No.7，767-774(1998)、Lebensm.-Wiss.u.-Technol.，Vol.31，664-667(1998)、Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.206，203-207(1998)、Z.Lebensm Unters Forsch A.，Vol.206，237-242(1998)，Z.LebensmUnters Forsch A.，Vol.207，264-267(1998)、BioSci.Biotechol.Biochem.Vol.62，No.7，1461-1464(1998)，DeutscheLebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft 2，44-48(1999)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft 2，48-51(1999)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft2，52-56(1999)，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft 7，275-278(1999)，Journal of AOAC InternationalVol.82，No.4，923-928(1999)，GIT Labor-Fachzetschrift，2/99，156-160(1999)、Bio Industry Vol.16，No.4，17-21(1999)，Eur.Food Res.Technol.Vol.209，77-82(1999)，Analytica Chimica ActaVol.393，177-179(1999)，Food Control Vol.10，339-349(1999)，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.47，No.12，5038-5043(1999)，Journal of Food Hygienic Society of Japan，Vol.41，No.2，137-143(2000))。

也有几篇报道是关于能够提供样品中所含各基因重组体的含量比的信息的已知技术，例如关于定量测定大豆和玉米的重组DNA序列的技术的报道。

例如，Deutsche Lebensmittel-Rundschau，Vol.95，Jahrg.，Heft2，57-59(1999)和Eur.Food.Res.Technol，Vol.209，83-87(1999)报道了应用竞争性PCR对大豆的定量检测技术。然而，这些技术只限于基因重组大豆的一个系。而且，由于采用竞争性PCR，定量的精确度相对较低，因为它们不使用内部标准，从样品中提取的DNA溶液的纯度和产量影响了定量结果。

Z.Lebensm Unters Forsch A，Vol.207，No.3，207-213(1998)也报道了应用竞争性PCR对基因重组玉米的定量检测技术，但是检测的目标也只限于基因重组玉米的一个系，这与上述情况类似。此外，与上述情况类似，竞争性PCR和缺乏内部标准也使得定量结果的可靠性不够。

Food Control Vol.10，353-358(1999)报道了应用竞争性PCR对基因重组玉米和基因重组大豆的定量检测技术，但是这两种技术分别只限于一个系。而且，如上所述，使用竞争性PCR和缺乏内部标准使得定量结果的可靠性不够。

众所周知使用荧光探针等的定量PCR(也称为实时PCR或在线PCR等)是在定量精确度上优于竞争性PCR的一种定量分析。有几篇报道是关于应用定量PCR对重组DNA序列的定量检测技术。

例如，Journal of Agricultural and Food Chemistry，Vol.47，No.12，5261-5266(1999)报道，重组大豆和玉米的定量能用荧光探针通过定量PCR进行。在该报道中采用了内部标准程序，这提高了定量结果的可靠性。然而，检测目标只是基因重组大豆的一个系，也是基因重组玉米的一个系。

Food Control Vol.10，385-389(1999)也报道了两种技术：利用荧光探针的定量PCR对基因重组大豆的定量检测技术，和利用竞争性PCR对基因重组大豆的定量检测技术。在这些报道中也采用了内部标准程序，这提高了定量结果的可靠性。与上述报道不同，用含有内部标准DNA序列的质粒DNA和含有待测靶DNA序列的质粒DNA作为标准分子。然而，由于这两种质粒DNA是分开提供的，因此稀释质粒DNA的方法和加入反应系统中的质粒DNA的量仍有可能影响定量结果。检测目标也仅限于基因重组大豆的一个系。Chemie in Labor und Biotechnik.Vol.50，Jahrg.，Heft 1，6-8(1999)类似于上述报道。

此外，由于可购到的作为标准物质的基因重组体只是玉米的两个系和大豆的一个系，所以分析者分析其它系非常困难。

也曾经报道了一种定量测定基因重组体含量的技术，它是利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定由重组DNA序列表达的蛋白质，但是该技术也是对一种特定系的定量技术。

发明概述

如上所述，以前报道的对基因重组体的定量检测技术只能定量检测有限的系，或者缺乏定量精确性。

另一方面，当只用该技术检测这些系中的特定一种时，定量测定样品中基因重组体的含量比非常困难，因为常规销售的作物在销售过程中不同品种混合在一起。例如，日本销售的基因重组玉米系到2000年7月为止多达7个系。因此，如果只能定量测定样品中基因重组玉米的一个特定系，这种分析是不够的。因此，可以认为，应该注意，作为一种定量分析方法，只能检测一个特定系的技术以及缺乏定量精确性的技术是不够的，缺乏实用价值。

限制可检测目标系数量的因素之一是试验标准供应不足。获得只含有基因重组体一个特定系而不含其它任何系的纯标准样品非常困难。当前作为标准样品提供给分析者的基因重组体只是玉米的两个系和大豆的一个系。实际上，在以上提到的关于定量检测技术的报道中，所有靶标只限于能够获得各自标准样品的靶标(在上述参考文献中也已提到，例如，Food Control Vol.10，385-389(1999))。也就是说，标准样品可获得性差使上述检测技术的适用性受到限制。

另外，由于在基因重组体的每个系中，每个基因组导入的重组DNA序列的类型和拷贝数在系与系之间不同，如果假定样品中只含有特定的系进行分析，而不考虑这些差异的影响，则有可能获得与基因重组体的实际含量比相距甚远的结果。因此，即使提供所有基因重组系作为分析的标准样品，也不能认为这些技术是对基因重组体的有效定量检测技术，除非找到方法来考虑系与系之间重组DNA序列的多样性。

如上所述，希望开发一种对基因重组体的灵敏、定量的有效检测技术，已在积极尝试这种开发，但是由于常规的销售方式、标准样品的可获得性差和系与系之间重组DNA序列的多样性，对重组DNA序列和/或基因重组体的分子生物学检测技术的发展和普及比较困难。

因此，本发明的目的在于提供一种检测基因重组体的分子生物学方法，其中，通过严格考虑多种基因重组系之间重组DNA序列的多样性，能定量测定含有多系基因重组体的群体中基因重组体的精确总含量比。

特别是，本发明的目的在于提供一种检测基因重组体的分子生物学方法，其中，通过严格考虑多种基因重组体之间重组DNA序列的多样性，能定量测定含有多个系的基因重组体的群体中每种基因重组体的分别的精确含量比。

本发明的另一个目的在于提供一种重组DNA分子作为上述定量检测方法的标准样品，该分子尤其具有能够无限供应的特性，其中设计该分子，使得通过严格考虑多种基因重组系之间重组DNA序列的多样性，能够进行定量测定。

本发明的发明人生产了一种在单个分子上含有5条基因重组玉米系特异的DNA序列、两条常用于基因重组体但不是系特异的DNA序列和另外一条内源玉米基因的DNA序列的分子，一种在单个分子上含有一条基因重组大豆系特异的DNA序列和一条内源大豆基因的DNA序列的分子，和一种在单个分子上含有一条基因重组大豆系特异的DNA序列、一条内源大豆基因的DNA序列和两条常用于基因重组体但不是系特异的DNA序列的分子，并且发现，在PCR中使用这些分子作为标准分子能显著改进以前的定性和定量检测方法，这使得发明人能够建立本发明。

因此，本发明是一种定量检测方法，用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中基因重组体的含量比，该方法包括：

(i)对来源于样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的基因重组体特异的DNA序列进行定量PCR，并对对应于该基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR，其中使用一种在单个分子上含有该基因重组体特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子。

(ii)根据定量PCR的结果，确定样品中基因重组体特异的DNA序列的数量；

(iii)根据定量PCR的结果，确定样品中内源DNA序列的数量；和

(iv)根据式(I)确定基因重组体的含量比：

(样品中基因重组体的含量比)＝100×[(样品中基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％)

(I)

其中，定量比是根据式(II)预先计算的值中的任何一种：

(定量比)(％)＝(来自单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分子数)

(II)

更具体而言，本发明是一种定量检测方法，用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中各基因重组体的分别的含量比，该方法包括：

(i)对来自样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的单个基因重组系特异的DNA序列进行定量PCR，并对对应于基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR，其中利用一种在单个分子上含有该单个基因重组系特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子；

(ii)根据所述定量PCR的结果，确定样品中该单个基因重组系特异的DNA序列的数量；

(iii)根据定量PCR的结果，确定样品中所述内源DNA序列的数量；和

(iv)根据式(III)确定该基因重组体的含量比：

(样品中单个基因重组系的含量比)＝100×[(样品中对应于每种基因重组体的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％) (III)

其中，定量比根据上述式(II)计算。

本发明的重组DNA分子是这样一种重组DNA分子，其特征在于，它在单个分子上含有一条基因重组系特异的DNA序列和至少一条对应于基因重组体的物种所共有的内源DNA序列。本发明的DNA分子尤其是这样一种重组DNA分子，其特征在于，它在单个分子上含有两条或两条以上分别对于基因重组体的各个系特异的DNA序列，和至少一条对应于所述基因重组体的两种或多种非重组体所共有的内源DNA序列。

附图简述

图1分别显示导入各基因重组系内的重组DNA序列的构建，以及为分子生物学分析设计的引物的位置。设计用于扩增各基因重组系特异的DNA序列的引物对，使其能扩增涵盖多个DNA序列的区域。设计用于扩增不是系特异的但是常用于基因重组体的DNA序列的引物对，使其能与所有相应的系反应。

图2显示使用为检测T25系子代品种设计的引物对进行特异性验证试验的结果。除了T25系的子代品种之外，从其他样品中提取的DNA未观察到扩增反应，只有从T25系的子代品种中提取的DNA观察到扩增产物。扩增产物的分子量与设计分子量一致。

图3显示使用为检测NOS终止子设计的引物对和探针进行特异性验证试验的结果。这些实验用11种DNA模板进行。如从图1中所见，向Bt11系的子代品种、GA21系的子代品种、Roundup Ready Soy系的子代品种中导入了NOS终止子。实验结果表明，只有从这3个品种中提取的模板DNA才观察到扩增产物，对其它模板DNA进行反应时未观察到扩增产物，这证实了设计的特异性。

图4显示组合PCR产物的方法的图示。

图5显示用于玉米的标准分子的核苷酸序列。图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置。图中也显示了实验中使用的引物和探针的结合区。

图6显示用于玉米的另一种标准分子的核苷酸序列。图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置。图中也显示了实验中使用的引物和探针的结合区。

图7显示质粒pMul4和pMul5的图示。对于pMul4，将图5所示的DNA插入载体中。对于pMul5，将图6所示的DNA序列插入载体中。

图8显示用于大豆的标准分子的核苷酸序列。图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置。图中也显示了实验中使用的引物和探针的结合区。

图9显示用于大豆的另一种标准分子的核苷酸序列。图中显示了每个扩增靶标在组合的DNA序列中的位置。图中也显示了实验中使用的引物和探针的结合区。

图10显示质粒pMulSL的图示。导入载体中的序列是图8所示的DNA序列。

图11显示质粒pMulSL2的图示。导入载体中的序列是图9所示的DNA序列。

图12证实了双盲玉米样品中所含的基因重组玉米。检测到了Bt11系的子代品种(A)和GA21系和MON810系的子代品种(B)。用pMul4的BamHI消化产物作为对照。

图13显示证实定量比的结果，方法包括用从一种玉米种子中提取的DNA进行PCR，并根据式(II)计算定量比。图中箭头所指为可以显示T25系子代品种的F1种子的预测值。

图14显示定量PCR期间玉米标准重组DNA序列的图(循环次数-荧光强度)。

图15显示通过对玉米标准重组DNA序列进行定量PCR获得的标准曲线。标准曲线来源于图14。

图16显示证实定量比的结果，方法包括用从一种大豆种子中提取的DNA进行PCR，并根据式(II)计算定量比。

发明优选实施方案

在下列描述中以基因重组作物作为基因重组体的例子说明本发明，但是本发明的应用不只限于作物，本发明不排除其它基因重组体，包括基因重组动物、植物、微生物等。在本发明的一个实施方案中，用来自待测植物的核酸通过PCR方法检测重组DNA序列，以特异地检测不同基因重组体。因此，需要设计用来检测基因重组系特异的DNA序列的引物对、用来检测不是系特异的但常用于基因重组体的DNA序列的引物对和用来检测作物(可以是基因重组体或是非重组体)特异的DNA序列的引物对。

待测植物样品可以是可从中提取核酸(如基因组DNA)的任何样品，包括原种、干种、加工的物质，如粗玉米粉和大豆粉。这些样品必要时可在磨碎后使用。

根据本发明，根据重组DNA序列的分子数、内源基因的分子数和计算的样品中单种基因重组体的定量比，能测定可能含有一种或两种或两种以上基因重组系的样品中基因重组体的含量比，特别是单种基因重组体的含量比。

根据本发明，基因重组体的含量比按下列程序计算：

(i)用一种在单个分子上含有样品中可能存在的基因重组体特异的DNA序列和对应于该基因重组体的物种所共有的内源DNA序列的分子作为标准分子，进行定量PCR；

(iv)根据式(I)确定基因重组体的含量比：

(样品中基因重组体的含量比)＝100×[(样品中基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％) (I)

其中，定量比是根据式(II)预先计算的值中的任何一种：

(定量比)(％)＝100×(对来自单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分子数)

(II)

特别是，当确定每种基因重组体的分别的含量比时，可以用式(III)代替式(I)：

(样品中单个基因重组系的含量比)＝100×[(样品中对该单种基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％) (III)

本文中术语“DNA序列”和“DNA序列或其部分区域”可互换使用。因此，例如，“基因重组系特异的DNA序列”是指均对所述基因重组系特异的全长DNA或者至少是它的一个部分区域。在本文其它部分同样如此。这也适用于“基因序列”的含意。

术语“基因重组体”包括已经导入外源基因的整个生物，或已经导入外源基因的生物的一部分，例如这些生物的器官、组织外植体、细胞(包括培养细胞)、种子、花粉或胚。

术语“定量PCR”通常是指利用PCR定量测定在扩增反应开始时存在的模板DNA的一系列反应。定量PCR包括使用内源序列作为标准的内部标准法和使用与扩增反应竞争的分子的竞争法。在本发明中使用内部法和PCR，在反应过程中随时监测称为标准分子并作为精确、容易地测定每种序列分子数的标准的模板DNA，和反应的进展，即扩增程度。因此，本文中“定量PCR”是指用于定量测定在反应开始时存在的模板DNA含量的PCR，其中在反应中能随时监测被扩增靶分子的扩增。为了定量，通常将这种PCR与标准曲线结合，标准曲线能将反应开始时存在的DNA分子数与表明分子扩增程度的信号相关联。利用含量已知的标准分子能生成标准曲线。

在本发明中可以使用的样品DNA、引物、探针、PCR条件和重组DNA分子数、内源基因分子数和计算定量比的方法将在下文详细描述。

来自待测植物的核酸优选地是来自待测植物的基因组DNA。从待测植物中提取核酸的方法没有限制，可采用从待测植物样品中提取核酸的任何方法，只要能够获得用于PCR的足够的质量。例如，可以使用市售的试剂盒，如QIAGEN Plant Maxi试剂盒(QIAGEN GmbH)。另外，这些方法必要时也可加以修改。

利用这些方法提取的核酸优选地以适于在PCR中作为模板的形式保存，例如，以溶于缓冲液的溶液形式保存。获得的核酸的纯度可用已知的方法估计，例如测定230nm、260nm和280nm的吸光度。这样，为进行PCR方法，260nm/230nm比大于2且260nm/280nm比为1.8-2是优选的。

为了证实制备的DNA溶液纯化到足以进行PCR并且不被降解，可以利用对应于内源基因的引物进行PCR扩增。

利用从待测植物中这样获得的核酸进行PCR。PCR中使用的引物是能够扩增含有完整重组DNA序列或其部分的区域的引物对。应用这些引物，根据重组DNA序列的结构特异地检测重组DNA序列是可能的。可以根据将要检测的基因重组体如下所述设计这些引物对。

将要检测的靶基因重组体可以是上述任何基因重组体，其类型没有限制。任何一种基因重组体都有可能是检测的靶标，只要导入的DNA序列的结构确定。这种基因重组体可以不只限于进行基因导入的一代，而可能是其子代的一个品种。

首先，应当获得待测基因重组体中所含的重组DNA的核苷酸序列。该核苷酸序列不必是重组DNA的完整序列，也可以是位于目标区附近的核苷酸序列。这些核苷酸序列中的许多可以在已知的文献中获得。即使该核苷酸序列不能从已知的文献中获得，只要可以得到部分核苷酸序列的信息，也能通过实验获得该序列。在设计系特异的引物对时，通过选择涵盖多种DNA序列的区域(例如，从CaMV 35S启动子延伸到cryIA(b)的区域)，可以容易地选择高特异性的引物对。每个引物对可以是如下任何一种引物对，只要它能特异地扩增靶DNA序列，但是优选的是，扩增的片段为80bp-200bp，每条引物的GC含量为40％-60％，更加优选的是，每条引物不形成分子内高等级结构，并且不形成3个或3个以上连续核苷酸的碱基配对。

例如，当旨在特异、分别地检测Bt11系的子代品种、Event176系的子代品种、MON810系的子代品种、GA21系的子代品种、T25系的子代品种或Roundup Ready Soy系的子代品种时，可以根据图1所示的区域设计引物。

同样众所周知，在反应开始时存在、用引物扩增的扩增区域的数量能用定量PCR方法定量。已知几种定量PCR方法，但在许多情况下需要制备与引物对所包括的区域互补的探针。该探针可以是产生与扩增产生的分子数相应的信号的任何一种探针，例如，在PCR中适于检测DNA双链形成或从双链到单链的解离反应或核酸延伸反应的物质。荧光标记的核酸通常用作探针。具体而言，优选地，在PCR扩增反应中，在聚合酶延伸反应采用的条件下，探针可以与模板DNA特异杂交，并且可导致荧光强度根据DNA链的延伸(即模板DNA的扩增)而改变，这些变化优选地表明扩增的程度，更优选地，根据模板DNA的扩增，探针降解，释放出荧光团，这使得反应混合物中的荧光强度增加，而且荧光强度的增加优选地是扩增程度的指标。利用这些探针，可以容易地实时监测PCR中扩增的进展。这些荧光标记的探针是本领域技术人员周知的，也可以合成具有这种性质的合适的荧光探针。另外，该探针优选地具有比相应引物对约高10℃的Tm值，探针的全长优选地为约18个核苷酸至约25个核苷酸，并且该探针在其末端不含G。在本发明方法的一个实施方案中，使用这样一种探针，该探针随着扩增的进展而降解，导致荧光强度增加，荧光强度的增加是扩增的指示。

可以用来自待测植物样品的核酸作为模板，使用如上所述设计的引物对，进行定量PCR。此外，也能用来自待测植物样品的核酸作为模板，使用这样设计的引物对和探针，进行定量PCR。对反应混合物没有任何限制，因为本领域技术人员能容易地制备反应混合物。例如，可用适量的模板核酸、引物对、PCR缓冲溶液、dNTP、氯化镁、DNA聚合酶等制备反应混合物。例如，可使用从样品中提取的约50ng DNA，在25μl总体积中以约0.2-0.5μM的终引物浓度进行反应。对PCR条件也没有限制，可如下进行：在95℃下保持10分钟，95℃ 30秒、58℃ 30秒、72℃ 30秒共40个循环，在40个循环后在72℃下保持7分钟，然后保持于4℃。本领域技术人员可容易地优化该条件，可任选地改变温度和每个步骤的时间。而且，这种反应可用众所周知的设备进行。

通过进行定量PCR能获得样品中重组DNA的分子数。对于定量PCR，众所周知，通过测定将要扩增的靶DNA序列的初始含量获得的数值不总是直接说明基因重组体的含量。例如，如图1所示，由于导入基因重组体内的DNA序列在系与系之间高度不同，而且每种基因重组体的每个植物基因组的拷贝数具有多样性，因此不能简单地计算含量比。例如，cryIA(b)的编码区被导入了Event176系和Bt11系以及MON810系中，研究者报道，已经将2个或多个拷贝导入Event176中，将1个拷贝导入了Bt11中，至少1个拷贝导入了MON810中。另外，PCR可能被反应系统中的污染物所抑制。

根据本发明，重组DNA序列的分子数如下确定：通过用已知含量的内部标准进行定量PCR以绘制标准曲线，对样品进行类似的定量PCR，用标准曲线确定分子数。

内源序列的分子数可以用类似的方法确定。另一方面，对于纯基因重组体，通过定量PCR预先测定基因重组体中DNA序列的分子数和内部DNA序列的分子数，以将这些测定值之比定义为“定量比”。由于定量比代表取决于已经导入每种基因重组体内的重组DNA序列的数量和类型的唯一值，通过用式(1)将定量值转化为基因重组体的含量比，严格考虑系与系之间重组DNA序列的多样性。根据本发明，例如，由于反应系统本身的干扰因素(如样品DNA溶液中可能含有的PCR抑制剂和DNA提取过程中产量的差异)引起的测定值的误差将有可能避免。

优选地对样品中可能含有的所有基因重组体的每一种计算定量比，但是只获得其中一部分的定量比也是可以接受的。一旦获得定量比值，即能利用定量比值作为系数，根据将要扩增的靶DNA序列的初始含量，和反应开始时内部标准序列的初始含量，获得初始样品中基因重组体的含量比，因为定量比值对于将要PCR扩增的目标区和基因重组系是唯一的。

这种内部标准可以是，例如：玉米共有的特定内部DNA序列，特别是内部基因序列，大豆共有的特定内部DNA序列，特别是内部基因序列或人工构建的标准分子。

适用于本发明的标准分子是如下的重组DNA分子，它在单个分子上含有至少一种对至少一种、优选地两种或两种以上的基因重组系特异的重组DNA序列，和至少一种对应于该重组体的物种所共有的内部DNA序列。本发明也可以使用这样的重组DNA分子，它在单个分子上含有至少一种对各基因重组系非特异的但是常用于基因重组体的重组DNA，和至少一种相应的物种所共有的内部DNA序列。该重组DNA分子除上述序列外，还可含有用于在合适宿主中复制的不同序列或用于筛选携带标准分子的宿主的标记基因。利用合适的限制酶或通过PCR扩增分子的一部分，也能从重组DNA分子中获得可用作标准分子的最小区。然而，根据本发明的重组DNA分子应当具有易于控制进行PCR的分子数的特征。例如，当根据本发明的完整核苷酸序列已知或者分子量已知时，能够控制用于进行PCR的分子数。必要时可测定重组DNA分子的核苷酸序列或分子量。

如上所述，例如，可使用玉米共有的特异内部基因序列或其部分，或大豆共有的特异内部基因序列或其部分，作为内部DNA序列。例如，可以使用CaMV 35S启动子序列、Nos终止子序列及其部分作为基因重组体所共有的重组DNA序列。例如，可以使用来自已导入每个系中的单个基因的DNA序列作为单个重组系特异的DNA序列。

这种标准分子可以按照本领域技术人员周知的分子生物学技术构建。例如，通过用具尾引物连续克隆限制片段或重复组合PCR产物，可以构建该分子。该分子优选地构建为一种能够在合适的宿主(如微生物、动物细胞和植物细胞)中自主复制的重组DNA分子。当标准分子构建为质粒时，优选地使用限制酶切割后的线性分子，因为超螺旋的形成可以使PCR反应系统不稳定。在这些情况中，可用任何限制酶酶切，只要该酶不切割将要扩增的靶DNA序列。

具体而言，在本发明的一个实施方案中，标准分子含有大豆le1基因序列的一部分作为内部DNA序列，并且含有Roundup Ready Soy系特异的DNA序列作为待测重组DNA。在本发明的另一个实施方案中，标准分子含有玉米zSSIIb基因的一部分作为内部标准，并且分别含有对GA21、T25、MON810、Event176和Bt11系特异的DNA序列，即，m-epsps-NOS终止区、pat-35S终止区、adh1-1S-cryIA(b)区、cryIA(b)-PEPC#9区和cryIA(b)-NOS终止区。在这些实施方案中，标准分子是能够在大肠杆菌中自主复制的DNA分子。

具体而言，根据本发明的定量PCR和目的DNA序列分子数的测定例如可以按照下列方法进行。

(i)标准曲线的绘制

在可根据内部DNA序列扩增或基因重组体特异的DNA序列扩增的进展提高荧光强度的探针存在下，用不同数目的标准分子、用于扩增基因重组系特异性DNA序列或对应于该重组体的物种所共有的内部DNA序列的引物，进行PCR。每隔预定的循环次数，监测每次反应的荧光强度，反应中用数量确定的标准分子作为反应开始时存在的模板DNA(图14(A)，(B))。同步测定荧光增强的阈值(ΔRn)，在荧光强度和循环数之间观察到指数关系。例如，在图14中ΔRn设为10^-1。以PCR循环次数作为纵轴，以反应开始时存在的模板DNA的分子数作为横轴，可将达到阈值时的PCR循环数对反应开始时存在的DNA模板的分子数作图，生成标准曲线(图15)。

(ii)样品DNA的PCR

关于样品中可能含有的基因重组系特异的DNA序列和对应于该基因重组体的物种所共有的内部DNA序列，分别对样品中基因重组体特异的DNA序列和内部DNA序列进行定量PCR。基因重组体特异的DNA序列可以是对每种基因重组系特异的序列，或者可以是两种或多种基因重组系通常共有的序列。对每种基因重组体特异的DNA序列和内部DNA序列的PCR可以在同一反应中进行，或在分开的反应中进行，但要保证在两个反应中模板DNA分子相同。

(iii)基因重组体特异的DNA序列的分子数和内部DNA序列的分子数的测定

可以对上述每种个别序列进行PCR，监测作为扩增指示的信号，以确定信号达到步骤(i)所定义的阈值的循环数。然后利用步骤(i)中生成的标准曲线，将获得的循环数转化为在反应开始时存在的分子数。

当已经获得(i)中定义的标准曲线时，可将此标准曲线用于步骤(ii)之后的程序。

一旦获得样品中重组体特异的DNA序列的分子数、内部DNA序列的分子数和各重组体的定量比，即能根据上述式(I)或式(III)计算出样品中所含基因重组体的总含量比或每个系的分别的含量比。在式(I)或式(III)中，可以选择对每种基因重组系特异的DNA序列或非系特异的但是常用于基因重组体的DNA序列作为待定量的重组DNA序列。

当选择前者时，可以在重复分析所有基因重组系之后将样品中每个系的含量比相加，准确定量样品中基因重组体的总含量比，因为样品中各个系的分别的含量比能够准确确定。这种方法在许多情况下可能适用于在销售渠道中所分析的样品是多个系混合物的销售模式。

当选择后者时，由于能同时测定多个系的近似含量比，因此可能是一种适于方便地定量样品中全部基因重组体的近似总含量比的标准样品。在这些情况中，可选择经计算的多个基因重组系的定量比值中的任一个作为式(I)中的定量比，但是在这些数值中使用最小定量比是优选的。这将使得估计基因重组体含量比的最大可能值成为可能。

(实施例)

下列实施例可以说明本发明，但是这些实施例只是为了说明，本发明的范围不只限于这些实施例。

在下列实施例中使用下列样品、试剂和设备。

(1)样品

对于玉米(Zea mays)使用下列6个品种的干种子：

基因重组玉米：BT11系、Event176系、MON810系、T25系和GA21系的子代品种。

非重组玉米：Dairyland 1412

对于大豆(Glycine max)使用下列2个品种的干种子：

基因重组大豆：Roundup Ready Soy的子代品种

非重组大豆：Murayutaka种

对于水稻(Oryza sativa)使用下列品种的干种子：

非重组水稻：Kinuhikari种

对于小麦(Triticum aestivum)使用下列品种的干种子：

非重组小麦：Haruyutaka种

对于大麦(Hordeum vulgare)使用下列品种的干种子：

非重组大麦：Harrington种

(2)试剂

DNA提取使用下列试剂：

十二烷基硫酸钠(SDS)(保证试剂)(Sigma Chemical Co.)

QIAGEN DNeasy Plant Maxi试剂盒(QIAGEN GmbH)

QIAGEN DNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN GmbH)

电泳使用下列试剂：

乙酸(保证试剂)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)

三[羟甲基]氨基甲烷(Tris)(保证试剂)(Sigma Chemical Co.)

乙二胺四乙酸(EDTA)(保证试剂)(Sigma Chemical Co.)

琼脂糖粉“LO3「TaKaRa」”(TaKaRa Shuzo Co.，Ltd.)

溴化乙锭(Sigma Chemical Co.)

Ficoll 400(Sigma Chemical Co.)

溴酚蓝(Sigma Chemical Co.)

二甲苯腈蓝(Sigma Chemical Co.)

DNA标记物“lambda的HindIII消化产物”(New England BiolabsInc.)

DNA标记物“1kb ladder”(New England Biolabs Inc.)

DNA标记物“100bp ladder”(New England Biolabs Inc.)

定量PCR使用下列试剂：

DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)×10PCR缓冲液II(PE Biosystems)

生产和纯化质粒使用下列试剂：

DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)×10PCR缓冲液II(PE Biosystems)

DNA聚合酶“KOD”(TOYOBO Co.，Ltd.)×10PCR缓冲液II(TOYOBO Co.，Ltd.)

TOPO TA克隆试剂盒，带有TOP10F′细胞(Invitrogen Co.)

酵母提取物(Difco Laboratories)

胰蛋白胨(Difco Laboratories)

NaCl(保证试剂)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)

琼脂粉(Syoei Kanten Ltd.)

D[-]-α-氨苄青霉素(氨苄西林)钠盐(Sigma Chemical Co.)

QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN GmbH)

乙醇(保证试剂)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)

2-丙醇(保证试剂)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)

三[羟甲基]氨基甲烷(Tris)(保证试剂)(Sigma Chemical Co.)

乙二胺四乙酸(EDTA)(保证试剂)(Sigma Chemical Co.)

限制酶“HindIII”(TaKaRa Shuzo Co.，Ltd.)

限制酶“BamHI”(TOYOBO Co.，Ltd.)

限制酶“SmaI”(New England Biolabs Inc.)

限制酶“SrfI”(New England Biolabs Inc.)

苯酚(保证试剂)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)

氯仿(保证试剂)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)

异戊醇(保证试剂)(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)

定量PCR使用下列试剂：

TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems)

(3)设备

从样品中提取DNA使用下列设备：

成粒机″Multi Beads Shocker MB301″(Yasui Kikai Co.)

成粒机″DM-6″(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)

轻触式混合器″Tube mixer″(Yamato Scientific Co.，Ltd.)

超级脱盐机″CPW-200″(ADVANTEC Toyo Kaisya Ltd.)

孵箱″Thermo Minder SD mini″(TAITEC Co.)

离心机″himac CT13″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)

离心机″himac CF15D2″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)

离心机″AllegraTM 6KR″(Beckman Coulter，Inc.)

分光光度计″DU7400″(Beckman Coulter，Inc.)

DNA电泳使用下列设备：

电泳装置″Mupid 2″(Advance Co.，Ltd.)

成像分析仪″Molecular Imager^R FX″(BioRad Laboratories Inc.)

定量PCR使用下列设备：

热循环仪″PTC-200″(MJ Research Inc.)

热循环仪″PCR System 9700″(PE Biosystems)

生产和纯化质粒使用下列设备：

摇床孵箱“Thermostat Shaking Incubator AT24R″(Thomas KagakuCo.，Ltd.)

热循环仪″PTC-200″(MJ Research Inc.)

热循环仪″PCR System 9700″(PE Biosystems)

离心机″himac CT13″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)

离心机″himac CF15D2″(Hitachi Koki Co.，Ltd.)

定量PCR使用下列设备：

定量PCR仪″ABI PRISM 7700序列检测系统″(PE Biosystems)

定量PCR仪″ABI PRISM 5700序列检测系统″(PE Biosystems)

(4)其它

引物合成委托Greiner Japan K.K.

探针合成委托PE Biosystems Japan K.K.

DNA序列验证委托Greiner Japan K.K.

实施例1 DNA的提取

从玉米、大豆、水稻、小麦、大麦中提取DNA按照下列程序进行。首先，用成粒机“DM-6”(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)将样品研磨成粉末，然后从磨碎的产物中称取500-1000mg，用QIAGEN DNeasy PlantMaxi试剂盒(QIAGEN GmbH)，按照厂商推荐方案从中提取DNA。

为了从一个玉米粒或大豆粒中提取DNA，首先用1％SDS充分洗涤粒表面，之后用成粒机“Multi Beads Shocker MB301”(Yasui Kikai Co.)碾碎，然后全部研磨产物都进行DNA提取。

实施例12、13、14描述的从双盲样品中提取DNA按照下列方法进行。以下以玉米为例描述，但是对于大豆也能使用类似的方法。首先，用1％SDS溶液分别洗涤基因重组玉米和非重组玉米，之后干燥。然后用成粒机“DM-6”(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)分别研磨，每种研磨产物称取1g，用成粒机“DM-6”(Yu Chi Machinery Co.，Ltd.)混合基因重组玉米和非重组玉米。从混合样品中称取500-1000mg，用QIAGEN DNeasy Plant Maxi试剂盒(QIAGEN GmbH)按照厂商推荐方案从研磨产物中提取DNA。提取的所有DNA溶液各1μL与1μL 10x加样缓冲液(20％Ficoll 400，0.1M EDTA，1.0％SDS，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈蓝)混合后进行电泳，以证实在提取过程中未发生降解。即，使用电泳装置“Mupid 2”(Advance Co.，Ltd.)和含有溶于TAE缓冲液(0.04M Tris，0.04M乙酸，0.001M EDTA)的50μg溴化乙锭(SigmaChemical Co.)的0.8％琼脂糖凝胶，在100V下电泳15分钟。凝胶中的DNA用成像分析仪“Molecular Imager^R FX”(BioRad LaboratoriesInc.)证实。

另外，也对提取的所有DNA溶液各1μL进行分光光度测定，以测定其浓度和纯度。即，测定用49μL TE缓冲液稀释50倍的样品在230nm、260nm、280nm下的吸光度并根据1A₂₆₀单位＝50μg计算其浓度和纯度。

提取的所有DNA都于-20℃贮存。

实施例2：检测区的选择(设计引物对和探针)

用从多个基因重组系的每个子代品种中提取的DNA测定重组DNA序列，测序引物如表1所示。

表1.测序引物

引物	SEQ ID NO	核苷酸序列(5’-＞3’)
引物	SEQ ID NO	核苷酸序列(5’-＞3’)	crylA 1-5’T35S 2-3’	12	TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA ATGG ATT TTG GTT TTA GGA ATT AGA AA
adh1 1-5’NOS ter 1-3’	34	GCA CTG AAT TTG TGA ACC CCTA TAT TTT GTT TTC TAT CGC	crylA 1-5’T35S 2-3’	12
adh1 1-5’NOS ter 1-3’	34	GCA CTG AAT TTG TGA ACC CCTA TAT TTT GTT TTC TAT CGC	P35S-5′NOS ter 2-3’	56	ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG TTTA TCC TAG TTT GCG CGC TA
rAct pro-5’NOS ter-3’	78	ATC TTT GGC CTT GGT AGT TTGATT GCG GGA CTC TAA TCA TAA	P35S-5′NOS ter 2-3’	56	ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG TTTA TCC TAG TTT GCG CGC TA
rAct pro-5’NOS ter-3’	78	ATC TTT GGC CTT GGT AGT TTGATT GCG GGA CTC TAA TCA TAA	P35S-5’T35S-3’	910	ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG TACT AAG GGT TTC TTA TAT GCT CAA CA
CM01CR01	1112	CAC TAC AAA TGC CAT CAT TGC GAT AGAT GTT TGG GTT GTT GTC CAT	P35S-5’T35S-3’	910
CM01CR01	1112		CaM03-5’EPSPS01-3’	1314	CCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATAATC CTG GCG CCC ATG GCC TGC ATG

表1.(续表)

引物	区	扩增靶标	扩增区长度
引物	区	扩增靶标	扩增区长度	CrylA 1-5’T35S 2-3’	cryIA(b)/有义35S ter/反义	Event176	2.1kb
adh1 1-5’NOS ter 1-3’	Adh1-1S IVS6/有义NOS ter/反义	Bt11	2.1kb	CrylA 1-5’T35S 2-3’	cryIA(b)/有义35S ter/反义	Event176	2.1kb
adh1 1-5’NOS ter 1-3’	Adh1-1S IVS6/有义NOS ter/反义	Bt11	2.1kb	P35S-5′NOS ter 2-3′	P35S/有义NOS ter/反义	Bt11	1.1kb
rAct pro-5′NOS ter-3′	rActin pro/有义NOS ter/反义	GA21	2.3kb	P35S-5′NOS ter 2-3′	P35S/有义NOS ter/反义	Bt11	1.1kb
rAct pro-5′NOS ter-3′	rActin pro/有义NOS ter/反义	GA21	2.3kb	P35S-5′T35S-3′	P35S/有义35S ter/反义	T25	0.8kb
CM01CR01	CaMV/有义cryIA(b)/反义	MON810	1.4kb	P35S-5′T35S-3′	P35S/有义35S ter/反义	T25	0.8kb
CM01CR01	CaMV/有义cryIA(b)/反义	MON810	1.4kb	CaM03-5′EPSPS01-3′	P35S/有义CP-4-epsps/反义	Roundup ReadySoy	513bp

<序列表>

SEQ ID NO：1-14：PCR引物

为了扩增涵盖所导入DNA序列含有的多个DNA序列的区域，设计用于扩增基因重组系特异的DNA序列的引物对。即，设计引物对，用来对Bt11系的子代品种扩增cryIA(b)-Nos终止子和adh1-S-cryIA(b)，对Event176系的子代品种扩增cryIA(b)-PEPC#9，对MON810系的子代品种扩增hsp70-cryIA(b)，对T25系的子代品种扩增pat-35S，对GA21系的子代品种扩增m-epsps-NOS和OPT-m-epsps，对RoundupReady Soy系的子代品种扩增CPT4-CP4-epsps。

为了扩增CaMV 35S启动子序列的内部序列或NOS终止子序列的内部序列，设计用于扩增不是系特异的但是常用于基因重组体的DNA序列的引物对。

另外，选择玉米zSSIIb基因的内部序列或大豆le1基因的内部序列作为生物具有的特异内源基因的DNA序列。为了设计这些引物，通过检索基因组数据库获得这些序列。

在引物之间，设计Tm值比引物的Tm值大约高10℃的探针(表2A和2B)。

表2A.用于玉米的引物/探针

SEQ ID NO	引物/探针	扩增区域扩增靶标	扩增长度
SEQ ID NO	引物/探针	扩增区域扩增靶标	扩增长度	1516	SSIIb 1-5′SSIIb 1-3′	zSSIIb/有义zSSIIb/反义	151bp
17	SSIIb-Taq	玉米固有的		1516	SSIIb 1-5′SSIIb 1-3′	zSSIIb/有义zSSIIb/反义	151bp
17	SSIIb-Taq	玉米固有的		1819	P35S 1-5′P35S 1-3′	35S-pro/有义35S-pro/反义	101bp
20	P35S-Taq	CaM35S-pro		1819	P35S 1-5′P35S 1-3′	35S-pro/有义35S-pro/反义	101bp
20	P35S-Taq	CaM35S-pro		2122	NOS ter 2-5′NOS ter 2-3′	NOS-ter/有义NOS-ter/反义	151bp
23	NOS-Taq	NOS ter		2122	NOS ter 2-5′NOS ter 2-3′	NOS-ter/有义NOS-ter/反义	151bp
23	NOS-Taq	NOS ter		2425	E176 2-5′E176 2-3′	cryIA(b)/有义PEPC#9内含子/反义	100bp
26	E176-Taq	Event176		2425	E176 2-5′E176 2-3′	cryIA(b)/有义PEPC#9内含子/反义	100bp
26	E176-Taq	Event176		2728	Bt11 2-5′Bt11 2-3′	cryIA(b)/有义NOSter/反义	151bp
29	Bt11-Taq	Bt11		2728	Bt11 2-5′Bt11 2-3′	cryIA(b)/有义NOSter/反义	151bp
29	Bt11-Taq	Bt11		3031	GA21 2-5′GA21 2-3′	m-epsps/有义NOS ter/反义	141bp
32	GA21-Taq	GA21		3031	GA21 2-5′GA21 2-3′	m-epsps/有义NOS ter/反义	141bp
32	GA21-Taq	GA21		3334	T25 1-5′T25 1-3′	pat/有义35S-ter/反义	149bp
35	T25-Taq	T25		3334	T25 1-5′T25 1-3′	pat/有义35S-ter/反义	149bp
35	T25-Taq	T25		3637	M810 2-5′M810 2-3′	hsp70/有义cryIA(b)/反义	113bp
38	M810-Taq	MON810		3637	M810 2-5′M810 2-3′	hsp70/有义cryIA(b)/反义	113bp
38	M810-Taq	MON810		39	Bt11 3-5’	adh1-SIVS6/有义	128bp

40	Bt11 3-3’	cryIA(b)/反义
40	Bt11 3-3’	cryIA(b)/反义		41	Bt11 2-Taq	Bt11
4243	GA21 3-5’GA21-3-3’	OTP/有义m-epsps/反义	133bp	41	Bt11 2-Taq	Bt11
4243	GA21 3-5’GA21-3-3’	OTP/有义m-epsps/反义	133bp	44	GA21 2-Taq	GA21
7778	SSIIb 2-5′SSIIb 2-3′	zSSIIb/有义zSSIIb/反义	133bp	44	GA21 2-Taq	GA21
7778	SSIIb 2-5′SSIIb 2-3′	zSSIIb/有义zSSIIb/反义	133bp	7980	SSIIb 3-5′SSIIb 3-3′	zSSIIb/有义zSSIIb/反义	114bp

表2A.续表

SEQ IDNO
SEQ IDNO		1516	CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG CTCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG
17	5′-Fam-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-Tamra-3′	1516	CTC CCA ATC CTT TGA CAT CTG CTCG ATT TCT CTC TTG GTG ACA GG
17	5′-Fam-AGC AAA GTC AGA GCG CTG CAA TGC A-Tamra-3′	1819	ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG TCCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T
20	5′-Fam-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-Tamra-3′	1819
20	5′-Fam-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-Tamra-3′	2122	GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TGCGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T
23	5′-Fam-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-Tamra-3′	2122
23	5′-Fam-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-Tamra-3′	2425	TGT TCA CCA GCA GCA ACC AGACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T
26	5′-Fam-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-Tamra-3′	2425	TGT TCA CCA GCA GCA ACC AGACT CCA CTT TGT GCA GAA CAG ATC T
26	5′-Fam-CCG ACG TGA CCG ACT ACC ACA TCG A-Tamra-3′	2728	TTA GCG CTC ATG TGT TCA ATT CTCGG CAA CAG GAT TCA ATC TTA A
29	5′-Fam-ACA TTG ACC GTA TTG AGT TTG TGC CTG CC-Tamra-3′	2728	TTA GCG CTC ATG TGT TCA ATT CTCGG CAA CAG GAT TCA ATC TTA A

3031	GAC CTT CCC CGA CTA CTT CGAATC GCA AGA CCG GCA ACA
3031	GAC CTT CCC CGA CTA CTT CGAATC GCA AGA CCG GCA ACA	32	5′-Fam-CGA ATT TCC CCG ATC GTT CAA ACA TTT-Tamra-3′
3334	GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCATGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT	32	5′-Fam-CGA ATT TCC CCG ATC GTT CAA ACA TTT-Tamra-3′
3334	GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCATGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT	35	5′-Fam-CAT GCC CGC TGA AAT CAC CAG TCT CT-Tamra-3′
3637	GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG AGGA TGC ACT CGT TGA TGT TTG	35	5′-Fam-CAT GCC CGC TGA AAT CAC CAG TCT CT-Tamra-3′
3637	GAT GCC TTC TCC CTA GTG TTG AGGA TGC ACT CGT TGA TGT TTG	38	5′-Fam-AGA TAC CAA GCG GCC ATG GAC AAC AA-Tamra-3′
3940	CAA TGC GTT CTC CAC CAA GTA CTAAA AGA CCA CAA CAA GCC GC	38	5′-Fam-AGA TAC CAA GCG GCC ATG GAC AAC AA-Tamra-3′
3940	CAA TGC GTT CTC CAC CAA GTA CTAAA AGA CCA CAA CAA GCC GC	41	5’-Fam-CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA-Tamra-3’
4243	ATC CGG TTG GAA AGC GAC TTGAA GCC TCG GCA ACG TCA	41	5’-Fam-CGA CCA TGG ACA ACA ACC CAA ACA TCA-Tamra-3’
4243	ATC CGG TTG GAA AGC GAC TTGAA GCC TCG GCA ACG TCA	44	5’-Fam-AAG GAT CCG GTG CAT GGC CG-Tamra-3’
7778	TCC CAA TCC TTT GAC ATC TGC TGAC AGG AGC TGA TGG ATG ATC AG	44	5’-Fam-AAG GAT CCG GTG CAT GGC CG-Tamra-3’
7778	TCC CAA TCC TTT GAC ATC TGC TGAC AGG AGC TGA TGG ATG ATC AG	7980	CCA ATC CTT TGA CAT CTG CTC CGAT CAG CTT TGG GTC CGG A

<序列表>

SEQ ID NOs：15、16、18、19、21、22、24、25、27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、77、78、79、80：PCR引物

SEQ ID NO：17：用于玉米zSSIIB的探针

SEQ ID NO：20：用于CaMV 35S启动子的探针

SEQ ID NO：23：用于NOS终止子的探针

SEQ ID NO：26：用于Event176的探针

SEQ ID NO：29：用于Bt11的探针

SEQ ID NO：32：用于GA21的探针

SEQ ID NO：35：用于T25的探针

SEQ ID NO：38：用于MON810的探针

SEQ ID NO：41：用于Bt11的探针

SEQ ID NO：44：用于GA21的探针

表2B.用于大豆的引物/探针

SEQ IDNO	引物/探针	设计的区域扩增靶标	扩增长度
SEQ IDNO	引物/探针	设计的区域扩增靶标	扩增长度	4546	Le1n 02-5’Le1n 02-3’	le1/有义le1/反义	118bp
47	Le1-Taq	大豆固有的		4546	Le1n 02-5’Le1n 02-3’	le1/有义le1/反义	118bp
47	Le1-Taq	大豆固有的		4849	RRS 01-5’RRS 01-3’	CTP4/有义CP4-<u>epsps</u>/反义	121bp
50	RRS-Taq	Roundup Ready Soy		4849	RRS 01-5’RRS 01-3’	CTP4/有义CP4-<u>epsps</u>/反义	121bp
50	RRS-Taq	Roundup Ready Soy		1819	P35S 1-5′P35S 1-3′	35S-pro/有义35S-pro/反义	101bp
20	P35S-Taq	CaM35S-pro		1819	P35S 1-5′P35S 1-3′	35S-pro/有义35S-pro/反义	101bp
20	P35S-Taq	CaM35S-pro		2122	NOS ter 2-5′NOS ter 2-3′	NOS-ter/有义NOS-ter/反义	151bp
23	NOS-Taq	NOS ter		2122	NOS ter 2-5′NOS ter 2-3′	NOS-ter/有义NOS-ter/反义	151bp

表2B.(续表)

SEQ ID NO	核苷酸序列(5’-＞3’)
SEQ ID NO	核苷酸序列(5’-＞3’)	4546	GCC CTC TAC TCC ACC CCC AGCC CAT CTG CAA GCC TTT TT
47	5′-Fam-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-Tamra-3′	4546	GCC CTC TAC TCC ACC CCC AGCC CAT CTG CAA GCC TTT TT
47	5′-Fam-AGC TTC GCC GCT TCC TTC AAC TTC AC-Tamra-3′	4849	CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGGGAC TTG TCG CCG GGA ATG
50	5′-Fam-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-Tamra-3′	4849	CCT TTA GGA TTT CAG CAT CAG TGGGAC TTG TCG CCG GGA ATG
50	5′-Fam-CGC AAC CGC CCG CAA ATC C-Tamra-3′	1819	ATT GAT GTG ATA TCT CCA CTG ACG TCCT CTC CAA ATG AAA TGA ACT TCC T
20	5′-Fam-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-Tamra-3′	1819
20	5′-Fam-CCC ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT-Tamra-3′	2122	GTC TTG CGA TGA TTA TCA TAT AAT TTC TGCGC TAT ATT TTG TTT TCT ATC GCG T
23	5′-Fam-AGA TGG GTT TTT ATG ATT AGA GTC CCG CAA-Tamra-3′	2122

<序列表>

SEQ ID NO：45，46、48、49：PCR引物

SEQ ID NO：47：用于大豆le1的探针

SEQ ID NO：50：用于Roundup Ready Soy的探针

实施例3：引物对特异性的证实(定量PCR)

证实实施例2设计的引物对在定量PCR中是否能够只特异检测其靶序列。

用Bt11系、Event176系、MON810系、GA21系和T25系的子代品种和非重组玉米Dairyland 1412作为玉米样品。用Roundup Ready Soy系的子代品种和非重组大豆Murayutaka作为大豆样品。使用与实施例1相同的方法从各种样品中提取总共8种DNA。

由于在实测样品中具有污染玉米和大豆之外的其它主要作物的可能性，所以也利用与实施例1相同的方法，分别从水稻(Kinuhikari种)、小麦(Haruyutaka种)和大麦(Harrington种)中提取3种DNA。

在定量PCR中，用以上提取的总共11种DNA作为PCR模板，用蒸馏水作为阴性对照。用热循环仪“PTC-200”(MJ Research Inc.)进行反应。在该实验中，每条引物均在PCR溶液中以0.5μM的终浓度使用。从各样品(模板)中提取的DNA以每个反应系统25ng的量使用。DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)以每个反应系统0.625单位的量使用，作为PCR酶。x10PCR缓冲液II(PE Biosystems)以2.5μL的体积使用，作为反应缓冲液，MgCl₂和dNTP分别以每个反应系统1.5mM和200μM的浓度使用。反应系统用蒸馏水补充至20μL。

采用的反应条件如下：95℃下保持10分钟，95℃ 30秒、58℃30秒、72℃ 30秒共40个循环，随后在72℃下保持7分钟，并保持于4℃。

反应完成后，从反应溶液中取样5μL，与1μL 10x加样缓冲液混合，然后利用电泳装置″Mupid 2″(Advance Co.，Ltd.)，在溶于TAE缓冲液的3％琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟。凝胶用溴化乙锭(SigmaChemicals Co.)染色15分钟后，利用成像分析仪“Molecular Imager^RFX”(BioRad Laboratories Inc.)证实PCR扩增产物的存在。

实验结果的一个例子如图2所示。从而证实，为检测T25系的子代品种而设计的引物对能够只特异检测T25系的子代品种，显示与其它样品无交叉反应。

表3总结了以同一方法证实的所有结果。如表3所示，证实所有引物对都能只分别特异检测不同基因重组系的靶子代品种。

表3.引物对和探针的特异性

表3.(续表)

^*1：Roundup Ready Soy，+：阳性，-：阴性

实施例4：引物对和探针特异性的证实(定量PCR)

证实实施例2设计的引物对和探针在定量PCR中是否能够只特异检测其靶序列。

如同实施例3一样，用Bt11系、Event176系、MON810系、GA21系和T25系的子代品种和非重组玉米Dairyland 1412作为玉米样品；用Roundup Ready Soy系的子代品种和非重组大豆Murayutaka作为大豆样品。利用与实施例1相同的方法从各种样品中提取总共8种DNA。

在定量PCR中，用以上提取的总共11种DNA作为PCR模板，用蒸馏水作为阴性对照。用定量PCR装置“ABI PRISM 7700序列检测系统”(PE Biosystems)进行反应。在该实验中，每种引物以0.5μM的终浓度使用，探针在反应溶液中以0.2μM的终浓度使用。从各个样品(模板)中提取的DNA以每个反应系统50ng的量使用，TaqMan Universal PCRMaster Mix(PE Biosystems；下文简称为“Master Mix”)以每个反应系统12.5μL的体积使用。反应系统补充为25μL。

采用的反应条件如下：反应溶液在50℃下保持2分钟，然后在95℃下10分钟，95℃ 30秒和59℃1分钟共40个循环，随后保持于25℃。

在反应过程中，随时间变化测量每个反应孔的荧光强度。在反应完成后，通过分析每孔中荧光强度变化的时程，能确定荧光强度增加的孔。荧光强度的增加是由于与PCR扩增相关的探针降解的结果。因此，在观察到荧光强度增加的孔中，可以认为发生了PCR扩增，并且探针降解。

实验结果的一个例子如图3所示。可以证实，为检测NOS终止子而设计的引物对和探针能够只特异检测Bt11系、GA21系和Roundup ReadySoy系的子代品种，显示与其它样品无交叉反应。

表4总结了用同一方法证实的所有结果。如表4所示，可以证实，所有引物对和探针都能够只分别特异检测其基因重组系的靶子代品种。

表4.探针和引物对的特异性

表4.(续表)

^*1：Roundup Ready Soy，+：阳性，-：阴性

实施例5：标准分子的制备(玉米)

实施例2选择的待测区域的整合按照图4所示的方法进行。

即，利用表5所示的具尾引物，用从相应多种基因重组系中提取的DNA作为模板，连续进行PCR，获得在其末端含有与其它待测靶区互补的序列的多种PCR产物。

用如下反应系统进行PCR，其含有10ng玉米DNA作为模板，各0.5μM具尾引物，0.156单位DNA聚合酶“KOD”(TOYOBO Co.，Ltd.)，160μM dNTP，1.5mM MgCl₂和2.5μL x10PCR缓冲液II(TOYOBO Co.，Ltd.)，用蒸馏水补充至25μL的总体积。

采用的反应条件如下：在98℃下保持1分钟，然后98℃ 30秒、54℃ 30秒、74℃1分钟共35个循环，随后在74℃下保持2分钟，并保持于4℃。

得到的每种PCR产物，与欲邻接的区域的扩增的一种PCR产物一起，利用PCR进行整合反应。即，预先扩增的0.25μL各种PCR产物与0.156单位DNA聚合酶“KOD”(TOYOBO Co.，Ltd.)、160μM dNTPs、1.5mMMgCl₂和2.5μL x10PCR缓冲液II(TOYOBO Co.，Ltd.)混合，用蒸馏水补充至24.5μL的总体积。首先，不使用任何引物对该反应系统进行PCR扩增。

采用的反应条件如下：在98℃下保持1分钟，然后98℃ 30秒、56℃ 30秒、74℃1分钟共8个循环，此时终止反应。

然后，以0.5μM的量向反应系统中加入各远端引物，进一步进行PCR反应，获得两个区域结合的扩增产物。

在第二次反应中采用的反应条件如下：在98℃下保持1分钟，然后98℃ 30秒、56℃ 30秒、74℃1分钟共30个循环，随后在74℃下保持2分钟，并保持于4℃。

通过以类似的方法重复该整合反应，产生图5和图6所示的分子。图5所示的分子在核苷酸1-151之间整合了扩增靶标的zSSIIb(GENBANK登记号AF019297)DNA序列，在核苷酸152-252之间整合了扩增靶标的CaMV 35S启动子DNA序列，在核苷酸275-425之间整合了扩增靶标的NOS终止子DNA序列，在核苷酸441-581之间整合了扩增靶标的GA21系特异的DNA序列，在核苷酸582-730之间整合了扩增靶标的T25系特异的DNA序列，在核苷酸731-843之间整合了扩增靶标的MON810系特异的DNA序列，在核苷酸844-951之间整合了扩增靶标的Event176系特异的DNA序列，在核苷酸952-1102之间整合了扩增靶标的Bt11系特异的DNA序列。该区的序列如SEQ ID NO：57所示。图5的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：73所示。

图6所示的分子在核苷酸1-151之间整合了扩增靶标的zSSIIb DNA序列，在核苷酸152-252之间整合了扩增靶标的CaMV 35S启动子DNA序列，在核苷酸275-425之间整合了扩增靶标的NOS终止子DNA序列，在核苷酸441-573之间整合了扩增靶标的GA21系特异的DNA序列，在核苷酸574-722之间整合了扩增靶标的T25系特异的DNA序列，在核苷酸723-835之间整合了扩增靶标的MON810系特异的DNA序列，在核苷酸836-943之间整合了扩增靶标的Event176系特异的DNA序列，在核苷酸944-1071之间整合了扩增靶标的Bt11系特异的DNA序列。图6的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：74所示。

表5.

SEQID NO	引物
SEQID NO	引物		51	SSIIB-P35S-5’	CAT TTG GAG AGG TCG ATT TCT CTC TTG
52	SSIIB-P35S-3’	GAG AGA AAT CGA CCT CTC CAA ATG AAA	51	SSIIB-P35S-5’	CAT TTG GAG AGG TCG ATT TCT CTC TTG
52	SSIIB-P35S-3’	GAG AGA AAT CGA CCT CTC CAA ATG AAA	53	P35S-SrfI-NOS-5’	TAT CAC ATC AAT GCC CGG GCG AAT CCT GTT GCC GG
54	P35S-SrfI-NOS-3’	GGC AAC AGG ATT CGC CCG GGC ATT GAT GTG ATA TCT	53	P35S-SrfI-NOS-5’	TAT CAC ATC AAT GCC CGG GCG AAT CCT GTT GCC GG
54	P35S-SrfI-NOS-3’	GGC AAC AGG ATT CGC CCG GGC ATT GAT GTG ATA TCT	55	NOS-EPN-5’	AAA CTA GGA TAA ATC GCA AGA CCG GCA
56	EPN-T25-5’	TCG GGG AAG CTC TGA GCG AAA CCC TAT	55	NOS-EPN-5’	AAA CTA GGA TAA ATC GCA AGA CCG GCA
56	EPN-T25-5’	TCG GGG AAG CTC TGA GCG AAA CCC TAT	57	T25-M810-5’	GGC CTA ACT GGC GGA TGC ACT CGT TGA
58	T25-M810-3’	ACG AGT GCA TCC GCC AGT TAG GCC AGT	57	T25-M810-5’	GGC CTA ACT GGC GGA TGC ACT CGT TGA
58	T25-M810-3’	ACG AGT GCA TCC GCC AGT TAG GCC AGT	59	M810-E176-5’	GGA GAA GGC ATC GAC TGA CTA CTC CAC
60	M810-E176-3’	GAG TAG TCA GTC GAT GCC TTC TCC CTA	59	M810-E176-5’	GGA GAA GGC ATC GAC TGA CTA CTC CAC
60	M810-E176-3’	GAG TAG TCA GTC GAT GCC TTC TCC CTA	61	E176-Bt11-5’	TGC TGG TGA ACA CGG CAA CAG GAT TCA
62	E176-Bt11-3’	ATC CTG TTG CCG TGT TCA CCA GCA GCA	61	E176-Bt11-5’	TGC TGG TGA ACA CGG CAA CAG GAT TCA
62	E176-Bt11-3’	ATC CTG TTG CCG TGT TCA CCA GCA GCA	63	Le1n-C-EP-3′	CGG CGA CAA GTC GCC CAT CTG CAA GCC
64	C-EP-Le1n-3′	TTG CAG ATG GGC GAC TTG TCG CCG GGA	63	Le1n-C-EP-3′	CGG CGA CAA GTC GCC CAT CTG CAA GCC
64	C-EP-Le1n-3′	TTG CAG ATG GGC GAC TTG TCG CCG GGA	65	NOS-GA21(OTP)-5′	AAA CTA GGA TAA ATC CGG TTG GAA AGC
66	GA21(OTP)-NOS-3′	TTC CAA CCG GAT TTA TCC TAG TTT GCG	65	NOS-GA21(OTP)-5′	AAA CTA GGA TAA ATC CGG TTG GAA AGC
66	GA21(OTP)-NOS-3′	TTC CAA CCG GAT TTA TCC TAG TTT GCG	67	GA21(OTP)-T25-5′	TGC CGA GGC TTC TGA GCG AAA CCC TAT
68	T25-GA21(OTP)-3′	GGG TTT CGC TCA GAA GCC TCG GCA ACG	67	GA21(OTP)-T25-5′	TGC CGA GGC TTC TGA GCG AAA CCC TAT
68	T25-GA21(OTP)-3′	GGG TTT CGC TCA GAA GCC TCG GCA ACG	69	E176-Bt11(adh)-5′	TGC TGG TGA ACA TCA ATG CGT TCT CCA
70	Bt11(adh)-E176-3′	AGA ACG CAT TGA TGT TCA CCA GCA GCA	69	E176-Bt11(adh)-5′	TGC TGG TGA ACA TCA ATG CGT TCT CCA
70	Bt11(adh)-E176-3′	AGA ACG CAT TGA TGT TCA CCA GCA GCA	71	Le1-NOS-5′	GGA GTA GAG GGC TTA TCC TAG TTT GCG
72	NOS-Le1-3′	AAA CTA GGA TAA GCC CTC TAC TCC ACC	71	Le1-NOS-5′	GGA GTA GAG GGC TTA TCC TAG TTT GCG

Pro：启动子

表5.(续表)

SEQ ID NO	结合的区域
SEQ ID NO	结合的区域	51	SSIIb+35S Pro
52	SSIIb+35SPro	51	SSIIb+35S Pro
52	SSIIb+35SPro	53	35S Pro+NOS
54	35S Pro+NOS	53	35S Pro+NOS
54	35S Pro+NOS	55	NOS+GA21
56	GA21+T25	55	NOS+GA21
56	GA21+T25	57	T25+M810
58	T25+M810	57	T25+M810
58	T25+M810	59	M810+E176
60	M810+E176	59	M810+E176
60	M810+E176	61	E176+Bt11
62	E176+Bt11	61	E176+Bt11
62	E176+Bt11	63	le1+RRS
64	le1+RRS	63	le1+RRS
64	le1+RRS	65	NOS+GA21
66	NOS+GA21	65	NOS+GA21
66	NOS+GA21	67	GA21+T25
68	GA21+T25	67	GA21+T25
68	GA21+T25	69	E176+Bt11
70	E176+Bt11	69	E176+Bt11
70	E176+Bt11	71	Le1+NOS
72	NOS+Le1	71	Le1+NOS

<序列表>

SEQ ID NO：51-72：PCR引物；

SEQ ID NO：73-74：用于定量检测玉米基因重组体的标准分子的扩增目标区；和

SEQ ID NO：75：用于定量检测大豆基因重组体的标准分子的扩增目标区。

以上制备的每种整合分子用DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PEBiosys tems)再次扩增，用带有TOP 10F′细胞的TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Co.)连接到质粒载体中。使用大肠杆菌宿主载体系统，以便能容易、无限地提供该分子。

即，在与实施例3相同的条件下，对以上制备的各1μL整合分子(模板)进行PCR扩增。反应后，1μL反应溶液与1μL质粒载体pCR2.1TOPO和1μL盐缓冲液混合，将该混合液置于室温下5分钟。2μl反应溶液与试剂盒中提供的大肠杆菌TOP10F′细胞株混合，置于冰上5分钟，然后在42℃下进行热休克处理30秒，以进行转化。

含有转化子的100μL溶液平板接种于LB(氨苄西林)平板上[每升组成：10g胰蛋白胨(Difco Laboratories)，5g酵母提取物(DifcoLaboratories)，5g NaCl(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，15g琼脂粉(Syoei Kanten Ltd.)和50mg D[-]-α-氨苄青霉素钠(Ampicillin)(Sigma Chemical Co.)]，然后置于37℃下过夜，以获得转化子。

为了筛选正确的转化子，对获得的转化子的每个菌落进行直接菌落PCR。即，M13正向引物和M13反向引物(各0.5μM)与0.625单位DNA聚合酶“AmpliTaq Gold”(PE Biosystems)和作为反应缓冲液的2.5μLx10PCR缓冲液II(PE Biosystems)混合。每个反应系统中还加入浓度分别为1.5mM和200μM的MgCl₂和dNTPs。反应系统用蒸馏水补充至25μL的总体积。用牙签挑取菌落，悬浮于反应系统中。

采用的反应条件如下：在95℃下保持5分钟，95℃ 30秒、50℃30秒、72℃ 90秒共35个循环，随后在72℃下保持90秒，并保持于4℃。

对获得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。含有符合预期设计的扩增产物的菌落在40mL LB(氨苄西林)液体培养基[每升的组成：10g胰蛋白胨(Difco Laboratories)，5g酵母提取物(Difco Laboratories)，5g NaCl(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和50mg D[-]-α-氨苄青霉素钠(Ampicillin)(Sigma Chemical Co.)]中37℃培养过夜。

用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN GmbH)从大肠杆菌转化子的大规模培养物中提取质粒。质粒的提取按照试剂盒所附方案进行。

获得的质粒证实具有正确的核苷酸序列，用作标准分子(pMul4和pMul5：图7)。携带质粒pMul4的大肠杆菌ASN-pMul4和携带质粒pMul5的大肠杆菌ASN-pMul5均于2000年10月12日保藏于日本茨城县筑波市1丁目1-3号(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称为独立行政法人产业技术综合研究所国际专利生物保藏单位，日本国茨城县筑波市东1-1-1中央6号，邮编305-8566)，保藏号为FERM BP-7319和FERM BP-7320。

当在定量PCR中使用这些引物时，它们以限制酶BamHI消化制备的线性化分子的形式使用。在下列实施例中，用pMul4的BamHI消化产物(下文称为pMul4BamHI消化产物)作为标准分子。

实施例6：标准分子的制备(大豆)

如同实施例5一样，实施例2选择的待测目标区的整合按照图4所示的方法进行。

即，用表5所示的具尾引物和从相应基因重组系中提取的DNA(模板)进行PCR，获得在其末端含有与其它待测区域互补的序列的PCR产物。得到的PCR产物与欲邻接的区域的扩增的PCR产物一起利用PCR进行整合反应。

上述实验中采用的详细条件与实施例5中采用的条件相同。

通过整合反应获得图8和图9所示的分子。图8所示的分子在核苷酸1-121之间整合了扩增靶标的Roundup Ready Soy系特异的DNA序列，在核苷酸122-239之间整合了扩增靶标的le1(GENBANK登记号K00821M30884)DNA序列。图8的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：75所示。

图9所示的分子在核苷酸1-121之间整合了扩增靶标的RoundupReady Soy系特异的DNA序列，在核苷酸122-239之间整合了待扩增的le1 DNA序列，在核苷酸240-419之间整合了扩增靶标的NOS终止子子DNA序列，在核苷酸428-528之间整合了扩增靶标的CaMV 35S启动子DNA序列。图9的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：75所示。

<序列表>

SEQ ID NOs：75和76：用于定量检测大豆基因重组体的标准分子的扩增目标区。

用带有TOP 10F′细胞的TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Co.)将以上制备的每个整合分子连接到质粒载体中，使用与实施例5相同的方法，使用一种大肠杆菌宿主载体系统，以便能容易、无限地供应该分子。获得的质粒证实具有正确的核苷酸序列，用作标准分子(pMulSL和pMulSL2：图10和图11)。携带质粒pMulSL的大肠杆菌ASN-pMulSL和携带质粒pMulSL2的大肠杆菌ASN-pMulSL2于2000年10月12日保藏于日本茨城县筑波市1丁目1-3号(邮编305-8566)的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称为独立行政法人产业技术综合研究所国际专利生物保藏单位，日本国茨城县筑波市东1-1-1中央6号，邮编305-8566)，保藏号为FERM BP-7321和FERM BP-7322。

当在定量PCR中使用这些引物时，它们以限制酶BamHI消化制备的线性化分子的形式使用。在下面的实施例中，用pMulSL的BamHI消化产物(下文称为pMulSL BamHI消化产物)作为标准分子。

实施例7：作为定性分析的阳性对照的用途

将从Bt11系、GA21系和MON810系的子代品种各1g中提取的DNA样品等量混合在一起。以20ng/μL的DNA浓度，用DNA混合物制备DNA溶液。用该DNA溶液作为双盲玉米样品，用标准分子作为阳性对照，通过定性PCR确定样品中基因重组玉米的存在。

实验中使用的设备和条件(例如反应溶液的组成)与实施例3使用的相同。对表2所示的所有引物对进行定性PCR。在该实验中，用以上制备的DNA溶液作为PCR模板，用实施例5所述的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为阳性对照，用蒸馏水作为阴性对照。标准分子pMul4 BamHI消化产物以每个反应系统500个分子的量使用。

如同实施例3一样，在反应完成后，从反应溶液中取样5μL，在3％琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化乙锭染色，利用成像分析仪证实PCR扩增产物的存在。

实验结果如图12所示，证实样品中含有基因重组玉米Bt11系、GA21系和MON810系的子代品种。也已经证实，标准分子pMul4 BamHI消化产物适合作为定性分析的阳性对照。

特别是对于GA21系和MON810系的子代品种，由于目前还没有市售的标准样品，普通分析者还不能获得这些系的阳性对照。

实施例8：定量比的测定(预试验-玉米)

由于玉米是一种杂种，测定正确的定量比需要遗传学均一的F1种群或与之相当的种群。因此，首先通过定量PCR证实种子的遗传学均一性作为预试验。

对于Bt11系、Event176系、MON810系和GA21系的子代品种，用F1种子作为预试验的样品。对于T25系的子代品种，由于F1种子无法获得，因此用F2种子代替。实验细节在下文中描述。

从上述5个品种各8个种子中提取DNA，用实施例5中所述的pMul4BamHI消化产物作为标准样品，测定提取的DNA中待测目标区(实施例2选择的)的分子数。即，对于待扩增的玉米内源基因zSSIIb的DNA序列，用分别从5个品种提取的DNA作为模板进行定量PCR，以测定样品中该区的分子数。对于待扩增的CaMV 35S启动子的DNA序列，用分别从Bt11系、Event176系、MON810系和T25系的子代品种中提取的DNA作为模板进行定量PCR，以测定样品中该区的分子数。对于待扩增的NOS终止子的DNA序列，用分别从Bt11系和GA21系的子代品种中提取的DNA作为模板进行定量PCR，以测定样品中该区的分子数。对于每个系，均根据式(II)用该实验获得的测定值计算定量比(图13)。

这些实验用定量PCR装置“ABI PRISM 7700序列测定系统”(PEBiosystems)进行。在该实验中，对于定量测定CaMV 35S启动子、NOS终止子和zSSIIb的所有引物，每种PCR溶液的终引物浓度为0.5μM；对于定量CaMV 35S启动子、NOS终止子和zSSIIb的所有探针，终探针浓度为0.2μM。从每种样品中提取的DNA以每个反应系统50ng的量用作为模板，TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Biosystems；下文简称为“Master Mix”)以每个反应系统12.5μL的体积使用。每个反应系统均补充至25μL。同一反应进行三次，求测定值的平均值。

反应中使用的条件如下：反应溶液在50℃下保持2分钟，然后在95℃下保持10分钟，95℃ 30秒、59℃1分钟共40个循环，随后保持于25℃。

为了定量测定CaMV 35S启动子，向反应管中加入12种样品的每一种，包括：以3种浓度(每个反应系统250个分子、1000个分子和50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从单个种子(每个品种总共8个样品)中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向每个待测试管中加入用于定量测定CaMV 35S启动子的引物对和探针和Master Mix，获得反应溶液。

同样，为了定量测定NOS终止子，向反应管中加入12种样品的每一种，包括：以3种浓度(每个反应系统250个分子、1000个分子和50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从单个种子(每个品种总共8个样品)中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向每个待测试管中加入用于定量测定NOS终止子的引物对和探针和Master Mix，获得反应溶液。

同样，为了定量测定内源基因zSSIIb，向反应管中加入12种样品的每一种，包括：以3种浓度(每个反应系统250个分子、1000个分子和50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从单个种子(每个品种总共8个样品)中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向每个待测试管中加入用于定量测定zSSIIb的引物对和探针和Master Mix，获得反应溶液。

在反应过程中，根据荧光强度的增加，随时间变化测定PCR扩增所致探针降解的程度。因此，通过生成作为定量标准(x4)的3种样品的图(循环次数-荧光强度)(见图14)，能够获得待扩增的靶DNA序列的分子数与荧光强度达到特定值所需时间之间的关联函数(见图15)。用此关联函数作为标准曲线，能够确定反应开始时定量样品中存在的将要扩增的CaMV 35S启动子的DNA序列、待扩增的NOS终止子的DNA序列和待扩增的zSSIIb的DNA序列的分子数(表6)。

表6.zSSIIB、CaMV 35S启动子和NOS各自的分子数

样品	zSSIIb	CaMV	NOS
样品	zSSIIb	CaMV	NOS	Bt11 #1#2#3#4#5#6#7#8	3470056500262003840038100340003230031800	3180043000270002940029600303002890031200
T25 #1#2#3#4#5#6#7#8	3520040900298003370022900271003040044300	1150021600200123001800009400100		Bt11 #1#2#3#4#5#6#7#8	3470056500262003840038100340003230031800	3180043000270002940029600303002890031200
T25 #1#2#3#4#5#6#7#8	3520040900298003370022900271003040044300	1150021600200123001800009400100		Event176 #1#2#3#4#5#6#7#8	3700038800338003280036800315003600036300	3380040000343003230033500318003500034500
MON810 #1#2#3	306003470032900	137001410011900		Event176 #1#2#3#4#5#6#7#8	3700038800338003280036800315003600036300	3380040000343003230033500318003500034500

#4#5#6#7#8

3070030300336003160025000

1460012500144001310010300

GA21 #1#2#3#4#5#6#7#8

1510014700141001740015100106001430013500

27600293002850033700299005227002570025700

如图13所示，对于Bt11系、Event176系、MON810系和GA21系的子代品种，在来自8个种子的DNA样品中，定量比几乎不变，证实种子样品是遗传均一的F1群体。然而，由于T25系的子代品种的F1种子无法获得，整合的DNA序列如预期的显示遵循孟德尔法则的子代分布。因此，对于T25系的子代品种，只选择证实与F1群体基因结构相同的种子(在图13中用箭头标记的)，在随后的实验中用该种子群体作为与遗传均一的F1种子群体相当的种子群体。

实施例9：定量比的确定(预试验-大豆)

按照与实施例8相同的方法对大豆进行预试验。用Roundup ReadySoy系的子代品种的F1种子作为预试验的样品。

按照与实施例8相同的方法，分别从Roundup Ready Soy系的子代品种的8个F1种子中提取DNA，用实施例6所述的pMulSL BamHI消化产物作为标准样品，测定提取的DNA样品中待测目标区(实施例2中选择的)的分子数。

即，对于扩增靶标的大豆内源基因le1的DNA序列和扩增靶标的Roundup Ready Soy系特异的DNA序列，分别用提取的DNA作为模板进行定量PCR，并测定样品中各区的分子数。按照式(II)，用该实验获得的测定值计算定量比(图16)。

该实验中使用的设备和条件(例如反应溶液的组成)与实施例8使用的相同，不同之外在于使用的引物和探针对应于待扩增的大豆内源基因Le1的DNA序列和待扩增的Round Ready Soy系特异的DNA序列。

实验结果如图16所示，对于Roundup Ready Soy系的子代品种，计算的定量比在来自8个种子的DNA样品之间几乎不变，并且证实这些种子样品是遗传均一的F1群体，在随后的实验中使用。

实施例10：定量比的测定(玉米)

用预试验中获得的遗传均一的F1种子群体和相当的种子群体进行测定定量比的试验。对于每个品种，用从遗传均一的群体中提取的DNA样品作为模板，用实施例5所述的pMul4 BamHI消化产物作为标准样品，按照与预试验相同的方法，测定提取的DNA中待测目标区(实施例2中选择的)的分子数。

在该试验中，除了在预试验中定量的扩增靶标的DNA序列外，也检测扩增靶标的品种特异的DNA序列。对于扩增靶标的品种特异的DNA序列，对相应各品种测定样品中目标区的分子数。

如同实施例9一样，实验中使用的设备和条件(例如反应溶液的组成)与实施例8相同，不同之处在于对待扩增的不同靶标使用不同的引物和探针。

同预试验一样，按照式(II)用测定值计算定量比。即，扩增靶标的CaMV 35S启动子的DNA序列、扩增靶标的NOS终止子的DNA序列和品种特异的靶DNA序列的分子数均除以在同一样品中分别测定的扩增靶标的zSSIIb DNA序列的分子数，获得各种DNA序列特有的定量比(表7)。

表7.玉米基因重组系(X)的定量比(Kx)

系	CaMV 35S启动子	NOS终止子	特异靶标
系	CaMV 35S启动子	NOS终止子	特异靶标	Bt11	kCaMV(Bt)＝1.04	kNOS(Bt)＝1.82	kBt＝0.49
T25	kCaMV(T)＝0.37		kT＝0.34	Bt11	kCaMV(Bt)＝1.04	kNOS(Bt)＝1.82	kBt＝0.49
T25	kCaMV(T)＝0.37		kT＝0.34	GA21		kNOS(GA)＝2.03	kGA＝2.30
Event176	kCaMV(Ev)＝0.99		kEv＝0.45	GA21		kNOS(GA)＝2.03	kGA＝2.30
Event176	kCaMV(Ev)＝0.99		kEv＝0.45	MON810	kCaMV(MON)＝0.38		kMON＝2.76

也使用为扩增较短目标序列设计的两组引物(SSIIB 2-5′/SSIB2-3′和SSIIb3-5′/SSIB 3-3′)作为扩增内源基因zSSIIb的引物。也测定用这些引物作为扩增内源基因的引物所测定的定量比(表8和表9)。

表8.使用SSIIb 2-5’/SSIIb 2-3’时的定量比

系	特异靶标
系	特异靶标	Bt11	k<sub>Bt</sub>＝0.51
T25	k<sub>T</sub>＝0.38	Bt11	k<sub>Bt</sub>＝0.51
T25	k<sub>T</sub>＝0.38	GA21	k<sub>GA</sub>＝2.08
Event176	k<sub>Ev</sub>＝2.32	GA21	k<sub>GA</sub>＝2.08
Event176	k<sub>Ev</sub>＝2.32	MON810	k<sub>MON</sub>＝0.39

表9.使用SSIIb 3-5’/SSIIb 3-3’时的定量比

系	特异靶标
系	特异靶标	Bt11	k<sub>Bt</sub>＝0.53
T25	k<sub>T</sub>＝0.39	Bt11	k<sub>Bt</sub>＝0.53
T25	k<sub>T</sub>＝0.39	GA21	k<sub>GA</sub>＝1.87
Event176	k<sub>Ev</sub>＝2.15	GA21	k<sub>GA</sub>＝1.87
Event176	k<sub>Ev</sub>＝2.15	MON810	k<sub>MON</sub>＝0.43

实施例11：定量比的测定(大豆)

对于大豆，也用预试验中获得的遗传学均一的种子群体进行测定定量比的实验。对于每个品种，用从遗传学均一的群体中提取的DNA作为模板，用pMulSL BamHI消化产物作为标准样品，按照与预试验相同的方法，分别测定提取的DNA中大豆内源基因le1的待扩增的靶DNA序列和Roundup Ready Soy系特异的DNA序列的分子数。

同实施例9一样，实验中使用的设备和条件(例如反应溶液的组成)与实施例8相同，不同之处在于对待扩增的不同靶标使用不同的引物和探针。

按照与预试验相同的方法，根据式(II)用测定值计算定量比。即，Roundup Ready Soy系特异的DNA序列的分子数除以在同一样品中测定的大豆内源基因le1的待扩增的DNA序列数，获得Roundup Ready Soy系特异的DNA序列的定量比，这是该系所特有的(表10)。

表10.大豆基因重组系(X)的定量比(Kx)

系	CaMV 35S启动子	NOS终止子	特异靶标
系	CaMV 35S启动子	NOS终止子	特异靶标	Roundup Ready Soy	未测定	未测定	k<sub>RRS</sub>＝0.90

实施例12：使用双盲样品的定量

每种基因重组系的研磨产物与非重组系的研磨产物混合，制备双盲样品。实际测定双盲样品中各基因重组系的含量比，以估计该定量分析方法的效能。

即，利用实施例1所述的基因重组系和非重组系的种子制备双盲样品，并从该双盲样品中提取DNA。在对玉米的试验中，总共制备12种混合物作为双盲样品，它们分别含有0.1％、1％和5％(重量百分比)的Bt11系、Event176系、MON810系和T25系的子代品种的种子。

使用从每种双盲样品中提取的DNA作为模板和经限制酶BamHI消化线性化的实施例5中制备的标准分子(pMul4 BamHI消化产物)进行定量PCR，分别测定双盲样品中内源基因的待扩增DNA序列和重组DNA序列的待扩增DNA部分序列的分子数。根据实施例10或11中测定的定量比的结果确定样品中基因重组体的含量比。

在针对每个靶标的定量反应中，在PCR反应溶液中分别以0.5μM和0.2μM的终浓度使用用于定量的每种引物对和探针。从样品中提取的DNA(模板)和Master Mix分别以每个反应系统50ng和12.5μL的量使用。将该反应系统补充至25μL。同一反应进行三次，求获得的测定值的平均值。

采用的反应条件如下：反应溶液在50℃下保持2分钟，然后在95℃下10分钟，95℃ 30秒和59℃1分钟40个循环，随后保持于25℃。

在对待扩增的每种靶DNA序列的定量测定中，向反应管中加入9种样品中的每一种，包括：以5种浓度(每个反应系统10、50、250、1000、50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物；从0.1％、1％和5％双盲样品中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液。以上述终浓度向反应管中加入引物对、定量探针和Master Mix，获得反应溶液。

在反应过程中，根据荧光强度的增加，随时间变化测定PCR扩增所致探针降解的程度。因此，通过生成作为标准重组DNA序列(x4)的5种样品的图(循环次数-荧光强度)，能够获得待扩增的靶DNA序列的分子数与反应系统发射的荧光强度达到特定值所需时间的关联函数。用此关联函数作为标准曲线，能够确定在反应开始时样品中存在的靶DNA序列的分子数(表11)。

表11.用于扩增的每种靶DNA序列的数量

样品	zSSIIb	CaMV
样品	zSSIIb	CaMV	0.1％Bt111％Bt115％Bt11	34378.4544943.7542690.63	43.67574.302375.83
0.1％T251％T25	48665.8748664.95	23.88186.42	0.1％Bt111％Bt115％Bt11	34378.4544943.7542690.63	43.67574.302375.83

5％T25	61333.30	1040.07
5％T25	61333.30	1040.07	0.1％Event1761％Event1765％Event176	96960.5063402.3431765.13	91.73704.801607.65
0.1％MON8101％MON8105％MON810	40662.6044822.7531624.09	14.85202.26641.39	0.1％Event1761％Event1765％Event176	96960.5063402.3431765.13	91.73704.801607.65

表11.(续表)

样品	样品中基因重组玉米的含量比(观察到的)	样品中基因重组玉米的含量比(理论上的)	定量比(式II)
样品	样品中基因重组玉米的含量比(观察到的)	样品中基因重组玉米的含量比(理论上的)	定量比(式II)	0.1％Bt111％Bt115％Bt11	0.12％1.23％5.35％	0.10％1.00％5.00％	k<sub>CaMV(Bt)</sub>＝1.04
0.1％T251％T255％T25	0.13％1.04％4.58％	0.10％1.00％5.00％	k<sub>CaMV(T)</sub>＝0.37	0.1％Bt111％Bt115％Bt11	0.12％1.23％5.35％	0.10％1.00％5.00％	k<sub>CaMV(Bt)</sub>＝1.04
0.1％T251％T255％T25	0.13％1.04％4.58％	0.10％1.00％5.00％	k<sub>CaMV(T)</sub>＝0.37	0.1％Event1761％Event1765％Event176	0.10％1.12％5.11％	0.10％1.00％5.00％	k<sub>CaMV(Evcnt)</sub>＝0.99
0.1％MON8101％MON8105％MON810	0.10％1.19％5.34％	0.10％1.00％5.00％	k<sub>CaMV(MON)</sub>＝0.39	0.1％Event1761％Event1765％Event176	0.10％1.12％5.11％	0.10％1.00％5.00％	k<sub>CaMV(Evcnt)</sub>＝0.99

用实施例10和11得出的定量比，根据式(I)，可将DNA序列分子数的测定值转化为各基因重组体的含量比。转化结果如表11所示。在两种情况下，都发现含有含量为0.1％、1％或5％的基因重组系子代品种的双盲样品能够被成功地定量测定。

实施例13：利用标准分子对基因重组体含量比的定量(1)

制备均含有3种玉米基因重组系的双盲样品。为了测定样品中玉米基因重组系的含量比，对双盲样品进行针对玉米CaMV 35S启动子和特异内源基因zSSIIb的定量PCR。用实施例5所述的pMul4 BamHI消化产物作为标准材料。

实验中使用的双盲玉米样品如下：第一种样品，其含有含量均为1％(重量百分比)的Bt11系、Event176系和MON810系的子代品种的研磨产物作为玉米基因重组体，含量为97％(重量百分比)的Dairyland 1412的研磨产物作为非重组玉米(1％混合物)；第二种样品，其含有含量均为5％(重量百分比)的Bt11系、Event176系和MON810系的子代品种的研磨产物作为玉米基因重组体，含量为85％(重量百分比)的Dairyland1412的研磨产物作为非重组玉米(5％混合物)。

在该实验中，为了模拟分析的实际情况，假定分析者没有任何关于样品中所有3种玉米基因重组系的含量的信息。

另外，在PCR反应溶液中，用于分析CaMV 35S启动子的引物和分析zSSIIb的引物，终引物浓度均为0.5μM；用于分析CaMV 35S启动子的探针和分析zSSIIb的探针，终探针浓度均为0.2μM。分别以每个反应系统50ng和12.5μL的量加入从各种样品中提取的DNA(模板)和Master Mix。反应系统补充至25μL。同一反应进行三次，求所获得的测定值的平均值。

在CaMV 35S启动子的定量测定中，向反应管中加入7种样品中的每一种，包括：以5种浓度(每个反应系统10、50、250、1000、50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从每种玉米双盲样品中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向反应管中加入用于扩增CaMV 35S启动子的引物对、用于定量测定CaMV 35S启动子的探针和Master Mix，获得反应溶液。

同样，在内源基因zSSIIb的定量测定中，向反应管中加入7种样品中的每一种，包括：以5种浓度(每个反应系统10、50、250、1000、50000个分子)制备的标准分子pMul4 BamHI消化产物作为标准重组DNA序列；从每种玉米双盲样品中提取的DNA溶液作为待测样品；鲑精DNA溶液作为阴性对照。以上述终浓度向反应管中加入用于扩增zSSIIb的引物对、用于定量测定zSSIIb的探针和Master Mix，获得反应溶液。

在反应过程中，根据荧光强度的增加，随时间变化测定PCR扩增所致探针降解的程度。因此，通过生成作为标准重组DNA序列(x4)的5种样品的图(循环次数-荧光强度)，能够获得待扩增的靶DNA序列的分子数与反应系统发射的荧光强度达到特定值所需时间的关联函数。用此关联函数作为标准曲线，能够确定待扩增的CaMV 35S启动子的DNA序列和反应开始时样品中存在的待扩增的zSSIIb DNA序列的分子数(表12)。

用于定量测定的装置ABI PRISM 7700序列检测系统(PE Biosystems)能够同时对96个样品进行反应。因此，利用该装置能够在一次定量PCR中进行上述检测方法。

利用实施例10获得的定量比，根据式(I)，可以将DNA序列的分子数的测定值转化为携带CaMV 35S启动子的各基因重组体的含量比。在该实验中，由于没有得到关于样品中任何基因重组系的含量的信息，所以必须对所有3种基因重组系计算定量比，并将其表示为转化值。然而，能够在一次定量PCR中方便地测定样品中基因重组系的含量比(表12)。

表12.基因重组体含量比的定量(1)

样品	zSSIIb CaMV	含量比(观察到的)	定量比	备注
样品	zSSIIb CaMV	含量比(观察到的)	定量比	备注	1％mix<sup>*1</sup>	7924.48 215.72	2.62％2.75％7.16％	1.040.990.39	转化为Bt11转化为Event176转化为MON810
5％mix<sup>*2</sup>	8021.59 1065.46	12.77％13.42％34.95％	1.040.990.39	转化为Bt11转化为Event176转化为MON810	1％mix<sup>*1</sup>	7924.48 215.72	2.62％2.75％7.16％	1.040.990.39	转化为Bt11转化为Event176转化为MON810

*1：分别含有1％Bt11、Event176和MON810的双盲样品(共含有3％的基因重组玉米)

*2：分别含有5％Bt11、Event176和MON810的双盲样品(共含有15％的基因重组玉米)

实施例14：利用标准分子对基因重组体含量比的定量(2)

如实施例13制备的相同的双盲样品，分别针对3种基因重组玉米系特异的DNA序列和玉米的特异内源基因zSSIIb进行定量PCR，测定样品中各基因重组玉米系的含量比。用获得的定量比的结果和总和确定样品中基因重组体的定量比。同实施例13一样，用实施例5所述的pMul4BamHI消化产物作为标准材料。

在该实验中，为了模拟分析的实际情况，假定分析者没有任何关于样品中3种玉米基因重组系的含量的信息。

反应溶液的组成、反应条件和分析方法与实施例13相同，不同之处在于分别定量测定对Bt11系、Event176系和MON810系的子代品种特异的序列而非测定CaMV 35S启动子。即，在该实验中分别对包括zSSIIb在内的总共4种待扩增靶DNA序列进行定量PCR。因此，在该实验中，ABI PRISM 7700序列检测系统(PE Biosystems)一共运行3次。

在反应开始时存在的待扩增的各种靶DNA序列的分子数与反应管发出的荧光强度达到特定值所需的时间之间的相关性绘制成标准曲线。利用该标准曲线能确定反应开始时试验样品中各个待扩增的系特异性靶DNA序列的数量和zSSIIb的待扩增目标区的数量(表13)。

同实施例13一样，利用实施例10测定的定量比，根据式(I)，可以将DNA序列的分子数的测定值转化为样品中各基因重组玉米系的含量比。在该实验中，由于是对基因重组系特异的DNA序列进行定量测定，所以不用担心象实施例13中发现的那样，测定值可能变化。上述方法能更精确地测定样品中各基因重组体的含量比，尽管为了进行测定定量PCR装置必须运行多次(表13)。

表13.基因重组体含量比的定量(2)

样品	ZSSIIb 靶标	含量比(观察的)	定量比	备注
样品	ZSSIIb 靶标	含量比(观察的)	定量比	备注	1％mix<sup>*1</sup>	8872.45 54.168270.42 222.648041.05 38.83	1.25％1.17％1.07％3.49％	0.492.300.45	转化为Bt11转化为Event176转化为MON810总数
5％mix<sup>*2</sup>	8940.47 246.978631.57 1000.98041.62 166.20	5.64％5.04％4.59％15.23％	1.040.990.39	转化为Bt11转化为Event176转化为MON810总数	1％mix<sup>*1</sup>	8872.45 54.168270.42 222.648041.05 38.83	1.25％1.17％1.07％3.49％	0.492.300.45	转化为Bt11转化为Event176转化为MON810总数

根据本发明的方法，可以确定怀疑至少含有一种基因重组系的样品中可能的基因重组系的存在与否；以简单的方式确定含量比未知的样品中基因重组体的含量比；能够精确测定群体中基因重组体的含量比；特别是，能够精确测定系含量比未知的样品中特定基因重组系的含量比。具体而言，本发明的方法采用一种标准分子，该分子中含有用于定量测定重组DNA序列和对应于重组DNA序列的物种所共有的内源基因的DNA序列的区域。由于标准分子根据所导入区域的模式通常以整数比含有用于定量测定的区域，因此能够以良好的重复性测定式(II)代表的定量比。因此，本发明的方法能够精确地测定样品中各种特定基因重组系的含量比。

由于在确定定量比之后纯化形式的基因重组体变得不再是必需的，所以能够消除分析者获得标准分子的困难。

而且，通过提供本发明的用于检测基因重组体的标准分子，提高了针对基因重组体的分子生物学试验的实际用途，由此，具有广泛适用性的精确分析方法可广泛应用。

序列表

<110>朝日啤酒株式会社

日本制粉株式会社

独立行政法人食品综合研究所

<120>转化子的定量检测方法和用于该方法的标准分子

<130>Y1I0978

<140>

<141>

<150>JP 2000-326738

<151>2000-10-26

<160>80

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>1

tggacaacaa cccaaaca tc aa 22

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>2

tggattttgg ttttaggaat tagaaa 26

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>3

gcactgaatt tgtgaaccc 19

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>4

ctatattttg ttttctatcg c 21

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>5

attgatgtga tatctccact gacgt 25

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>6

ttatcctagt ttgcgcgcta 20

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>7

atctttggcc ttggtagttt g 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>8

attgcgggac tctaatcata a 21

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>9

attgatgtga tatctccact gacgt 25

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>10

actaagggtt tcttatatgc tcaaca 26

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>11

cactacaaat gccatcattg cgata 25

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>12

gatgtttggg ttgttgtcca t 21

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>13

ccttcgcaag acccttcctc tata 24

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>14

atcctggcgc ccatggcctg catg 24

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>15

ctcccaatcc tttgacatct gc 22

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>16

tcgatttctc tcttggtgac agg 23

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：玉米的探针

SSIIb

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-a

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(25)

<223>a-Tamra

<400>17

ngcaaagtca gagcgctgca atgcn 25

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>18

attgatgtga tatctccact gacgt 25

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>19

cctctccaaa tgaaatgaac ttcct 25

<210>20

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：CaMV35S启动子的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-c

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(27)

<223>t-Tamra

<400>20

nccactatcc ttcgcaagac ccttccn 27

<210>21

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>21

gtcttgcgat gattatcata taatttctg 29

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>22

cgctatattt tgttttctat cgcgt 25

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：NOS终止子的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-a

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(30)

<223>a-Tamra

<400>23

ngatgggttt ttatgattag agtcccgcan 30

<210>24

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>24

tgttcaccag cagcaaccag 20

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>25

actccacttt gtgcagaaca gatct 25

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Event176的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-c

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(25)

<223>a-Tamra

<400>26

ncgacgtgac cgactaccac atcgn 25

<210>27

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>27

ttagcgctca tgtgttcaat tct 23

<210>28

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>28

cggcaacagg attcaatctt aa 22

<210>29

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Bt11的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-a

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(29)

<223>c-Tamra

<400>29

ncattgaccg tattgagttt gtgcctgcn 29

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>30

gaccttcccc gactacttcg a 21

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>31

atcgcaagac cggcaaca 18

<210>32

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：GA21的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-c

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(27)

<223>t-Tamra

<400>32

ngaatttccc cgatcgttca aacattn 27

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>33

gccagttagg ccagttaccc a 21

<210>34

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>34

tgagcgaaac cctataagaa ccct 24

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：T25的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-c

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(26)

<223>t-Tamra

<400>35

natgcccgct gaaatcacca gtctcn 26

<210>36

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>36

gatgccttct ccctagtgtt ga 22

<210>37

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>37

ggatgcactc gttgatgttt g 21

<210>38

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：MON810的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-a

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(26)

<223>a-Tamra

<400>38

ngataccaag cggccatgga caacan 26

<210>39

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>39

caatgcgttc tccaccaagt act 23

<210>40

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>40

aaaagaccac aacaagccgc 20

<210>41

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Bt11的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-c

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(27)

<223>a-Tamra

<400>41

ngaccatgga caacaaccca aacatcn 27

<210>42

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>42

atccggttgg aaagcgactt 20

<210>43

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>43

gaagcctcgg caacgtca 18

<210>44

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：GA21的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-a

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(20)

<223>g-Tamra

<400>44

naggatccgg tgcatggccn 20

<210>45

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>45

gccctctact ccaccccca 19

<210>46

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>46

gcccatctgc aagccttttt 20

<210>47

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：大豆le1的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-a

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(26)

<223>c-Tamra

<400>47

ngcttcgccg cttccttcaa cttcan 26

<210>48

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>48

cctttaggat ttcagcatca gtgg 24

<210>49

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>49

gacttgtcgc cgggaatg 18

<210>50

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Roundup Reay Soy的探针

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(1)

<223>Fam-a

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(19)

<223>c-Tamra

<400>50

ngcaaccgcc cgcaaatcn 19

<210>51

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>51

catttggaga ggtcgatttc tctcttg 27

<210>52

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>52

gagagaaatc gacctctcca aatgaaa 27

<210>53

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>53

tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccgg 35

<210>54

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>54

ggcaacagga ttcgcccggg cattgatgtg atatct 36

<210>55

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>55

aaactaggat aaatcgcaag accggca 27

<210>56

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>56

tcggggaagc tctgagcgaa accctat 27

<210>57

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>57

ggcctaactg gcggatgcac tcgttga 27

<210>58

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>58

acgagtgcat ccgccagtta ggccagt 27

<210>59

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>59

ggagaaggca tcgactgact actccac 27

<210>60

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>60

gagtagtcag tcgatgcctt ctcccta 27

<210>61

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>61

tgctggtgaa cacggcaaca ggattca 27

<210>62

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>62

atcctgttgc cgtgttcacc agcagca 27

<210>63

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>63

cggcgacaag tcgcccatct gcaagcc 27

<210>64

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>64

ttgcagatgg gcgacttgtc gccggga 27

<210>65

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>65

aaactaggat aaatccggtt ggaaagc 27

<210>66

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>66

ttccaaccgg atttatccta gtttgcg 27

<210>67

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>67

tgccgaggct tctgagcgaa accctat 27

<210>68

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>68

gggtttcgct cagaagcctc ggcaacg 27

<210>69

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>69

tgctggtgaa catcaatgcg ttctcca 27

<210>70

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>70

agaacgcatt gatgttcacc agcagca 27

<210>71

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>71

ggagtagagg gcttatccta gtttgcg 27

<210>72

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>72

aaactaggat aagccctcta ctccacc 27

<210>73

<211>1102

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于定量检测玉米转化子的标准分子的扩增区

<400>73

ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60

cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120

catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg acctctccaa atgaaatgaa cttccttata 180

tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 240

tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 300

ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 360

tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 420

tagcgcgcaa actaggataa atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 480

attgccaaat gtttgaacga tcggggaaat tcgtcgaagc ttcttctaga gcttaattct 540

tgacgaaagt gctcagcaca tcgaagtagt cggggaaggt ctgagcgaaa ccctataaga 600

accctaattc ccttatctgg gaactactca cacattatta tagagagaga tagatttgta 660

gagagagact ggtgatttca gcgggcatgc ctgcaggtcg actcagatct gggtaactgg 720

cctaactggc ggatgcactc gttgatgttt gggttgttgt ccatggccgc ttggtatctg 780

cattacaatg aaatgagcaa agactatgtg agtaacactg gtcaacacta gggagaaggc 840

atcgactgac tactccactt tgtgcagaac agatctagag ctcctacacc tgatcgatgt 900

ggtagtcggt cacgtcggtc ttcaggccga tctggttgct gctggtgaac acggcaacag 960

gattcaatct taagaaactt tattgccaaa tgtttgaacg atcctgatct tcagtactca 1020

gcctcgaagg taacttcggc aggcacaaac tcaatacggt caatgtacac ttcattgcca 1080

gaattgaaca catgagcgct aa 1102

<210>74

<211>1071

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>74

ctcccaatcc tttgacatct gctccgaagc aaagtcagag cgctgcaatg caaaacggaa 60

cgagtggggg cagcagcgcg agcaccgccg cgccggtgtc cggacccaaa gctgatcatc 120

catcagctcc tgtcaccaag agagaaatcg acctctccaa atgaaatgaa cttccttata 180

tagaggaagg gtcttgcgaa ggatagtggg attgtgcgtc atcccttacg tcagtggaga 240

tatcacatca atgcccgggc gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 300

ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 360

tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 420

tagcgcgcaa actaggataa atccggttgg aaagcgactt ggaccccggc agcttgacgg 480

tgccggagat ctccttgatg ggctgcagca cgatctcctc ggcgccggcc atgcaccgga 540

tccttccgcc gttgctgacg ttgccgaggc ttctgagcga aaccctataa gaaccctaat 600

tcccttatct gggaactact cacacattat tatagagaga gatagatttg tagagagaga 660

ctggtgattt cagcgggcat gcctgcaggt cgactcagat ctgggtaact ggcctaactg 720

gcggatgcac tcgttgatgt ttgggttgtt gtccatggcc gcttggtatc tgcattacaa 780

tgaaatgagc aaagactatg tgagtaacac tggtcaacac tagggagaag gcatcgactg 840

actactccac tttgtgcaga acagatctag agctcctaca cctgatcgat gtggtagtcg 900

gtcacgtcgg tcttcaggcc gatctggttg ctgctggtga acatcaatgc gttctccacc 960

aagtacttca acttctgggt tactcaagca gttgtatgga atgcattcgt tgatgtttgg 1020

gttgttgtcc atggtcgact ctagaggatc cgcggcttgt tgtggtcttt t 1071

<210>75

<211>239

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>75

cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cctgcatgct tcacggtgca agcagccggc 60

ccgcaaccgc ccgcaaatcc tctggccttt ccggaaccgt ccgcattccc ggcgacaagt 120

cgcccatctg caagcctttt tgtgtcaggg gcatagaagg tgaagttgaa ggaagcggcg 180

aagctggcaa cgctaccggt ttctttgtcc caaatgtgga tgggggtgga gtagagggc 239

<210>76

<211>528

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：用于定量检测大豆转化子的标准分子的扩增区

<400>76

cctttaggat ttcagcatca gtggctacag cctgcatgct tcacggtgca agcagccggc 60

ccgcaaccgc ccgcaaatcc tctggccttt ccggaaccgt ccgcattccc ggcgacaagt 120

cgcccatctg caagcctttt tgtgtcaggg gcatagaagg tgaagttgaa ggaagcggcg 180

aagctggcaa cgctaccggt ttctttgtcc caaatgtgga tgggggtgga gtagagggct 240

tatcctagtt tgcgcgctat attttgtttt ctatcgcgta ttaaatgtat aattgcggga 300

ctctaatcat aaaaacccat ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat 360

gcttaacgta attcaacaga aattatatga taatcatcgc aagaccggca acaggattcg 420

cccgggcatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct 480

tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagagg 528

<210>77

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>77

tcccaatcct ttgacatctg ct

<210>78

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>78

gacaggagct gatggatgat cag

<210>79

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>79

ccaatccttt gacatctgct cc

<210>80

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：PCR引物

<400>80

gatcagcttt gggtccgga

Claims

1. 一种定量检测方法，用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中基因重组体的含量比，该方法包括：

(i)对来源于样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的基因重组体特异的DNA序列进行定量PCR，并对对应于该基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR，其中使用一种在单个分子上含有所述基因重组体特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子；

(iii)根据定量PCR的结果，确定样品中内源DNA序列的数量；和

(iv)根据式(I)确定基因重组体的含量比：

(样品中基因重组体的含量比)＝100×[(样品中基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(样品中内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％)(I)

其中，定量比是根据式(II)预先计算的值中的任何一种：

(定量比)(％)＝(来自单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分子数)(II)。

2. 一种定量检测方法，用于定量测定至少含有一种基因重组系的样品中各基因重组体的分别的含量比，该方法包括：

(i)对来自样品中基因重组体的DNA样品中可能存在的单个基因重组系特异的DNA序列进行定量PCR，并对对应于基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR，其中使用一种在单个分子上含有该单个基因重组系特异的DNA序列和该内源DNA序列的分子作为标准分子；

(iv)根据式(III)确定该基因重组体的含量比：

(样品中单个基因重组系的含量比)＝100×[(样品中对应于每种基因重组体的DNA序列的分子数)/(样品中所述内源DNA序列的分子数)]/(定量比)(％)(III)

其中，定量比是根据式(II)预先计算的值：

(定量比)(％)＝(来自所述单个基因重组系的基因重组体特异的DNA序列的分子数)/(该基因重组体中所述内源DNA序列的分子数)(II)

3. 根据权利要求1或2的方法，其中对样品中基因重组系特异的DNA序列的数量和内源DNA序列的数量的测定包括：

(i)对样品中可能存在的基因重组系特异的DNA序列进行定量PCR，对对应于基因重组体的物种所共有的内源DNA序列进行定量PCR；和

(ii)监测作为PCR中扩增指示的信号，确定信号达到预定阈值时的PCR循环数，然后用标准曲线将此循环数转化为反应开始时存在的分子数，

其中，该标准曲线代表待扩增的DNA序列数与作为扩增指示的信号之间的关系。

4. 权利要求3的方法，其中作为扩增指示的信号是荧光，该荧光来源于荧光标记的探针，该荧光能够根据因DNA序列PCR扩增引起的探针降解而改变。

5. 权利要求3的方法，其中该标准曲线按如下获得：

(a)在可根据内部DNA序列扩增或基因重组体特异的DNA序列扩增的进展提高荧光强度的探针存在下，用扩增基因重组系特异的DNA序列或对应于该重组体的物种所共有的内部DNA序列的引物，对标准分子进行PCR；

(b)每隔预定的循环次数，监测每个反应的荧光强度，反应中用数量确定的标准分子作为反应开始时存在的模板DNA；

(c)同步测定荧光增强的阈值(ΔRn)，在荧光强度和循环数之间观察到指数关系；和

(d)以PCR循环数作为纵轴，以反应开始时存在的模板DNA的分子数作为横轴，将达到阈值时的PCR循环数对反应开始时存在的DNA模板分子数作图。

6. 在根据权利要求1或2的方法中用作标准分子的重组DNA分子，它是大肠杆菌FERM BP-7319所含的质粒pMul4。

7. 在根据权利要求1或2的方法中用作标准分子的重组DNA分子，它是大肠杆菌FERM BP-7320所含的质粒pMul5。

8. 在根据权利要求1或2的方法中用作标准分子的重组DNA分子，它是大肠杆菌FERM BP-7321所含的质粒pMulSL。

9. 在根据权利要求1或2的方法中用作标准分子的重组DNA分子，它是大肠杆菌FERM BP-7322所含的质粒pMulSL2。

10. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：15或NO：16的序列作为3’-端序列的引物确定内源DNA序列的数量。

11. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：18或NO：19的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

12. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：21或NO：22的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

13. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：24或NO：25的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

14. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：27或NO：28的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

15. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：30或NO：31的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

16. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：33或NO：34的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

17. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：36或NO：37的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

18. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：39或NO：40的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

19. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：42或NO：43的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

20. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：45或NO：46的序列作为3’-端序列的引物确定内源DNA序列的数量。

21. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：48或NO：49的序列作为3’-端序列的引物确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

22. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：17的序列的探针确定内源DNA序列的数量。

23. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：20的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

24. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：23的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

25. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：26的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

26. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：29的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

27. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：32的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

28. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：35的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

29. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：38的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

30. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：41的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

31. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：44的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

32. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：47的序列的探针确定内源DNA序列的数量。

33. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：50的序列的探针确定基因重组体特异的DNA序列的数量。

34. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：77或NO：78的序列作为3’-端序列的探针确定内源DNA序列的数量。

35. 根据权利要求1或2的方法，其中使用含有SEQ ID NO：79或NO：80的序列作为3’-端序列的探针确定内源DNA序列的数量。