JP7386655B2 - 遺伝子組換え体の検出方法 - Google Patents
遺伝子組換え体の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7386655B2 JP7386655B2 JP2019167427A JP2019167427A JP7386655B2 JP 7386655 B2 JP7386655 B2 JP 7386655B2 JP 2019167427 A JP2019167427 A JP 2019167427A JP 2019167427 A JP2019167427 A JP 2019167427A JP 7386655 B2 JP7386655 B2 JP 7386655B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- genetically modified
- sample
- abundance ratio
- amplification product
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 title claims description 101
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 150
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 129
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 129
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 41
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 16
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims description 14
- 239000010421 standard material Substances 0.000 claims description 11
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 8
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 113
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 35
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 22
- 102200111112 rs397514590 Human genes 0.000 description 19
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 15
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 10
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 9
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 9
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N (2s)-2-[[4-[2-(2,4-diaminoquinazolin-6-yl)ethyl]benzoyl]amino]-4-methylidenepentanedioic acid Chemical compound C1=CC2=NC(N)=NC(N)=C2C=C1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CC(=C)C(O)=O)C(O)=O)C=C1 NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は遺伝子技術に関し、遺伝子組換え体の検出方法に関する。
食品等の試料に含まれる遺伝子組換え体の定量には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が広く用いられている（例えば、特許文献１から７及び非特許文献１から３参照。）。一方、試料が加工されるに従って、熱、ｐＨ変化、及び物理的な力等によって、試料に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が分解し、断片化することが知られている。また、ＤＮＡが断片化すると、ＰＣＲによる遺伝子組換え体の定量値に誤差が生じることも確認されている。
例えば、遺伝子組換え体を５％含むダイズ原料を、豆腐、豆乳、及び煮豆に加工すると、加工方法や加工量に応じて、ＰＣＲで定量された加工品における遺伝子組換え体の存在比が、実際の５％より高くなったり、低くなったりすることが報告されている（例えば、非特許文献４参照。）。したがって、ＰＣＲで定量された加工品における遺伝子組換え体の存在比が基準値より高くても、加工品の原材料は実際には基準値以上の遺伝子組換え体を含んでいない可能性がある。また、ＰＣＲで定量された加工品における遺伝子組換え体の存在比が基準値より低くても、加工品の原材料は実際には基準値以上の遺伝子組換え体を含んでいる可能性がある。
Takeshi Ogasawara et al., "Fragmentation of DNAs of Processed Foods Made from Genetically Modified Soybeans," Jpn, J. Food Chem., 2003, 10, 155-160
食品表示基準Q&A別添「遺伝子組換え食品に関する事項」、消費者庁、平成27年3月30日改正
食品表示基準別添「安全性審査済みの遺伝子組換え食品の検査方法」、消費者庁、2019年3月28日改正
Tomoaki Yoshimura et al., "Comparative Studies of the Quantification of Genetically Modified Organisms in Foods Processed from Maize and Soy Using Trial Producing," J. Agric. Chem., 2005, 53, 2060-2069
試料における遺伝子組換え体の存在比を正確に定量できなくとも、試料に遺伝子組換え体が基準値以上に存在することを正確に判定できる方法が望まれている。そこで、本発明は、試料に遺伝子組換え体が基準値以上に存在することを正確に判定できる、遺伝子組換え体の検出方法を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、遺伝子組換え体の検出方法であって、少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある試料に含まれる核酸配列の少なくとも一部を、遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅するプライマーと、遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成されたプライマーと、を使用して、ＰＣＲにより増幅することと、ＰＣＲの結果に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することと、を含む、方法が提供される。
上記の方法において、遺伝子組換え体の存在比が基準値よりも高い場合、試料が遺伝子組換え体を含むと判定してもよい。
上記の方法において、試料中の核酸配列の少なくとも一部が分解されていてもよい。
上記の方法において、試料が加工されていてもよい。
上記の方法において、ＰＣＲの結果に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定することをさらに含んでいてもよい。
上記の方法において、試料中の核酸配列の少なくとも一部が分解されており、上記の方法が、核酸配列が分解される前の試料における遺伝子組換え体の存在比が、決定された遺伝子組換え体の存在比より高いと判定することをさらに含んでいてもよい。
上記の方法において、試料が加工されており、上記の方法が、加工される前の試料における遺伝子組換え体の存在比が、加工された試料における決定された遺伝子組換え体の存在比より高いと判定することをさらに含んでいてもよい。
上記の方法において、ＰＣＲの結果に基づいて決定される試料中に存在する組換え遺伝子の量と、ＰＣＲの結果に基づいて決定される試料中に存在する内在性遺伝子の量と、に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定してもよい。
上記の方法において、下記（１）式に基づいて、遺伝子組換え体の存在比を決定してもよい。
Ｃ＝（ＮG／ＮE）×（１／Ｒ）×１００ （１）
（１）式において、Ｃは遺伝子組換え体の存在比（％）、ＮGは試料中の組換え遺伝子の量、ＮEは試料中の内在性遺伝子の量、Ｒは内標比を表す。
Ｃ＝（ＮG／ＮE）×（１／Ｒ）×１００ （１）
（１）式において、Ｃは遺伝子組換え体の存在比（％）、ＮGは試料中の組換え遺伝子の量、ＮEは試料中の内在性遺伝子の量、Ｒは内標比を表す。
上記の方法において、内標比が、下記（２）式で与えられてもよい。
Ｒ＝ＮG100／ＮE100 （２）
（２）式において、ＮG100は１００％の遺伝子組換え体中の組換え遺伝子の量、ＮE100は１００％の遺伝子組換え体中の内在性遺伝子の量を表す。
Ｒ＝ＮG100／ＮE100 （２）
（２）式において、ＮG100は１００％の遺伝子組換え体中の組換え遺伝子の量、ＮE100は１００％の遺伝子組換え体中の内在性遺伝子の量を表す。
上記の方法において、内標比が、下記（３）式で与えられてもよい。
Ｒ＝ＮGx／ＮEx×１００／ｘ （３）
（３）式において、ＮGxは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の組換え遺伝子の量、ＮExは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の内在性遺伝子の量を表す。
Ｒ＝ＮGx／ＮEx×１００／ｘ （３）
（３）式において、ＮGxは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の組換え遺伝子の量、ＮExは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の内在性遺伝子の量を表す。
上記の方法において、組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定してもよい。
上記の方法において、組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定してもよい。
上記の方法において、内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９３％以下であってもよい。
上記の方法において、組換え遺伝子の増幅産物の増幅長が４０ｂｐ以上１０００ｂｐ以下であってもよい。
上記の方法において、ＰＣＲが定量ＰＣＲであってもよい。
上記の方法において、ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲであってもよい。
上記の方法において、ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲであってもよい。
上記の方法において、生物種が植物であってもよい。
また、本発明の態様によれば、遺伝子組換え体の検出キットであって、遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーと、遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成されたＰＣＲプライマーと、を備える、キットが提供される。
上記のキットが、試料中の遺伝子組換え体の検出キットであってもよい。
上記のキットにおいて、試料中の核酸配列の少なくとも一部が分解されていてもよい。
上記のキットにおいて、試料が加工されていてもよい。
上記のキットにおいて、内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９３％以下であってもよい。
上記のキットにおいて、組換え遺伝子の増幅産物の増幅長が４０ｂｐ以上１０００ｂｐ以下であってもよい。
上記のキットにおいて、ＰＣＲが定量ＰＣＲであってもよい。
上記のキットにおいて、ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲであってもよい。
上記のキットにおいて、ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲであってもよい。
上記のキットにおいて、生物種が植物であってもよい。
本発明によれば、試料に遺伝子組換え体が基準値以上に存在することを正確に判定できる、遺伝子組換え体の検出方法を提供可能である。
以下に本発明の実施形態を説明する。ただし、以下の実施形態が本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替実施形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を包含するということを理解すべきである。
実施形態に係る遺伝子組換え体の検出方法は、少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある試料に含まれる核酸配列の少なくとも一部を、遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅するプライマーと、遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成されたプライマーと、を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅することと、ＰＣＲの結果に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することと、を含む。
試料は、例えば植物原料を含む。植物の例としては、ダイズ、コムギ、オオムギ、及びトウモロコシ等が挙げられる。試料は、遺伝子組換え体からなる原料と、当該遺伝子組換え体と同じ種である非遺伝子組換え体からなる原料と、を含み得る。内在性遺伝子（内在性ＤＮＡ配列）とは、種が同じであれば、遺伝子組換え体、非遺伝子組換え体を問わずに普遍的に存在する遺伝子（ＤＮＡ配列）である。遺伝子組換え体と、当該遺伝子組換え体と同じ種である非遺伝子組換え体は、共に同じ内在性遺伝子を有する。例えば、遺伝子組換えダイズと、非遺伝子組換えダイズは、共に同じ内在性遺伝子を有する。遺伝子組換え体が有する組換え遺伝子（組換えＤＮＡ配列）を、非遺伝子組換え体は有しない。
試料は加工されていてもよく、試料に含まれるＤＮＡ等の核酸配列の少なくとも一部が分解により断片化されていてもよい。分解とは、加熱による分解、酵素による分解、酸による分解、アルカリによる分解、物理的な力による分解、及び菌等の微生物による発酵等による分解等を含む。試料に含まれる核酸配列は、ＰＣＲを実施する前に、試料から抽出される。
プライマーはＰＣＲプライマーである。ＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲ等の定量ＰＣＲであってもよいし、マルチプレックスＰＣＲであってもよい。ＰＣＲの結果から試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか否かを判定することが可能であれば、ＰＣＲの種類は限定されない。本開示において、増幅長とは、ＰＣＲによる増幅産物の配列長を指す。組換え遺伝子を特異的に増幅するプライマーの設計部位としては、例えば、非遺伝子組換え体のゲノムが有しない導入遺伝子、導入遺伝子を挟むプロモーター及びターミネーター、これら配列の境界領域、非遺伝子組換え体ゲノムとこれら配列との境界領域が挙げられる。プロモーターは導入遺伝子を発現させるために必要な領域のことであり、ターミネーターは導入遺伝子の発現を終了させるために必要な領域である。
内在性遺伝子の増幅産物の増幅長は、組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して、９５％以下、９３％以下、９２％以下、９１％以下、９０％以下、８８％以下、８５％以下、８３％以下、あるいは８０％以下である。また、内在性遺伝子の増幅産物の増幅長は、組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して、４％以上、１０％以上、あるいは２０％以上である。
組換え遺伝子の増幅産物の増幅長は、例えば、４０ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、６０ｂｐ以上、７０ｂｐ以上、８０ｂｐ以上、９０ｂｐ以上、あるいは１００ｂｐ以上である。また、組換え遺伝子の増幅産物の増幅長は、例えば、１０００ｂｐ以下、４００ｂｐ以下、２００ｂｐ以下、１９０ｂｐ以下、１８０ｂｐ以下、１７０ｂｐ以下、１６０ｂｐ以下、あるいは１５０ｂｐ以下である。
ＰＣＲがリアルタイムＰＣＲ等の定量ＰＣＲである場合、ＰＣＲの結果に基づいて決定される試料中に存在する組換え遺伝子の量と、ＰＣＲの結果に基づいて決定される試料中に存在する内在性遺伝子の量と、に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比を決定する。
例えば、試料中の遺伝子組換え体の存在比は、下記（４）式に基づいて算出される。
Ｃ＝（ＮG／ＮE）×（１／Ｒ）×１００ （４）
（４）式において、Ｃは試料中の遺伝子組換え体の存在比（％）、ＮGは定量ＰＣＲで決定される試料中の組換え遺伝子の量、ＮEは定量ＰＣＲで決定される試料中の内在性遺伝子の量、Ｒは内標比を表す。
Ｃ＝（ＮG／ＮE）×（１／Ｒ）×１００ （４）
（４）式において、Ｃは試料中の遺伝子組換え体の存在比（％）、ＮGは定量ＰＣＲで決定される試料中の組換え遺伝子の量、ＮEは定量ＰＣＲで決定される試料中の内在性遺伝子の量、Ｒは内標比を表す。
内標比とは、純度１００％の遺伝子組換え体中の内在性遺伝子の量に対する純度１００％の遺伝子組換え体中の組換え遺伝子の量の比であり、下記（５）式で与えられる。
Ｒ＝ＮG100／ＮE100 （５）
（５）式において、Ｒは内標比、ＮG100は１００％の遺伝子組換え体中の組換え遺伝子の量、ＮE100は１００％の遺伝子組換え体中の内在性遺伝子の量を表す。
また、内標比は、遺伝子組換え体の存在比が明らかな認証標準物質などを用いることでも定めることができる。この場合、内標比Ｒは下記（６）式で与えられる。
Ｒ＝ＮGx／ＮEx×１００／ｘ（６）
（６）式において、Ｒは内標比、ＮGxは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の組換え遺伝子の量、ＮExは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の内在性遺伝子の量を表す。
Ｒ＝ＮG100／ＮE100 （５）
（５）式において、Ｒは内標比、ＮG100は１００％の遺伝子組換え体中の組換え遺伝子の量、ＮE100は１００％の遺伝子組換え体中の内在性遺伝子の量を表す。
また、内標比は、遺伝子組換え体の存在比が明らかな認証標準物質などを用いることでも定めることができる。この場合、内標比Ｒは下記（６）式で与えられる。
Ｒ＝ＮGx／ＮEx×１００／ｘ（６）
（６）式において、Ｒは内標比、ＮGxは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の組換え遺伝子の量、ＮExは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の内在性遺伝子の量を表す。
内標比は、組換え体系統のそれぞれにおいて固有であり、一定の値を示すと考えられている。したがって、内標比としては、予め取得された値や、公開されている値を用いてもよい。ただし、内標比は、定量ＰＣＲを実施する機種の違いによって変化する場合があるので、試料を分析する定量ＰＣＲ装置と同じ定量ＰＣＲ装置で決定された内標比の値を用いることが好ましい。
ここで、図１（ａ）に示すように、試料が未加工であり、試料中の核酸配列が分解されていない場合は、鋳型核酸配列のコピー数は、増幅産物の増幅長にかかわらず、試料中の鋳型核酸配列の分子数に理論的には対応する。これに対し、図１（ｂ）に示すように、試料が加工されており、試料中の核酸配列が分解されている場合は、鋳型核酸配列のコピー数は少なくなる傾向にある。ただし、増幅産物の増幅長が短いほど、鋳型核酸配列のコピー数の減少は抑制される傾向にある。
本実施形態においては、内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が、組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下と短くなるよう設定される。そのため、試料を加工し試料中の核酸配列が分解したことによる内在性遺伝子の鋳型核酸配列のコピー数の減少の程度は、試料を加工し試料中の核酸配列が分解したことによる組換え遺伝子の鋳型核酸配列のコピー数の減少の程度よりも抑制される。
試料中の遺伝子の量は、ＰＣＲによる鋳型核酸配列のコピー数に基づいて決定される。したがって、加工される前の試料中の内在性遺伝子の実際の量に対する、定量ＰＣＲにより決定される加工され分解した試料中の内在性遺伝子の量の減少度は、加工される前の試料中の組換え遺伝子の実際の量に対する、定量ＰＣＲにより決定される加工され分解した試料中の組換え遺伝子の量の減少度よりも小さくなる。
そのため、上記（４）式におけるＮGの減少度より、ＮEの減少度の方が小さいことから、本実施形態に係る方法によって決定される試料中の遺伝子組換え体の存在比は、加工される前の試料中の遺伝子組換え体の実際の存在比よりも低くなる。したがって、本実施形態に係る方法によって決定される試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値よりも高い場合は、試料に含まれる核酸配列の分解の程度にかかわらず、加工される前の試料中の遺伝子組換え体の存在比も基準値より必ず高いと判断することが可能である。よって、本実施形態に係る方法によって決定される試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値よりも高い場合は、加工される前の試料中に基準値よりも必ず高い存在比で遺伝子組換え体が存在していたと判断することが可能である。
なお、基準値は、政府機関、自治体機関、食品メーカー、流通業者、及び消費者団体等が任意に設定した値であってもよい。日本においては、分別生産流通管理を実施しても意図せずに混入してくる遺伝子組換え食品の混入許容値は、ダイズ及びトウモロコシについては５％となっているが、基準値はこれに限定されない。
上述したように、ＰＣＲはマルチプレックスＰＣＲであってもよい。マルチプレックスＰＣＲにおいては、複数セットのプライマー対とプローブをＰＣＲ液に添加することにより、内在性遺伝子と組換え遺伝子を同時に検出することが可能である。つまり、マルチプレックスＰＣＲを用いて、試料中の組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数（ＣｑGA）と、試料中の内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数（ＣｑEA）と、に基づいて、試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することができる。ＣｑGA及びＣｑEAは、例えば、増幅産物の量を反映するプローブの蛍光強度が閾値に達した時のサイクル数として検出される。
下記（７）式で与えられるＣｑGAとＣｑEAの差ΔＣｑAは、試料中の遺伝子組換え体の存在比の対数値と負の相関があることが知られている。
ΔＣｑA＝ＣｑGA－ＣｑEA （７）
したがって、図２に例示するように、試料中の遺伝子組換え体の存在比が高いほどΔＣｑAは小さくなり、試料中の遺伝子組換え体の存在比が低いほどΔＣｑAは大きくなる。
ΔＣｑA＝ＣｑGA－ＣｑEA （７）
したがって、図２に例示するように、試料中の遺伝子組換え体の存在比が高いほどΔＣｑAは小さくなり、試料中の遺伝子組換え体の存在比が低いほどΔＣｑAは大きくなる。
ここで、下記（８）式に示すように、検査対象の試料のΔＣｑAが、基準値と同じ存在比で遺伝子組換え体を含む標準試料のΔＣｑSよりも大きい場合、検査対象の試料中の遺伝子組換え体の存在比は、基準値以下と判定することが可能である。
ΔΔＣｑ＝ΔＣｑA－ΔＣｑS≧０ （８）
また、図３及び下記（９）式に示すように、検査対象の試料のΔＣｑAが、基準値と同じ存在比で遺伝子組換え体を含む標準試料のΔＣｑSよりも小さい場合、検査対象の試料中の遺伝子組換え体の存在比は、基準値より高いと判定することが可能である。
ΔΔＣｑ＝ΔＣｑA－ΔＣｑS＜０ （９）
ΔΔＣｑ＝ΔＣｑA－ΔＣｑS≧０ （８）
また、図３及び下記（９）式に示すように、検査対象の試料のΔＣｑAが、基準値と同じ存在比で遺伝子組換え体を含む標準試料のΔＣｑSよりも小さい場合、検査対象の試料中の遺伝子組換え体の存在比は、基準値より高いと判定することが可能である。
ΔΔＣｑ＝ΔＣｑA－ΔＣｑS＜０ （９）
本発明者らの知見によれば、試料を加工することにより試料に含まれる核酸配列が分解されると、図４に例示するように、ＣｑGAとＣｑEAは大きくなる傾向にある。また、増幅長が長いほうがＣｑGAとＣｑEAが大きくなる程度が大きく、増幅長が短いほうがＣｑGAとＣｑEAが大きくなる程度が小さくなる。本実施形態では、内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が、組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下と短くなるよう設定する。そのため、図５に例示するように、増幅長が長い組換え遺伝子のＣｑGAの方が大きくなる程度が大きく、増幅長が短い内在性遺伝子のＣｑEAの方が大きくなる程度が小さくなる。
未加工品に対し、加工され核酸配列が分解された試料のＣｑGAが大きくなる程度と、加工され核酸配列が分解された試料のＣｑEAが大きくなる程度と、が等しければ、ΔＣｑAは変化しない。これに対し、本実施形態に係る方法では、加工され核酸配列が分解された試料のＣｑGAが大きくなる程度より、加工され核酸配列が分解された試料のＣｑEAが大きくなる程度が小さいため、未加工品に対し、加工され核酸配列が分解された試料のΔＣｑAは大きくなる。そのため、未加工品のΔＣｑAよりも大きいにもかかわらず、加工され核酸配列が分解された試料のΔＣｑAが標準試料のΔＣｑSより小さく、（９）式に示すように、検査対象の試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いと判定した場合、試料に含まれる核酸配列の分解の程度にかかわらず、加工される前の試料中の遺伝子組換え体の存在比も基準値より必ず高いと判断することが可能である。
従来においては、加工された試料においては、試料中の核酸配列の分解の程度が一定ではないため、Ｃｑ値の比較では試料中の遺伝子組換え体の存在比を正確に評価できないと考えられていた。これに対し、本実施形態によれば、Ｃｑ値の比較によっても、試料中の遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか否かを正確に判断することが可能である。
（実施例）
以下に本発明の実施例を説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。
以下に本発明の実施例を説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。
（実施例１）
定量ＰＣＲの一つであるリアルタイムＰＣＲを用いて、モデル加工品の遺伝子組換え体の存在比（ＧＭ含量）を測定した。
定量ＰＣＲの一つであるリアルタイムＰＣＲを用いて、モデル加工品の遺伝子組換え体の存在比（ＧＭ含量）を測定した。
（試料）
遺伝子組換えダイズ系統標準物質（１０％ＲｏｕｎｄｕｐＲｅａｄｙ（ＲＲＳ）認証標準物質、カタログナンバー：ＥＲＭＢＦ４１０ＧＫ－１Ｇ、シグマアルドリッチ）を用意した。この遺伝子組換えダイズ系統標準物質を１５０℃にて０分間、１５分間、３０分間、及び１２０分間のそれぞれで乾熱滅菌処理を行い、モデル加工品を作製した。ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて、作製したモデル加工品から、ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡを抽出した。
遺伝子組換えダイズ系統標準物質（１０％ＲｏｕｎｄｕｐＲｅａｄｙ（ＲＲＳ）認証標準物質、カタログナンバー：ＥＲＭＢＦ４１０ＧＫ－１Ｇ、シグマアルドリッチ）を用意した。この遺伝子組換えダイズ系統標準物質を１５０℃にて０分間、１５分間、３０分間、及び１２０分間のそれぞれで乾熱滅菌処理を行い、モデル加工品を作製した。ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて、作製したモデル加工品から、ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡを抽出した。
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲ反応液は、プライマー終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ、プローブ終濃度０．２μｍｏｌ／Ｌとなるように調製した。鋳型ＤＮＡは反応液あたり５０ｎｇとなるように調製した。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１２．５μＬ用い、反応系の液量が２５μＬとなるよう蒸留水で液量を調製した。
リアルタイムＰＣＲ反応液は、プライマー終濃度０．５μｍｏｌ／Ｌ、プローブ終濃度０．２μｍｏｌ／Ｌとなるように調製した。鋳型ＤＮＡは反応液あたり５０ｎｇとなるように調製した。ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１２．５μＬ用い、反応系の液量が２５μＬとなるよう蒸留水で液量を調製した。
ダイズ内在性遺伝子として、Ｌｅ１遺伝子配列を増幅対象とした。Ｌｅ１遺伝子配列を増幅するプライマー対として、表１に示すように、配列番号１、２に記載のプライマー対「Ｌｅ１」（１１８ｂｐ）、配列番号３、４に記載のプライマー対「Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ１」（１００ｂｐ）、配列番号５、６に記載のプライマー対「Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ２」（８９ｂｐ）、及び配列番号７、８に記載のプライマー対「Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ３」（７４ｂｐ）を用意した。また、Ｌｅ１遺伝子配列を増幅するプライマー対の間を認識する、下記の配列を有するプローブを用意した。下記の配列は配列番号９に対応する。
5'-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-TAMRA-3'
5'-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-TAMRA-3'
組換え遺伝子として、Ｐ３５Ｓ遺伝子配列及びＲＲＳ遺伝子配列を増幅対象とした。Ｐ３５Ｓ遺伝子配列を増幅するプライマー対として、表２に示すように、配列番号１０、１１に記載のプライマー対「Ｐ３５Ｓ－１」（１０１ｂｐ）を用意し、ＲＲＳ遺伝子配列を増幅するプライマー対として配列番号１３、１４に記載のプライマー対「ＲＲＳ－０１」（１２１ｂｐ）を用意した。
また、Ｐ３５Ｓ遺伝子配列を増幅するプライマー対の間を認識する、下記の配列を有するプローブを用意した。下記の配列は配列番号１２に対応する。
5’-FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-TAMRA-3’
5’-FAM-CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-TAMRA-3’
また、ＲＲＳ遺伝子配列を増幅するプライマー対の間を認識する、下記の配列を有するプローブを用意した。下記の配列は配列番号１５に対応する。
5’-FAM-CGCAACCGCCCGCAAATCC-TAMRA-3’
5’-FAM-CGCAACCGCCCGCAAATCC-TAMRA-3’
モデル加工品のＧＭ含量を測定するためにプライマー対セットを用意した。具体的には、表３に示すように、「Ｐ３５Ｓ－１／Ｌｅ１」セット、「Ｐ３５Ｓ－１／Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ１」セット、「Ｐ３５Ｓ－１／Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ２」セット、及び「Ｐ３５Ｓ－１／Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ３」セットを用意した。また、表４に示すように、「ＲＲＳ－０１／Ｌｅ１」セット、「ＲＲＳ－０１／Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ１」セット、「ＲＲＳ－０１／Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ２」セット、及び「ＲＲＳ－０１／Ｌｅ１ｓｈｏｒｔ３」セットを用意した。
以降の分析は、食品表示基準別添「安全性審査済みの遺伝子組換え食品の検査方法」（消費者庁２０１９年３月２８日改正）に従って行い、各モデル加工品における内在性遺伝子Ｌｅ１のコピー数、組換え遺伝子Ｐ３５Ｓのコピー数、及び組換え遺伝子ＲＲＳのコピー数を算出した。
（結果）
モデル加工品のコピー数は、表５及び表６に示すとおりであった。
モデル加工品のコピー数は、表５及び表６に示すとおりであった。
サンプルのＧＭ含量（％）は、下記（１０）式を用いて算出した。
Ｃ＝（ＮG／ＮE）×（１／Ｒ）×１００ （１０）
（１０）式において、ＣはＧＭ含量（％）、ＮGはモデル加工品から抽出したＤＮＡ中の組換え遺伝子のコピー数、ＮEはモデル加工品から抽出したＤＮＡ中の内在性遺伝子のコピー数、Ｒは内標比を表す。
Ｃ＝（ＮG／ＮE）×（１／Ｒ）×１００ （１０）
（１０）式において、ＣはＧＭ含量（％）、ＮGはモデル加工品から抽出したＤＮＡ中の組換え遺伝子のコピー数、ＮEはモデル加工品から抽出したＤＮＡ中の内在性遺伝子のコピー数、Ｒは内標比を表す。
Ｐ３５Ｓの内標比としては、１０％ＲｏｕｎｄｕｐＲｅａｄｙ認証標準物質において「Ｐ３５Ｓ－１」で増幅されたコピー数を「Ｌｅ１」で増幅されたコピー数で除した値に１０を乗じた０．６０を使用した。ＲＲＳの内標比としては、食品表示基準別添「安全性審査済みの遺伝子組換え食品の検査方法」（消費者庁２０１９年３月２８日改正）に従い、１．０４を使用した。
上記（１０）式を用いて算出された、各モデル加工品のＧＭ含量（％）を表７及び表８に示す。
Ｐ３５Ｓ／Ｌｅ１プライマーセットを用いた場合、比較例１（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比１．１７）と比較例２（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比０．９９）のモデル加工品のＧＭ含量は、未処理（０分）の場合より、乾熱処理をした場合に高くなることがあった。一方、検証例１（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比０．８８）及び検証例２（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比０．７３）のモデル加工品のＧＭ含量は、未処理（０分）の場合と比較して、乾熱処理をした場合は常に低くなり、かつ乾熱処理時間に応じて段階的に低くなった。
ＲＲＳ／Ｌｅ１プライマーセットを用いた場合、比較例３（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．９８）のモデル加工品のＧＭ含量は、未処理（０分）の場合より、乾熱処理をした場合の方が常に低くなったが、乾熱処理時間に応じた段階的な低下は見られなかった。一方、検証例３（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．８３）、検証例４（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．７４）及び検証例５（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．６１）のモデル加工品のＧＭ含量は、未処理（０分）の場合と比較して、乾熱処理をした場合は常に低くなり、かつ乾熱処理時間に応じて段階的に低くなった。
これらの結果から、遺伝子組換え体ＤＮＡ配列（本実施例ではＰ３５Ｓ又はＲＲＳ）の増幅産物の増幅長に対し、内在性遺伝子配列（本実施例ではＬｅ１）の増幅産物の増幅長が所定の割合より短くなるように設定されたプライマー対セットを用いてＧＭ含量を測定すると、加工された試料のＧＭ含量は加工される前の試料のＧＭ含量と比較して常に低く、かつ加工度合いが高くなるにつれて段階的に低くなることが示された。
したがって、加工により必ずＧＭ含量が過小評価される方法を用いて測定された加工された試料のＧＭ含量が基準値（例えば５％）より高ければ、加工前の試料ないしは加工された試料の原材料のＧＭ含量は、必ず基準値（例えば５％）より高いと判定できることが示された。
（実施例２）
マルチプレックスＰＣＲを用いて、モデル加工品のＧＭ含量を測定した。
マルチプレックスＰＣＲを用いて、モデル加工品のＧＭ含量を測定した。
（試料）
実施例１と同じモデル加工品を作製し、ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡを抽出した。
実施例１と同じモデル加工品を作製し、ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡを抽出した。
（マルチプレックスＰＣＲ）
モデル加工品のＧＭ含量を測定するために実施例１と同じプライマー対セットを用意した。分析は、食品表示基準別添「安全性審査済みの遺伝子組換え食品の検査方法」（消費者庁２０１９年３月２８日改正）に従って行った。蛍光強度の閾値を０．２、Ｂａｓｅ ＬｉｎｅをＳｔａｒｔでは３にＥｎｄでは１５に設定し、各モデル加工品における内在性遺伝子Ｌｅ１のＣｑ値、及び組換え遺伝子Ｐ３５Ｓ及び組換え遺伝子ＲＲＳのＣｑ値を算出した。
モデル加工品のＧＭ含量を測定するために実施例１と同じプライマー対セットを用意した。分析は、食品表示基準別添「安全性審査済みの遺伝子組換え食品の検査方法」（消費者庁２０１９年３月２８日改正）に従って行った。蛍光強度の閾値を０．２、Ｂａｓｅ ＬｉｎｅをＳｔａｒｔでは３にＥｎｄでは１５に設定し、各モデル加工品における内在性遺伝子Ｌｅ１のＣｑ値、及び組換え遺伝子Ｐ３５Ｓ及び組換え遺伝子ＲＲＳのＣｑ値を算出した。
（結果）
モデル加工品の各Ｃｑ値は、表９に示すとおりであった。
モデル加工品の各Ｃｑ値は、表９に示すとおりであった。
モデル加工品のΔＣｑ値（＝Ｃｑ（Ｐ３５Ｓ）－Ｃｑ（Ｌｅ１）又はＣｑ（ＲＲＳ）－Ｃｑ（Ｌｅ１））は、表１０及び表１１に示すとおりであった。
Ｐ３５Ｓ／Ｌｅ１プライマーセットを用いた場合、比較例４（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比１．１７）のモデル加工品のΔＣｑ値は、未処理（０分）のΔＣｑ値と比較して常に大きくならず、かつ乾熱処理時間に応じた増加も見られなかった。一方、参考例１（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比０．９９）、検証例６（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比０．８８）、及び検証例７（Ｌｅ１／Ｐ３５Ｓ増幅長比０．７３）のモデル加工品のΔＣｑ値は、未処理（０分）のΔＣｑ値と比較して乾熱処理により常に大きくなり、かつ乾熱処理時間に応じて段階的に増加した。
ＲＲＳ／Ｌｅ１プライマーセットを用いた場合、比較例５（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．９８）のモデル加工品のΔＣｑ値は、未処理（０分）のΔＣｑ値と比較して常に大きくならず、かつ乾熱処理時間に応じた増加も見られなかった。一方、検証例８（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．８３）、検証例９（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．７４）及び検証例１０（Ｌｅ１／ＲＲＳ増幅長比０．６１）のモデル加工品のΔＣｑ値は、未処理（０分）のΔＣｑ値と比較して乾熱処理により常に大きくなり、かつ乾熱処理時間に応じて段階的に増加した。
これらの結果から、遺伝子組換え体ＤＮＡ配列（本実施例ではＰ３５Ｓ又はＲＲＳ）の増幅産物の増幅長に対し、内在性遺伝子配列（本実施例ではＬｅ１）の増幅産物の増幅長が所定の割合より短くなるよう設定したプライマー対セットを用いると、加工された試料のΔＣｑ値は、加工される前の試料のΔＣｑ値と比較して常に大きくなり、かつ加工度合いが高くなるにつれて段階的に増加することが示された。
したがって、加工によりΔＣｑ値が必ず大きくなる方法を用いて測定された加工された試料のΔＣｑA値が標準試料（例えばＧＭ含量５％）のΔＣｑS値より小さければ、加工前の試料ないしは加工された試料の原材料のＧＭ含量は、必ず基準値（例えば５％）より高いと判定できることが示された。
Claims (15)
- 遺伝子組換え体の検出方法であって、
少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある試料であって、核酸配列の少なくとも一部が分解されている試料に含まれる核酸配列の少なくとも一部を、前記遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅するプライマーと、前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成されたプライマーと、を使用して、マルチプレックスＰＣＲにより増幅することと、
前記マルチプレックスＰＣＲの結果に基づいて、前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することと、
前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が前記基準値より高いと判定した場合、前記核酸配列が分解される前の前記試料における前記遺伝子組換え体の存在比も前記基準値より高いと判定することと、
を含み、
前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することにおいて、
前記試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑAが、前記基準値と同じ存在比で前記遺伝子組換え体を含む標準試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記標準試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑSより小さい場合、前記試料に含まれる前記核酸配列の分解の程度にかかわらず、前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いと判定する、
方法。 - 遺伝子組換え体の検出方法であって、
少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある加工された試料に含まれる核酸配列の少なくとも一部を、前記遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅するプライマーと、前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成されたプライマーと、を使用して、マルチプレックスＰＣＲにより増幅することと、
前記マルチプレックスＰＣＲの結果に基づいて、前記加工された試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することと、
前記加工された試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が前記基準値より高いと判定した場合、加工される前の前記試料における前記遺伝子組換え体の存在比も前記基準値より高いと判定すること、
を含み、
前記加工された試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することにおいて、
前記加工された試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記加工された試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑAが、前記基準値と同じ存在比で前記遺伝子組換え体を含む標準試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記標準試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑSより小さい場合、前記試料に含まれる前記核酸配列の分解の程度にかかわらず、前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いと判定する、
方法。 - 遺伝子組換え体の検出方法であって、
少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある加工食品に含まれる核酸配列の少なくとも一部を、前記遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅するプライマーと、前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成されたプライマーと、を使用して、定量ＰＣＲにより増幅することと、
前記定量ＰＣＲの結果に基づいて、前記加工食品中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することと、
前記加工食品中の前記遺伝子組換え体の存在比が前記基準値より高いと判定した場合、前記加工食品に含まれる前記核酸配列の分解の程度にかかわらず、前記加工食品の原料における前記遺伝子組換え体の存在比も前記基準値より高いと判定することと、
を含む方法。 - 下記（１）式に基づいて、前記遺伝子組換え体の存在比を決定する、請求項３に記載の方法。
Ｃ＝（ＮG／ＮE）×（１／Ｒ）×１００ （１）
（１）式において、Ｃは前記遺伝子組換え体の存在比（％）、ＮGは前記加工食品中の前記組換え遺伝子の量、ＮEは前記加工食品中の前記内在性遺伝子の量、Ｒは内標比を表す。 - 前記内標比が、下記（２）式で与えられる、請求項４に記載の方法。
Ｒ＝ＮG100／ＮE100 （２）
（２）式において、ＮG100は１００％の前記遺伝子組換え体中の組換え遺伝子の量、ＮE100は１００％の前記遺伝子組換え体中の内在性遺伝子の量を表す。 - 前記内標比が、下記（３）式で与えられる、請求項４に記載の方法。
Ｒ＝ＮGx／ＮEx×１００／ｘ （３）
（３）式において、ＮGxは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の組換え遺伝子の量、ＮExは遺伝子組換え体ｘ％の認証標準物質中の内在性遺伝子の量を表す。 - 前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９３％以下である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長が４０ｂｐ以上１０００ｂｐ以下である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記生物種が植物である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
- 遺伝子組換え体の検出キットであって、
遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅する第１のＰＣＲプライマーと、
前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成された第２のＰＣＲプライマーと、
を備える、キットであって、
前記第１及び第２のＰＣＲプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲにより増幅された、少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある試料であって、核酸配列の少なくとも一部が分解されている試料に含まれる核酸配列の少なくとも一部に基づいて、前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定するためのキットであって、
前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が前記基準値より高いと判定した場合、前記核酸配列が分解される前の前記試料における前記遺伝子組換え体の存在比も前記基準値より高いと判定するためのキットであって、
前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することにおいて、前記試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑAが、前記基準値と同じ存在比で前記遺伝子組換え体を含む標準試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記標準試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑSより小さい場合、前記試料に含まれる前記核酸配列の分解の程度にかかわらず、前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いと判定するためのキット。 - 遺伝子組換え体の検出キットであって、
遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅する第１のＰＣＲプライマーと、
前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成された第２のＰＣＲプライマーと、
を備える、キットであって、
前記第１及び第２のＰＣＲプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲにより増幅された、少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある加工された試料に含まれる核酸配列の少なくとも一部に基づいて、前記加工された試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定するためのキットであって、
前記加工された試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が前記基準値より高いと判定した場合、加工される前の前記試料における前記遺伝子組換え体の存在比も前記基準値より高いと判定するためのキットであって、
前記加工された試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定することにおいて、前記加工された試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記加工された試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑAが、前記基準値と同じ存在比で前記遺伝子組換え体を含む標準試料中の前記組換え遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、前記標準試料中の前記内在性遺伝子の増幅産物が閾値に達した時のサイクル数と、の差ΔＣｑSより小さい場合、前記試料に含まれる前記核酸配列の分解の程度にかかわらず、前記試料中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いと判定するためのキット。 - 遺伝子組換え体の検出キットであって、
遺伝子組換え体に由来する組換え遺伝子を特異的に増幅する第１のＰＣＲプライマーと、
前記遺伝子組換え体に対応する生物種が共通に有する内在性遺伝子を特異的に増幅し、かつ前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９５％以下となるよう構成された第２のＰＣＲプライマーと、
を備える、キットであって、
前記第１及び第２のＰＣＲプライマーを用いて定量ＰＣＲにより増幅された、少なくとも１種の遺伝子組換え体を含む可能性のある加工食品に含まれる核酸配列の少なくとも一部に基づいて、前記加工食品中の前記遺伝子組換え体の存在比が基準値より高いか判定するためのキットであって、
前記加工食品中の前記遺伝子組換え体の存在比が前記基準値より高いと判定した場合、前記加工食品に含まれる前記核酸配列の分解の程度にかかわらず、前記加工食品の原料における前記遺伝子組換え体の存在比も前記基準値より高いと判定するためのキット。 - 前記内在性遺伝子の増幅産物の増幅長が前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長に対して９３％以下である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載のキット。
- 前記組換え遺伝子の増幅産物の増幅長が４０ｂｐ以上１０００ｂｐ以下である、請求項１０から１３のいずれか１項に記載のキット。
- 前記生物種が植物である、請求項１０から１４のいずれか１項に記載のキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019167427A JP7386655B2 (ja) | 2019-09-13 | 2019-09-13 | 遺伝子組換え体の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019167427A JP7386655B2 (ja) | 2019-09-13 | 2019-09-13 | 遺伝子組換え体の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2021040592A JP2021040592A (ja) | 2021-03-18 |
| JP7386655B2 true JP7386655B2 (ja) | 2023-11-27 |
Family
ID=74862761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019167427A Active JP7386655B2 (ja) | 2019-09-13 | 2019-09-13 | 遺伝子組換え体の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7386655B2 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4291568B2 (ja) | 2000-10-26 | 2009-07-08 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 遺伝子組換え体の定量法およびそれに用いる標準分子 |
| JP4925607B2 (ja) | 2005-05-11 | 2012-05-09 | 国立医薬品食品衛生研究所長 | 遺伝子組換え加工食品の定量的検知方法 |
-
2019
- 2019-09-13 JP JP2019167427A patent/JP7386655B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4291568B2 (ja) | 2000-10-26 | 2009-07-08 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 遺伝子組換え体の定量法およびそれに用いる標準分子 |
| JP4925607B2 (ja) | 2005-05-11 | 2012-05-09 | 国立医薬品食品衛生研究所長 | 遺伝子組換え加工食品の定量的検知方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Akio Noguchi et al.，Development and Interlaboratory Validation of a Simple Screening Method for Genetically Modified Maize Using a ΔΔC(q)-Based Multiplex Real-Time PCR Assay.，Anal. Chem.，2016年04月19日，Vol.88, No.8，p.4285-4293，doi: 10.1021/acs.analchem.5b04335 |
| ＪＡＳ分析試験ハンドブック 遺伝子組換え食品検査・分析ハンドブック 第３版，独立行政法人 農林水産消費安全技術センター，2012年09月24日 |
| Tomoaki Yoshimura et al.，Comparative studies of the quantification of genetically modified organisms in food processed from maize and soy using trial producing.，J. Agric. Food Chem.，2005年03月23日，Vol.53, No.6，p.2060-2069，doi: 10.1021/jf0483265 |
| 小笠原 健 他，遺伝子組換え大豆から製造された加工食品におけるDNA断片化，日本食品化学学会誌，2003年12月12日，Vol.10, No.3，p.155-160，doi: 10.18891/jjfcs.10.3_155 |
| 松岡 猛ら，ダイズ及びダイズ加工食品からの組換え遺伝子の検知法（第１報），食品衛生学雑誌，1999年04月05日，Vol.40, No.2，p.149-157，doi: 10.3358/shokueishi.40.149 |
| 真野 潤一，加工食品中の遺伝子組換え農産物定量分析の実現，科学研究費助成事業 研究成果報告書，2015年06月16日，https://kaken.nii.ac.jp/file/KAKENHI-PROJECT-25810092/25810092seika.pdf，課題番号：25810092 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2021040592A (ja) | 2021-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ganopoulos et al. | Microsatellite genotyping with HRM (High Resolution Melting) analysis for identification of the PGI common bean variety Plake Megalosperma Prespon | |
| CN109266755B (zh) | 一种用于检测鼠源性成分的试剂盒和方法 | |
| CN106754911B (zh) | 用于鉴定牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用 | |
| Leal et al. | Development of two reverse transcription‐PCR methods to detect living pinewood nematode, B ursaphelenchus xylophilus, in wood | |
| JP6120279B2 (ja) | 核酸の損傷の程度の評価方法、食品の加工の程度の評価方法、及び核酸の定量方法 | |
| JP7386655B2 (ja) | 遺伝子組換え体の検出方法 | |
| JP6236690B2 (ja) | 食品変敗微生物を検出するための組成物 | |
| KR20140118626A (ko) | Pcv2의 orf3 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 돼지 혈액내 pcv2 dna 정량분석 방법 | |
| JP2007174973A (ja) | Ｓｓｒプライマーを用いるマルチプレックスｐｃｒによる品種識別法。 | |
| JP2023147730A (ja) | 遺伝子組換え体の検出方法 | |
| JP4925607B2 (ja) | 遺伝子組換え加工食品の定量的検知方法 | |
| CN105779656B (zh) | 一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用 | |
| KR101906217B1 (ko) | 돼지 젤라틴 검출 키트 및 이를 이용한 돼지 젤라틴 검출 방법 | |
| JP2001238700A (ja) | 異種個体の存在割合の測定方法 | |
| CN110257544B (zh) | 麦角病菌荧光定量pcr检测试剂及检测试剂盒和应用 | |
| RU2700479C1 (ru) | Способ определения видовой принадлежности тканей кур и свиней в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах | |
| JP6796832B2 (ja) | 遺伝子組換え体の定量法 | |
| JP2009268413A (ja) | プライマーおよび該プライマーを用いたバチルス属細菌の検出方法 | |
| RU2725216C1 (ru) | Тест-система для определения ДНК ткани дятла (Picidae) в сухих кормах и мясных полуфабрикатах | |
| Toyota et al. | Rapid quantification methods for genetically modified maize contents using genomic DNAs pretreated by sonication and restriction endonuclease digestion for a capillary-type real-time PCR system with a plasmid reference standard | |
| JP4967095B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌濃度測定方法及び食中毒可能性判定方法 | |
| RU2816210C1 (ru) | Тест-система идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| RU2814552C1 (ru) | Способ идентификации ДНК ткани японской скумбрии (Scomber japonicus) в рыбных продуктах, в мясокостной рыбной муке и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
| WO2017163546A1 (ja) | 遺伝子組換え作物の検出方法 | |
| JP5383105B2 (ja) | オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたバチルス・コアグランスの検出法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220502 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230316 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230317 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230419 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230619 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230726 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231010 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231013 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231020 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20231010 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231114 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7386655 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |