KR20140118626A - Pcv2의 orf3 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 돼지 혈액내 pcv2 dna 정량분석 방법 - Google Patents

Pcv2의 orf3 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 돼지 혈액내 pcv2 dna 정량분석 방법 Download PDF

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전태훈
임규상
이은아
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 PCV2의 ORF3 영역에 특이적인 서열번호 2와 3의 프라이머 세트 및 서열번호 4의 프로브, 및 이를 이용한 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 부검 없이 살아있는 돼지의 혈액시료를 이용하여 PCV2 감염 여부 및 바이러스 혈증 수준을 정확하게 확인하여 농장 및 개체수준 PCV2 모니터링에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

PCV2의 ORF3 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석 방법{PCV2 ORF3-specific primer/probe sets and the method for quantitative analysis of PCV2 DNA in the porcine blood using the same}
본 발명은 돼지 써코바이러스 제2형(이하, PCV2와 혼용함)의 ORF3 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 부검 없이도 개체수준에서 PCV2 관련 개체 반응을 모니터링할 수 있는 민감도가 우수한 PCV2의 ORF3 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석 방법에 관한 것이다.
돼지 이유후 전신소모성 질환(Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)은 1991년 캐나다에서 처음 보고된 이래(Harding, 1997; Clark, 1997), 전 세계적으로 양돈농가에 피해를 주고 있는 대표적인 질병이다. PMWS는 갑작스런 위축이나 설사 및 황달 등의 임상적 증상과, 림프절 비대증 및 림프구 소실 등의 병리학적 증상을 특징으로 하며, 다양한 원인에 의해 발병한다(Allan and Ellis, 2000; Segales et al., 2005). PMWS의 주요 병인은 돼지 써코바이러스 2형(PCV2)으로 보고되었다(Chae, 2005; Segales et al., 2005; Opriessnig et al., 2007).
PMWS는 우리나라 양돈농가에서 가장 많은 피해를 주고 있는 질병 중 하나로 8~12주령의 이유자돈에서 주요하게 발병한다. 우리나라에서는 1998년 처음 PMWS가 보고된 이래, 2000년 전후 전국으로 확산되었으며, 현재는 거의 대부분의 양돈장에 PCV2가 감염되어 있는 것으로 추정되고 있다. 2009년 농식품부와 양돈협회가 공동조사한 질병실태조사보고서에 따르면 조사대상 양돈장 모돈의 약 95%가 PCV2에 대한 항체를 가지고 있으며, 약 80%의 양돈장에서 PCV2 감염이 진행되고 있다고 보고된 바 있다. 따라서, 일부를 제외한 국내 대부분 양돈장이 PCV2에 감염되어 있다고 판단된다(박, 2008).
PMWS는 호흡기질환 등의 임상증상과, 림프구 소실 등의 조직병리학적 소견, 및 병변 내 PCV2검출의 3가지 기준이 모두 충족되어야 최종 진단되기 때문에 부검이 없이는 진단할 수 없는 어려움이 있다(도 1 참조). 따라서, 부검 없이도 개체수준에서 PCV2관련 개체반응을 모니터링 할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.
PMWS는 도 2와 같이 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2; PCV2)의 과다증식이 직접적인 원인으로 작용하게 되어, 림프구를 파괴함으로써 면역기능저하를 유발한다. 이에 따라 면역력이 현저히 낮아진 PMWS발병 개체에 대한 2차 세균 및 바이러스 등의 복합감염으로 질병이 악화되고 또 다른 질병을 촉발시키는 심각성을 가지고 있다(reviewed by Opriessnig et al., 2007). 따라서, PCV2증식수준은 PMWS발병과 관련하여 중요한 지표로 판단된다.
돼지 써코바이러스는 포유류에서 자가증식할 수 있는 가장 작은 바이러스로서(Mankertz et al, 1997), 환형 단일가닥 DNA의 유전체를 가지고 있고, 3개의 ORF(open reading fame)을 가지고 있다(Todd et al, 1991; Studdert, 1993; Mankertz et al, 1997). 이 중 ORF1은 바이러스 복제를 위한 단백질(Mankertz et al., 1998), ORF2는 약 30kDa의 분자량을 갖는 당단백질로서 바이러스의 유전체 핵산을 둘러싸는 캡시드(capsid) 단백질(Mankertz et al., 1998; Nawagitgul et al., 2000), ORF3는 바이러스 복제에는 영향을 미치지 않고 숙주세포의 세포사멸을 유도하는 단백질 (Liu et al., 2005)을 각각 발현하는 것으로 보고되어있다.
PCV2 감염시 PCV2 바이러스 DNA (PCV2 viral DNA)는 돼지의 림프절에서만 검출되는 것이 아니고 바이러스혈증(viremia)에 의해 혈액에서 검출되며, 각 개체별로 다양하게 양적인 변화를 나타내고 있음이 보고된바 있다(Olvera 등, 2004). 또한 혈액 내 PCV2 genomic DNA양은 PMWS의 발병 여부 및 임상증상의 정도와 관련되어 있음도 보고되었다(Segales 등, 2005). 따라서, 혈액내 PCV2 DNA 정량분석방법을 통해 부검 없이도 농장 및 개체수준에서 PCV2에 대한 개체의 반응을 확인할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명의 배경이 되는 기술로서 Olvera et al (2004)이 PCV2의 ORF2영역에 대한 프라이머/프로브 세트를 이용한 혈액내 PCV2 DNA 분석방법을 공개한 바 있으나, 국내 돼지에서 얻은 혈액시료에 대해 검출 민감도가 낮았다. 또한, 대한민국 특허공보 제10-0806868호(2008.02.22)에는 PCV의 ORF1(open reading frame 1) 유전자 증폭용 프라이머 세트를 포함하는, PRV, PCMV 및 PCV에 특이적인 다중 PCR 프라이머 세트 및 그를 이용하여 표적 서열을 검출하는 방법 및 키트에 관해 기재되어 있으나 PCV2 ORF1 증폭용 프라이머 세트로 PCV 정성분석에 관한 것이다. 한편, 현재까지 돼지 혈액 내 PCV2 DNA를 정량하기 위한 높은 민감도와 특이성을 가지고 있는 PCV2의 ORF3 영역에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브에 대해 확인된 바는 없다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 특허공보 제10-0806868호(2008.02.22)
Olvera et al., Comparison of porcine circovirus type 2 load in serum quantified by a real time PCR in postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome naturally affected pigs, J Virol Methods. 2004 Apr;117(1):75-80.
본 발명자들은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 국내 돼지의 비장으로부터 PCV2를 분리동정하여 염기서열을 확보하였으며, 이를 바탕으로 PCV2 ORF3에 특이적인 신규한 프라이머 세트 및 프로브를 제작하여 이를 이용하여 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석을 한 결과 높은 민감도 및 특이성이 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 돼지 혈액내 PCV2 DNA를 정량하기 위한 높은 민감도와 특이성을 가지고 있는 PCV2의 ORF3 영역 특이 프라이머 세트 및 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 특이 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 돼지 혈액에서 PCV2 DNA를 정량하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열 또는 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프로브를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 100 내지 200개의 연속서열로 구성되는 PCR산물을 증폭시킬 수 있는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 돼지 혈액내 PCV2 DNA를 정량분석하는 방법: a) 돼지 혈액으로부터 바이러스 DNA (viral DNA)를 분리하는 단계; b) 상기 a)단계의 바이러스 DNA를 주형으로 하여 PCV2의 ORF3영역 중 상기 프로브를 포함하는 100 내지 200개의 연속서열에 대한 PCR을 실시하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 결과를 표준대조시료와 비교하여 PCV2 DNA를 정량분석하는 단계.
이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명은 돼지 혈액내 PCV2 유전자와 정량적으로 결합하는 신규한 프로브와, 상기 프로브를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 제공하여, 이를 포함하는 관련된 키트를 이용하여 간편하고 용이하게 돼지 혈액 내 PCV2를 정량분석할 수 있게 한 것이다.
따라서, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열 또는 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프로브를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 단일쇄 핵산 분자이며, 타깃이 되는 염기서열에 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 본 발명의 실시간 PCR에 사용되는 프로브의 5'-말단에는 리포터-형광물질이 태깅되어 있고, 3'-말단에는 형광억제물질이 태깅되어 있다.
본 발명에서 리포터의 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며, 예를 들어 5'-말단에 태깅되는 형광물질은 FAMTM(6-carboxyfluorescein) 또는 TET(tetrachlorofluoresin)이고, 3'-말단에 태깅되는 형광억제물질은 TAMRATM (6-carboxytetramethylrhodamine) 또는 MGB(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder)이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 100 내지 200개의 연속서열로 구성되는 PCR산물을 증폭시킬 수 있는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프라이머 세트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 핵산 증폭 반응시 증폭되는 타킷 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
이에 한정되는 것은 아니나 상기 증폭산물은 174bp일 수 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 상기 프라이머 세트는 바람직하게 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는다.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 국내 분리 PCV2 게놈 서열(GenBank accession number FR823451.1)으로부터 제작되었으며 PCV2 ORF3영역 특이적이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 키트를 제공한다.
상기 키트는 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR) 반응혼합물을 포함한다. 즉, 상기 키트는 형광물질과 형광억제물질, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 dNTPs를 더 포함한다.
상기 키트는 표준곡선(standard curve) 제작용 플라스미드(plasmid)를 포함할 수 있다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 돼지 혈액내 PCV2 DNA를 정량분석하는 방법을 제공한다: a) 돼지 혈액으로부터 바이러스 DNA (viral DNA)를 분리하는 단계; b) 상기 a)단계의 바이러스 DNA를 주형으로 하여 PCV2의 ORF3영역 중 상기 프로브를 포함하는 100 내지 200개의 연속서열에 대한에 대한 PCR을 실시하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 결과를 표준대조시료와 비교하여 PCV2 DNA를 정량분석하는 단계.
상기 a) 단계에서 돼지 혈액을 채취하고 혈청을 분리하여 상기 혈청으로부터 바이러스 DNA를 분리한다. 본 발명에서 돼지 혈액으로 바이러스 DNA를 분리 및 정제하는 것은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory Mannual(2001) 등).
상기 단계 b)에서 분리된 바이러스 DNA를 주형으로 하여 PCV2의 ORF3영역에 특이적인 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 PCR을 실시한다.
본 발명에서 프라이머 세트는 상기 PCV2의 ORF3 영역 중 상기 프로브를 포함하는 100 내지 200개의 연속서열로 구성되는 PCR산물을 증폭시킬 수 있다면 특별한 제한은 없으나, 바람직하게 상기 프라이머 세트는 서열번호 2과 서열번호 3으로 표시된 프라이머 세트이다.
상기 단계 b)에서 바람직하게 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)을 실시한다. 이때 프로브의 5'-말단에는 리포터-형광물질이 태깅되어 있고, 3'-말단에는 형광억제물질이 태깅되어 있다. 본 발명에서 리포터의 형광물질과 형광억제물질은 특정의 물질로 한정되지 않으며, 예를 들어 5'-말단에 태깅되는 형광물질은 FAMTM(6-carboxyfluorescein) 또는 TET(tetrachlorofluoresin)이고, 3'-말단에 태깅되는 형광억제물질은 TAMRATM (6-carboxytetramethylrhodamine) 또는 MGB(dihydrocyclopyrroloindole tripeptide minor groove binder)이다.
본 발명의 프로브는 주형의 타겟 서열에 특이적으로 혼성화되지만, 3'-말단에 존재하는 형광억제물질의 작용에 의해 5'-말단의 리포터 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 핵산증폭반응의 다음 단계인 연장 단계(extension step)에서 Taq DNA 중합효소가 가지고 있는 5'→ 3'exonuclease 활성에 의해, 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 프로브 5'말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 형광억제물질에 의한 형광억제가 해제됨으로써 형광이 방출된다. 따라서, 형광 방출은 정상적 실시간 중합효소연쇄반응을 나타낸다.
본 발명의 방법에서 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 바람직하게는, DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermusthermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcusfuriosus(Pfu)를 포함한다.
한편, 유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명에서 중합효소에 의한 증폭 반응은 통상적인 (ⅰ) 초기 변성(denaturation) 과정, (ⅱ) 변성(denaturation) 및 어닐링(annealing)-연장(elongation)으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 행한다.
상기 단계 c)에서는 상기 단계 b)에서 행한 PCR의 형광 방출을 분석하여 PCV2 DNA 정량분석한다. 이러한 분석은 실시간 PCR에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 사용하여 용이하게 행할 수 있다. 본 발명에서는 미리 제작해 둔 표준곡선(standard curve)을 이용하여 viral load (PCV2 copies/ml serum)를 비교하여 PCV2 DNA를 정량분석할 수 있다.
본 발명에 의한 방법은 종래 돼지 혈액내 PCV2 ORF2 DNA를 타겟으로 하는 정량분석방법에 비해 PCR 및 실시간 PCR 모두 민감도가 우수하고 검출범위도 102 ~ 1010으로 넓은 것으로 나타났다(실시예 5 및 도 7 참조).
본 발명은 국내 분리 PCV2 게놈 서열(GenBank accession number FR823451.1)으로부터 제작한 PCV2 ORF3 영역 특이 프라이머 세트 및 프로브를 제공하며, 이를 이용한 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR) 기법을 통해 돼지 혈액 내 PCV2 DNA 수준을 민감도 높게 정량분석할 수 있다.
본 발명은 살아있는 돼지의 혈액시료를 이용하여 PCV2 감염 여부 및 바이러스 혈증 수준을 정확하게 확인하여 농장 및 개체수준 PCV2 모니터링에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 종래 기술에 의한 PMWS의 진단기준을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 PMWS 발병기작을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 의한 국내 돼지의 비장에서 분리한 PCV2의 전체 염기서열로, 밑줄은 프라이머 세트를 나타내며 노란색 표시는 프로브 서열을 나타낸다.
도 4는 희석된 pPCV2 DNA에 대한 본 발명에 의한 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR) 결과 그림이다.
도 5는 희석된 pPCV2 DNA에 대한 본 발명에 의한 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)을 통해 얻은 표준 곡선(standard curve) 그림이다.
도 6은 희석된 pPCV2 DNA에 대한 본 발명에 의한 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)을 통해 얻은 결과를 나타내는 도표이다.
도 7은 본 발명에 의한 혈액 내 PCV2 DNA 정량분석방법을 종래 기술과 대비한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] PCV2 특이 프라이머 세트 및 프로브 제작
국내 돼지 비장조직에서 게놈 DNA (genomic DNA)을 추출하고, PCR을 통해 전체 게놈서열(full genome sequence)을 동정하였다(GenBank accession number FR823451.1; 서열번호 1, 도 3). 확보된 서열을 바탕으로 PCV2 ORF3에서 174 bp를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였다. 또한 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)을 위해 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 174 bp의 PCR산물 영역내에 위치한 특이적 프로브를 제작하였으며, 형광물질은 5'말단에는 FAM™ (6-carboxyfluorescein)을 3' 말단에는 TAMRA™ (6-carboxytetramethylrhodamine)를 표지하였다.
상기 프라이머 세트 및 프로브는 다음과 같이 Forward Primer 5'-TCG ATC TCA AGG ACA ACG GAG T-3' (22 mer; 서열번호 2), Reverse Primer 5'-TTG GTC TTC CAA TCA CGC TTC TGC-3' (24 mer; 서열번호 3)로 제작하였다. Probe 5'-FAM-CAG AGC AGC ACC CTG TAA CGT TTG TCA-TAMRA-3' (27 mer; 서열번호 4)로 제작되었다(표 1).
Figure pat00001
[ 실시예 2] 표준곡선 제작( Sandard curve construction )을 위한 pPCV2 제작 및 희석
돼지 혈액 내 PCV2 DNA의 정량에 이용되는 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)에 대한 표준곡선 제작(standard curve construction)을 위해 플라스미드 PCV2 DNA (pPCV2)를 제작하였다. pPCV2 제작을 위하여 실시예 1에서 분리한 PCV2 게놈 중 314 bp 크기 ORF3 영역의 cDNA를 PCR을 이용하여 cloning하였으며, XhoI과 NotI site를 이용하여 T-easy vector (Promega)에 삽입하였다. 이렇게 제작된 플라스미드를 PCV2의 숙주세포인 PK-15 (ATCC)에서 증식시킨 후 상용 바이러스 DNA 키트(commercial viral DNA kit, Qiagen)를 이용하여 DNA를 추출하였으며, 분광광도계(spectrophotometer, Thermo Scientific)를 이용하여 DNA의 농도를 확인하였다. 이후 2.5 ㎕ 샘플당 1011 ~ 101 플라스미드(plasmids)의 농도로 연속 희석(serial dilution)을 실시하였다.
[ 실시예 3] 돼지 혈액채취 및 바이러스 DNA 추출
본 발명에는 총 192두의 요크셔(Yorkshire) 품종의 돼지가 사용되었다. 본 돼지들은 같은 농장에서 태어났고 PCV2 백신을 접종하지 않았으며, 4주령에 이유 후 10주령까지 4개의 서로 다른 우리에서 동일한 환경조건으로 사육되었다. 10주령시기에 각각 돼지의 경정맥에서 혈청분리튜브(serum separation tube, SST)에 3 ml의 혈액을 채취하였다. 혈액응고 후 원심분리를 3000 rpm의 속도로 10분간 실시하여 혈청을 분리하여 -80℃에 보관하였다. 분리된 혈청 300 ㎕으로부터 상용 바이러스 DNA 키트(commercial viral DNA kit, Qiagen)를 이용하여 전체 바이러스 DNA (total viral DNA) 추출을 실시하여 최종적으로 20 ㎕의 산물을 얻었다.
[ 실시예 4] 태크맨 프로브 리얼타임 PCR ( TaqMan probe realtime PCR )을 통한 혈액내 PCV2 DNA 검출
1) 태크맨 프로브 리얼타임 PCR ( TaqMan probe realtime PCR ) 반응방법
각각 돼지의 혈청에서 분리된 바이러스 DNA를 이용하여 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)을 실시했다. 본 실험을 위한 혼합물에는 각각 프라이머 500 nM (서열번호 2와 서열번호 3), 프로브 250 nM (서열번호 4), 2X TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) 25 ㎕ 그리고 바이러스 DNA 2.5 ㎕가 포함되며 최종 부피가 50 ㎕이 되도록 Nuclease-free water를 추가하여 반응시켰다(표 2). 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR) 반응에는 CFX connect (Bio-rad)를 사용하였으며, 반응조건은 50℃ 2분, 95℃에서 10분 반응하고, '95℃에서 15초 58℃ 1분'을 한 cycle로 하여 총 45 cycle을 반복하였다(표 3).
Figure pat00002
Figure pat00003
2) 혈액내 PCV2 DNA 정량 분석을 위한 표준곡선( Standard curve ) 제작
실시예 2로부터 준비된 플라스미드 PCV2 DNA 3 set (농도: 1011 ~ 101 plasmids per 2.5 ㎕ sample, 3 반복)에 대해 상기 혼합물조성 및 반응조건으로 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)을 실시하였으며, 도 4와 같은 결과를 얻었다. 가장 왼쪽 곡선이 2.5 ㎕ 샘플 당 1011 플라스미드 농도의 결과이며, 오른쪽으로 갈수록 희석된 농도의 PCV2 바이러스가 검출됨을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 cycle threshold 값과 plasmid copy 농도의 log값을 사이의 관계그래프를 통해 추세선을 구함으로써 도 5와 같은 표준곡선(standard curve)을 제작했다.
3) 시험축군에 대한 혈액내 PCV2 DNA 정량 분석
실시예 3에서 돼지 192두의 혈청으로부터 추출된 바이러스 DNA에 대해 상기 혼합물조성 및 반응조건으로 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR)을 실시하였으며, 표준곡선(standard curve)을 이용하여 각 개체별 viral load (PCV2 copies/ml serum)를 정량하였다(표 4).
Figure pat00004
표 4의 결과에서 PCV2는 시험축군내에서 다양한 변이를 나타내고 있음을 알 수 있다. 총 192두의 돼지 중 PCV2가 검출된 개체는 118두로 나타났고 나머지 74두는 quantitative realtime PCR의 detection limit (103 PCV2 copies/ml serum)보다 낮게 나타난 개체로서 PCV2가 없거나 매우 낮은 수준임을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 특이 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 혈액내 PCV2 DNA 정량방법을 통해 농장 수준뿐만 아니라 개체수준에서 PCV2 감염 여부 및 바이러스증식 수준을 정확하게 확인할 수 있음을 증명하였다.
[ 실시예 5] 본 발명에 의한 혈액 내 PCV2 DNA 정량분석방법과 종래 정량분석방법과의 대비
비특허문헌 1에 나타난 종래 PCV2의 ORF2를 타겟으로 하는 혈액내 PCV2 DNA 정량분석방법과 본 발명에 의한 PCV2의 ORF3를 타겟으로 하는 혈액내 PCV2 DNA 정량분석방법을 비교해 보았다.
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 방법은 종래 돼지 혈액내 PCV2 ORF2 DNA를 타겟으로 하는 정량분석방법에 비해 PCR 및 실시간 PCR 모두 민감도가 우수하고 검출범위도 102 ~ 1010으로 넓은 것으로 나타났다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> PCV2 ORF3-specific primer/probe sets and the method for quantitative analysis of PCV2 DNA in the porcine blood using the same <130> P11-130306-01 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1768 <212> DNA <213> Porcine circovirus 2 <400> 1 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60 agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120 cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180 ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240 ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300 agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360 ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420 gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480 tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540 attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600 ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660 atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720 atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780 tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840 cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900 ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960 catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020 ttttattttt catttagggg ttaagtgggg ggtctttaag attaaattct ctgaattgta 1080 catacatggt tacacggata ttgtagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140 cgaggcctac gtggtccaca tttctagagg tttgtagcct cagccaaagc tgattccttt 1200 tgttatttgg ttggaagtaa tcaatagtgg agtcaagaac aggtttgggt gtgaagtaac 1260 gggagtggta ggagaagggt tgggggattg tatggcggga ggagtagttt acatatgggt 1320 cataggttag ggcagtggcc tttggtacaa agttatcatc tagaataaca gcagtggagc 1380 ccactcccct atcaccttgg gtgatggggg agcagggcca gaattcaacc ttaacttttc 1440 ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaacaa 1500 agtcgtccag cttaaatctc atcatgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtac 1560 gcttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc 1620 tccaacggta gcggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680 gatggctgcg ggggcgttgt cttcttctgc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740 aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 tcgatctcaa ggacaacgga gt 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 ttggtcttcc aatcacgctt ctgc 24 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Porcine circovirus 2 <400> 4 cagagcagca ccctgtaacg tttgtca 27

Claims (10)

  1. 서열번호 4의 염기서열 또는 상기 염기서열에 상보적인 염기서열로 이루어진 돼지 혈액내 돼지 써코바이러스 제2형(PCV2) DNA 정량분석용 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 PCV2(GenBank accession number FR823451.1)에서 분리된 것을 특징으로 하는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프로브.
  3. 제1항 기재의 프로브를 포함하는 100 내지 200개의 연속서열로 구성되는 PCR산물을 증폭시킬 수 있는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프라이머 세트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프라이머 세트.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 프로브 및 프라이머 세트는 PCV2 ORF3영역 특이적인 것을 특징으로 하는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 프라이머 세트.
  6. 제3항 또는 제4항 기재의 프라이머 세트; 및
    서열번호 4의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 태크맨 프로브 리얼타임 PCR (TaqMan probe realtime PCR) 반응혼합물을 포함하는 돼지 혈액내 PCV2 DNA 정량분석용 키트.
  8. 하기 단계를 포함하는, 돼지 혈액내 PCV2 DNA를 정량분석하는 방법:
    a) 돼지 혈액으로부터 바이러스 DNA (viral DNA)를 분리하는 단계;
    b) 상기 a)단계의 바이러스 DNA를 주형으로 하여 PCV2의 ORF3영역 중 제1항 기재의 프로브를 포함하는 100 내지 200개의 연속서열에 대한 PCR을 실시하는 단계; 및
    c) 상기 b)단계의 결과를 표준대조시료와 비교하여 PCV2 DNA를 정량분석하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 b)단계에서 서열번호 2과 서열번호 3으로 표시된 프라이머 세트를 이용하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 b)단계에서 서열번호 4로 표시된 프로브를 이용하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020130034897A 2013-03-29 2013-03-29 Pcv2의 orf3 영역에 특이적인 프라이머/프로브 세트 및 이를 이용한 돼지 혈액내 pcv2 dna 정량분석 방법 KR20140118626A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN105044368A (zh) * 2015-03-27 2015-11-11 中国农业科学院兰州兽医研究所 免疫兔血清中猪圆环病毒PCV2抗体水平间接Elisa检测试剂盒及其检测方法和应用
CN108384890A (zh) * 2018-03-29 2018-08-10 河南省动物疫病预防控制中心 鉴别猪圆环病毒2型和3型的二重fq-pcr检测试剂盒
CN109517929A (zh) * 2018-12-21 2019-03-26 武汉科前生物股份有限公司 用于猪圆环病毒检测和2型分型的引物组和试剂盒
CN113025755A (zh) * 2021-03-30 2021-06-25 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种检测猪圆环病毒2e型的试剂及其应用

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