CN108660229B

CN108660229B - 评价脓毒症的生物标志物

Info

Publication number: CN108660229B
Application number: CN201810560929.8A
Authority: CN
Inventors: 陶悦; 杜白露; 沈楠; 莫茜; 曹清; 李璧如; 王莹; 钱娟; 宁铂涛; 干驰; 赵瑞珂
Original assignee: Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Shanghai Childrens Medical Center Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2022-06-21
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN108660229A

Abstract

本发明公开了一种评价脓毒症的生物标志物，所述生物标志物为苛养颗粒链菌；并同时公开了一种评价脓毒症的检测试剂盒。本发明阐述了肠道菌群在脓毒症发生中起着关键作用，并发现苛养颗粒链菌可有效作为脓毒症的检测标志物和治疗靶点，通过该标志物能够容易且可靠地检测脓毒症，为临床上脓毒症的早期诊断提供了可能，从而有利于降低因严重脓毒症或脓毒性休克导致的死亡率。

Description

评价脓毒症的生物标志物

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种评价脓毒症的生物标志物。

背景技术

脓毒症是感染引起的宿主反应失调而导致的致死性器官功能障碍的临床综合症，一旦发病，脓毒症的进展十分迅速，从脓毒症发展至脓毒性休克有时仅需24小时。并且，脓毒症的死亡率一直居高不下，目前可高达30％-50％，在中国，每年大约有100万人死于该病。脓毒症也是世界上导致婴儿和儿童死亡的最常见原因之一，它占到了1～14岁儿童死亡原因的第二位。脓毒症的临床表现较为多样，且缺乏特有的临床表现，所以目前很多学者均在寻找脓毒症的生物学标记物，以用于脓毒症的诊断和预后评价。

脓毒症的发病过程是一个非常复杂的病理生理过程，包括过度的炎症反应及代偿性抗炎症反应的发生、凝血系统的紊乱、细胞功能的紊乱、免疫系统的激活和抑制以及微生态的失衡等。目前发现的用于诊断脓毒症的生物学标记已经有很多，包括脓毒症疾病过程中各个环节的生物学标记物，如凝血、炎症等。C反应蛋白和降钙素原是目前临床上用得最多的诊断脓毒症的生物标志物，它们被看作是细菌感染的特异性标志物，但在一些非感染的情况(如手术后、创伤等)下其水平也会升高。白细胞介素6水平由于在脓毒症发生时变化非常敏感，故在ICU常被作为脓毒症的早期诊断标志物，但它在急性炎症反应综合症和脓毒症区分中的价值一直存在争议，因为在创伤、手术或自身免疫性疾病等情况下白细胞介素6水平会发生改变。但是，目前应用的标记物大多都存在敏感性和特异性不理想等问题，而理想的标志物应具备高效、易于鉴别炎症病因、可识别潜在病毒或细菌感染、准确反映抗感染疗效的优势。因而，新的可以用来诊断和预测脓毒症预后的生物学标记物亟待发现。

发明内容

本发明针对现有技术中脓毒症的生物标志物大多都存在敏感性和特异性不理想的技术问题，目的在于提供一种新的脓毒症的生物标志物，该脓毒症的生物标志物即为苛养颗粒链菌。

本发明的目的之一在于提供一种评价脓毒症的生物标志物，所述生物标志物为苛养颗粒链菌。

本发明的目的之二在于提供一种评价脓毒症的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括苛养颗粒链菌作为生物标志物。

该检测试剂盒包括：能够检测出苛养颗粒链菌的试剂。所述试剂例如包含：一对特异扩增苛养颗粒链菌基因组基因的引物和荧光定量PCR检测方法用试剂。所述特异扩增苛养颗粒链菌基因组基因的引物可为：正向引物如SEQ ID NO:1所示的5'-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3'和反向引物如SEQ ID NO: 2所示的5'-CACGAGCTGACGACA-3'。

所述苛养颗粒链菌是作为标准对照用的苛养颗粒链菌阳性质粒。

所述评价为鉴定、诊断或预测。

所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种苛养颗粒链菌的应用，所述应用为苛养颗粒链菌作为评价脓毒症的生物标志物的应用。

所述应用为苛养颗粒链菌作为制备评价脓毒症的生物标志物的应用。

所述应用为苛养颗粒链菌在制备用于评价脓毒症的检测试剂盒中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种判断脓毒症预后的方法，其特征在于该方法包括检测粪便中苛养颗粒链菌含量的步骤。

所述评价是指为鉴定、诊断或预测脓毒症。

本发明的目的之四在于提供一种判断脓毒症预后的方法，该方法包括检测粪便中苛养颗粒链菌含量的步骤。

在本发明中，苛养颗粒链菌(Granulicatella elegans)是细菌界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，乳酸杆菌目，肉杆菌科，颗粒链菌属；细胞是无动力、不形成芽孢的革兰阳性球菌；该细菌发酵葡萄糖的代谢产物为乳酸、不产气，毗邻芳氨酸酶和亮氨酸芳胺酶阳性。

本发明的积极进步效果在于：本发明人研究发现肠道微生物群在脓毒症发生中起着关键作用，并发现苛养颗粒链菌可以有效作为脓毒症的生物标志物和治疗靶点，通过该生物标志物能够容易且可靠地检测脓毒症。例如，仅通过测定脓毒症患者粪便中所含有的苛养颗粒链菌含量的水平，就比较容易判定是否患有脓毒症。本发明通过该标志物能够容易且可靠地检测脓毒症，为临床上脓毒症的早期诊断提供了可能，从而有利于降低因严重脓毒症或脓毒性休克导致的死亡率。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1A和图1B分别为采用观察物种指数和香农指数指标比较健康儿童对照组和脓毒症患儿试验组的肠道微生物群多样性比较图，

其中，观察物种指数和香农指数均为评价α多样性的指标；统计学方法为曼-惠特尼秩和检验，***P<0.001。

图2为健康儿童对照组和脓毒症患儿试验组差异物种分析图，

使用LDA Effect Size分析，采用线性判别分析(LDA)来估算每个组分 (物种)丰度对差异效果影响的大小。

图3为16S rDNA测序健康儿童对照组和脓毒症患儿试验组肠道中苛养颗粒链菌含量水平的比较图，其中统计学方法为曼-惠特尼秩和检验，****P <0.0001。

图4A和图4B分别为苛养颗粒链菌标准品的标准曲线和荧光定量PCR 检测健康儿童对照组和脓毒症患儿试验组肠道中苛养颗粒链菌相对拷贝数比较图，其中统计学方法为t检验，**P<0.01。

具体实施方式

实施例1筛选与脓毒症相关的肠道菌群标志物

1、基因组样本提取

粪便基因组样本提取

取新鲜或-80℃保存冰冻粪便样本24例(6例来自健康儿童，18例来自上海儿童医学中心住院治疗的脓毒症患儿，均已获得知情同意权)称取200mg，采用QIAamp FastDNAStool Mini Kit(51604)试剂盒提取基因组，最后洗脱体积为60μL。具体步骤如下：在2mL离心管中称量200mg粪便样本并置于冰上；加入1mL InhibitEx Buffer，震荡1min；上述悬液置于70℃金属浴中加热5min；8000rpm室温离心1min，收集上清液；于新的1.5mL 离心管底部加入15uL蛋白酶K，加入200μL上清液；加入200μL Buffer AL，震荡15s；70℃金属浴加热10min，短时离心以除去管盖内沿液体；上述离心管中加入200μL乙醇(浓度为96％～100％)，震荡15s并短时离心；小心将以上混合液加入到QIAamp spin column中，将离心柱放入2mL收集管中，盖紧离心管盖，以8000rpm离心1min，将离心管取出放入一支洁净的2mL收集管中；加入500μL Buffer AW1到离心管中，盖紧离心管盖，以8000rpm 离心1min，将离心管取出放入一支洁净的2mL收集管中；加入500μL Buffer AW2到离心管中，盖紧离心管盖，以13800rpm离心3min；将离心管放入一支新的2mL收集管中，以13800rpm离心3min；将离心管置入一支洁净的 1.5mL收集管，在离心管中加入60μL Buffer AE，室温下静置1min后8000rpm 离心1min；在1％琼脂凝胶上检测DNA浓度和纯度，基因组模板样品-80℃冷藏备用。

2、扩增子产生

引物：16S V4：515F-806R(参见文献DOI：10.1371/journal.pone.0092193)， 18SV4：528F-706R(参见文献10.1038/ismej.2010.26)，18S V9：1380F-1510R (参见文献10.1128/AEM.00057-14)，ITS1：ITS1FITS2(参见文献 10.1016/j.soilbio.2013.05.025)，使用具有条码的特异性引物扩增16S/18S rRNA基因。所有PCR反应30μL反应体系中进行，使用15μL of

High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs)进行反应；前后引物各0.2μM，以及约10ng模板DNA。热循环由98℃初始变形1分钟，然后再 98℃变性10秒，在50℃退火30秒和72℃延伸30秒，进行30次循环变性，最后72℃5分。

3、PCR产物的定量和鉴定

将相同体积的1×加样缓冲液loading buffer(含SYB green)与PCR产物混合，并在2％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测。选择在400～450bp之间具有明亮主条带的样品用于进一步实验。

4、PCR产物混合和纯化

将上述PCR产物以等浓度混合，充分混匀后用2％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用Gene JET Gel Extraction Kit(Thermo Scientific)纯化PCR混合产物。具体步骤如下：用解剖刀或剃刀片切割含有DNA片段的凝胶，尽可能的靠近DNA片段切割，以减小凝胶的含量，将胶片放在事先称重的1.5 毫升离心管并称重，记录胶片的重量；加1:1量的BindingBuffer到胶片中 (量以重量计,如每100毫克琼脂糖凝胶加100微升的Binding Buffer)；在50～60度的条件下温育凝胶混合物10min或者等到凝胶全部融化；每隔几分钟将试管颠倒混匀一次，促进胶融化，保证胶全部溶解；在上柱前将凝胶混合物快速涡旋混匀一次；转移最多800μL凝胶溶解液到基因回收纯化柱，离心1分钟，弃去流出液,然后将柱放回相同的收集管；加入700μLWash Buffer (已用乙醇稀释)到GeneJET纯化柱，离心1分钟，弃去流出液,然后将柱放回相同的收集管；离心空GeneJET纯化柱1分钟，彻底去除残留的Wash Buffer；将GeneJET纯化柱转移到一个干净的1.5mL离心管，加50μLElution Buffer于纯化柱膜，离心1分钟；丢掉GeneJET纯化柱并储存纯化的DNA 在-20℃。

5、文库预备和测序

使用

Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina(NEB，USA) 按照制造商的指示生成测序文库，并添加索引代码。在Qubit@2.0荧光计 (Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100系统上对文库质量进行了评估。最后，在Illumina MiSeq平台上对文库进行了测序，并生成了250bp/300bp 配对末端读数。

6、数据分析

使用FLASH合并来自测序所得的原始DNA片段配对末端reads。根据独特的条形码，将Paired-end read分配给每个样品。使用QIIME软件包分析序列，并使用内部Perl脚本来分析alpha和beta多样性。首先，reads有QIIME 质量过滤器过滤，然后使用pick_de_novo_otus.py通过制作OTU表来选择操作分类单位(OTU)。将具有97％相似性的序列配给相同OTU，选取每个 OTU代表序列，并使用RDP分类器为每个代表序列注释分类信息。

通过16S rRNA扩增子的高通量测序进行的分析表明，对照组和脓毒症组肠道菌群在α多样性和β多样性中均存在显著性差异(如图1A和1B所示)。在差异物种分析中，假单胞菌目、肉杆菌科和苛氧颗粒链菌在脓毒症患儿肠道内富集，而巴斯德菌科、胃瘤球菌属、罗氏乳杆菌和Anaerostipes_ butyratucus在健康儿童肠道内富集(如图2所示)，其中苛养颗粒链菌在脓毒症患者肠道内特异性存在(如图3所示)。

实施例2荧光定量PCR对苛养颗粒链菌的检测

1、按照实施例1中的方式提取粪便基因组样本。

2、苛养颗粒链菌标准品的制备

通过PCR扩增获得苛养颗粒链菌16S rDNA基因片段，扩增的PCR反应体系为(TaKaRa Ex

Hot Start Version,RR006A)：TaKaRa Ex Taq Hs 0.2μL、dNTP Mixture2μL、10×Ex Taq Buffer 2.5μL、正向引物(10μM)1μL、反向引物(10μM)1μL、苛养颗粒链菌菌液1μL和ddH₂O 17.3μL。扩增条件为：94℃，3min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，1min，35个循环；72℃， 5min。扩增产物经TA克隆(使用TaKaRa基于pMD-20T的TA克隆系统) 得到纯质粒原液样本，测定其准确浓度，并按10倍稀释至10^-8次。TA克隆步骤如下：

(1)DNA连接：pMD 20-T质粒0.2μL，16S rDNA片段4.8μL，ligation solution I 5μL，将体系混匀后，室温下连接约1个小时；

(2)DNA转化：将制备好的10μL连接产物加入100μLDH5α菌株感受态细胞中，混合均匀，同时设置对照组，均在冰浴中放置30min；在42℃水浴锅中预热45s，之后在冰浴中放置1min，然后加入300μL的LB液体培养基，37℃培养45min；取100μL上述液体培养基，涂布到凝固好的平板上，同时涂布40μL浓度为20mg/mL的X-gal溶液、70μL浓度为20mg/mL的IPTG 溶液、90μL的无菌水，待液体全部渗入培养基中，将平板倒置在37℃生化培养箱中过夜培养；

(3)单克隆测序：挑选白斑到含有1mL的LB液体培养基的摇菌管，置于摇床上摇菌3h，吸取100μL交由生物公司测序，测序结果在NCBI上利用Blast功能获得该序列相对应种属信息；剩余菌液加入80％甘油后保存于 -80℃冰箱。

(4)提取重组质粒：使用天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒按照说明书提取质粒，用紫外分光光度计检测重组质粒的浓度和纯度，进行10倍梯度倍比稀释作为标准品用于标准曲线的绘制。

3、荧光定量PCR的扩增

(1)引物设计

根据GeneBank中苛养颗粒链菌16S rDNA序列设计1对引物，由深圳华大基因科技服务有限公司合成。具体引物序列如下：

正向引物为5'-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3

反向引物为5'-CACGAGCTGACGACA-3'

(2)按照表1配制荧光定量PCR反应体系

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自TaKaRa公司

表1 PCR反应体系

SYBR Green聚合酶链式反应	10μL
		PCR正向引物(10μM)	0.4μL
PCR反向引物(10μM)	0.4μL
		DNA模板	1μL
ddH<sub>2</sub>O	8.2μL
			总体积为20μL

(3)PCR反应条件：95℃3min；95℃5s，60℃1min，40个循环；95℃5s。在Bio-RadCFXConnect仪器进行测定,通过熔解曲线分析目的片段，ΔΔCT 法进行相对定量。

由图4可见,采用荧光定量PCR检测脓毒症患者肠道内苛养颗粒链菌,脓毒症患者肠道内均可检出苛养颗粒链菌的存在,而在健康儿童对照中并未检出,该结果与16S rDNA高通量测序结果一致。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心

<120>评价脓毒症的生物标志物

<160>2

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>苛养颗粒链菌(Granulicatella elegans)

<400>1

cagcagccgc ggtaatac

18

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>苛养颗粒链菌(Granulicatella elegans)

<400>2

cacgagctga cgaca

15

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心

<120> 评价脓毒症的生物标志物

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 苛养颗粒链菌(Granulicatella elegans)

<400> 1

cagcagccgc ggtaatac 18

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 苛养颗粒链菌(Granulicatella elegans)

<400> 2

cacgagctga cgaca 15

Claims

1.一种苛养颗粒链菌（Granulicatella elegans）的阳性质粒在制备评价脓毒症的检测试剂盒中的应用，其特征在于该检测试剂盒包括苛养颗粒链菌的阳性质粒、能够检测出苛养颗粒链菌的试剂；所述试剂包含：一对特异扩增苛养颗粒链菌基因组基因的引物和荧光定量PCR检测方法用试剂，所述引物包括如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述评价为鉴定、诊断或预测。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苛养颗粒链菌的阳性质粒作为标准对照用。

5.一种苛养颗粒链菌的应用，其特征在于，所述应用为苛养颗粒链菌在制备评价脓毒症的生物标志物中的应用。

6.一种苛养颗粒链菌的应用，其特征在于，所述应用为苛养颗粒链菌在制备用于评价脓毒症的检测试剂盒中的应用。