KR102212379B1 - 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 - Google Patents

포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102212379B1
KR102212379B1 KR1020190029369A KR20190029369A KR102212379B1 KR 102212379 B1 KR102212379 B1 KR 102212379B1 KR 1020190029369 A KR1020190029369 A KR 1020190029369A KR 20190029369 A KR20190029369 A KR 20190029369A KR 102212379 B1 KR102212379 B1 KR 102212379B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
nucleotide sequence
virus
polynucleotide consisting
primer set
Prior art date
Application number
KR1020190029369A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200109767A (ko
Inventor
김홍섭
이승인
이수헌
이홍규
김일회
Original Assignee
대한민국(국립종자원장)
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(국립종자원장), 경북대학교 산학협력단 filed Critical 대한민국(국립종자원장)
Priority to KR1020190029369A priority Critical patent/KR102212379B1/ko
Publication of KR20200109767A publication Critical patent/KR20200109767A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102212379B1 publication Critical patent/KR102212379B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/143—Concentration of primer or probe
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스에 특이적인 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 진단용 키트, 및 이들을 이용하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 진단 방법에 관한 것에 관한 것이다.

Description

포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 {Primer set for simultaneous detection of three viruses in Grapevine and method for detecting three viruses in Grapevine using the same}
포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스에 특이적인 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 진단용 키트, 및 이들을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계를 포함하는 진단 방법에 관한 것에 관한 것이다.
국내 6대 과종인 사과, 배, 포도, 복숭아, 감귤, 감 중 하나인 포도는 사과, 감귤, 복숭아 다음으로 재배면적 및 생산량이 많으며 수요 또한 증가되는 추세이다. 이런 과수 생산에서 제일 문제가 되는 것이 바이러스 병으로 과수에 바이러스가 감염될 경우 전체적으로 생육, 품질 및 수량이 저하된다. 과실에서의 증상은 소과, 기형, 착색불량, 당도저하, 숙기지연 및 얼룩무늬 증상이 나타나며 잎에서는 반점, 잎말림, 괴사반점, 낙엽, 모자이크 증상을 나타내기도 한다. 또한 줄기는 괴사, 균열, 목질부 홈, 총생, 접목 불친화 같은 다양한 증상을 나타낸다. 포도를 포함한 대부분의 과수는 비교적 낮은 농도로 바이러스가 존재하며 체내에 불균일하게 분포되어 있다. 이런 바이러스들은 주로 접목에 의해 전염되며 일부 곤충에 의해 전염되는 특징을 가지고 있다. 특히, 상위단계에서 감염된 묘목을 사용하여 증식하게 될 경우 바이러스의 확산을 야기하고 피해를 가속화 시키게 된다. 이런 과수 바이러스에 감염 피해는 국내 과수산업 경쟁력 제고의 커다란 걸림돌이 되며 과수 바이러스에 의한 피해를 방지하고 무병묘 생산 및 유통 활성화를 위해 감염여부를 쉽게 확인할 수 있는 진단법 개발이 필요하다.
식물 바이러스를 진단하는 기술은 전자현미경을 이용한 진단법, 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction), 지표식물을 이용한 진단법(Bioindex), 효소결합면역흡착법(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay), 차세대염기서열분석법(NGS: next generation sequencing) 등이 있다.
전자현미경을 이용한 진단법의 경우 고가의 장비가 필요하며 주로 형태적인 특징에 의한 바이러스의 동정으로 시간이 많이 소요되고 정확도가 낮다. RT-PCR의 경우 주로 바이러스 진단에 많이 사용하는 방법으로 프라이머 정보와 효소의 특성을 고려하여 진단하는 방법이다. 이는 단순히 단일 바이러스의 경우 진단의 편리성 및 정확성은 있으나 다중 바이러스의 진단의 경우는 프라이머들의 간섭효과 및 효소와의 반응성 등에 영향을 받아 반응 조건을 찾기가 어렵고 바이러스 종이 추가될 때 마다 바이러스 검출 민감도 및 비 특이적 반응이 많이 발생한다. Bioindex는 초본식물을 이용한 방법과 목본식물을 이용한 방법이 있다. 이는 바이러스 무병화 과정시 필수적인 진단 과정의 하나로 분자생물학적 방법에 의해 검출이 되지 않는 바이러스들을 진단 할 수 있는 장점은 있으나 바이러스의 종류와 병징 발현이 잘 되는 감수성이 뛰어난 지표식물을 탐색·유지 및 관리가 어려운 단점이 있다. ELISA는 항체나 항원에 효소를 표지하여 효소의 활성을 측정하는 방법으로 과수 바이러스와 같이 매우 낮은 농도의 항원을 탐지하기에는 큰 어려움이 있다. NGS의 가장 큰 장점은 관련 바이러스 간 보존 염기서열(conserved sequence)의 원칙을 사용하여 바이러스에 대한 사전 정보 없이 잠재적 바이러스를 식별 할 수 있다는 것이다. 그러나, 이 방법은 매우 민감하기 때문에 알려지지 않은 바이러스를 발견할 수 있지만 발견되었다 하더라고 병에 직접적인 원인이라고 판단하기가 어려운 단점이 있다. 따라서, 포도에 발생하는 바이러스를 신속 진단하기 위한 더욱 효과적인 진단 기술에 대한 개발이 요구된다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 역전사효소에 의한 PCR 반응의 DNA 중합효소 활성 저해 효과를 완화 또는 방지할 수 있는 방법을 개발하고, RT-PCR의 증폭 효율까지를 개선시키고자 노력한 결과, 포도에 발생하는 3종 바이러스를 다중으로 진단할 수 있는 특이적 프라이머 세트를 개발하였다.
일 양상은 포도얼룩반점바이러스(GFkV: Grapevine fleck virus), 포도잎말림바이러스 1(GLRaV1: Grapevine leafroll associated virus 1), 및 포도잎말림바이러스 3(GLRaV3: Grapevine leafroll associated virus 3)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도얼룩반점바이러스, 포도잎말림바이러스 1, 및 포도잎말림바이러스 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도얼룩반점바이러스, 포도잎말림바이러스 1, 및 포도잎말림바이러스 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도얼룩반점바이러스, 포도잎말림바이러스 1, 및 포도잎말림바이러스 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
일 양상은, 포도잎말림바이러스 1(GLRaV1: Grapevine leafroll associated virus 1), 포도잎말림바이러스 3(GLRaV3: Grapevine leafroll associated virus 3) 및 포도얼룩반점바이러스(GFkV: Grapevine fleck virus)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 포도잎말림바이러스 1(GLRaV1: Grapevine leafroll associated virus 1)에 감염된 포도나무는 잎이 조기에 붉은색을 띄며 잎말림 증상을 보인다. 품종에 따라 황화 모자이크 증상이 나타나기도 하며 접목에 의해 전염된다.
상기 포도잎말림바이러스 3(GLRaV3: Grapevine leafroll associated virus 3)는 주로 접목에 의해 전염되며 일부 매개충인 깍지벌레에 의해 전염된다고 보고된 바 있다. 주요 증상으로는 잎이 성숙될수록 붉게 변하면서 잎이 말리는 증상을 보인다. 포도가 상기 바이러스에 감염된 경우, 나무 전체가 급속히 약해지고 과실이 크기 및 당도저하로 인해 상품성이 크게 떨어진다.
상기 포도얼룩반점바이러스(GFkV: Grapevine fleck virus)는　접목에 의해 전염되며 감염될 경우 잎의 엽맥을 따라 작은 투명한 반점이 생기고 잎 가장자리의 엽맥이 쭈글쭈글 해지면서 모자이크 증상을 보인다. 상기 바이러스는 품종에 따라 잠복 감염되어 병징(disease symptom)을 보이지 않는 경우도 있다.
상기 진단은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 과정을 의미할 수 있다. 상기 진단은 포도에 상기 3종의 포도 바이러스가 감염되었는지 여부를 확인하는 과정으로 해석될 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도잎말림바이러스 1 유전자 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도잎말림바이러스 1 유전자 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도잎말림바이러스 3 유전자 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도잎말림바이러스 3 유전자 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도얼룩반점 바이러스 유전자 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도얼룩반점 바이러스 유전자 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이다.
상기 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도 내재 유전자인 18S rRNA 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 포도 내재 유전자인 18S rRNA 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다. 본 발명자는 상기 3종의 포도 바이러스 감염을 진단하는데 있어서 위양성(false positive)을 제거하기 위하여 포도에 존재하는 내재 유전자 18S rRNA 유전자를 사용하였다. 증폭을 수행한 결과에서 밴드가 나타나지 않은 경우에 상기 18S rRNA 유전자의 RNA 증폭 산물을 확인함으로써 RT-PCR이 제대로 수행되지 않은 경우나 RNA가 제대로 추출되지 않아 바이러스에 감염되어 있지 않은 것으로 판단하는 오류인, 위양성을 제거할 수 있음을 확인하였다.
상기 프라이머 세트는 포도의 주요 바이러스 중에서 GFkV, GLRaV1, 또는 GLRaV3의 유전자만을 특이적으로 증폭시켜, GFkV, GLRaV1, 또는 GLRaV3의 존재 여부를 판별할 수 있는 표적서열을 증폭시킬 수 있다.
상기 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응, 즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소를 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 다른 유전자와 반응 시에는　PCR　산물을 합성하지 않으면서 진단대상 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여　PCR　산물을 합성할 수 있는 일련의 염기서열을 의미한다.　PCR을 수행하기 위해서는 정방향　프라이머(forward primer; F-primer) 및 역방향　프라이머(reverse primer; R-primer)가 필요하므로, 본 발명의 목적상 1종의 보리　바이러스병을 진단하기 위해 F-프라이머　및 R-프라이머로 이루어진 1종의　프라이머　세트가 사용될 수 있다.
상기 프라이머의 설계를 위해서는 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따를 수 있다. 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기 프라이머는 다중(multiplex) 역전사중합효소연쇄반응법(RT-PCR: reverse transcript-polymerase chain reaction)에 이용될 수 있다. 상기 다중 RT-PCR은 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법을 지칭한다. 2이상의 프라이머 쌍을 혼합하여 동시에 RT-PCR을 수행함으로써 대상 시료 내 2이상의 유전자를 1회에 확인하는 다중 RT-PCR 반응에서는, 프라이머 설계시 단독 RT-PCR의 경우보다 조건이 더욱 엄격한 조건이 요구될 수 있다. 또한, RT-PCR 반응 완료 후, 겔 상에서 증폭되는 유전자 산물의 구별을 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별이 되어야 하는 크기의 제약까지 따를 수 있다. 반응 조건의 설정에 있어서도 동시에 RT-PCR 반응을 수행하고자 하는 프라이머 모두에 대하여 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로, 단독 RT-PCR에 비해서 매우 어려운 조건 설정 과정이 요구될 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트 외에도 역전사 반응과 중합반응을 수행하기 위한 당업계에 공지된 DNA 중합효소, 역전사효소, dNTP 및 반응 완충액을 더 포함할 수 있다. 나아가, 필요한 경우 DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.
상기의 프라이머는 자연적으로 존재하는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 프라이머는 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
상기 프라이머는 검출 가능한 시그널을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 상기 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소 예를 들면, 일반적으로 ELISA 에 이용되는 것, 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 결합할 수 있는 항원 단백질을 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서, 프라이머 세트에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
상기 조성물은 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 또는 포도얼룩반점바이러스에 의한 바이러스 유전자에 각각 특이적인, 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 및 서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하므로 상기 바이러스에 의한 포도 바이러스 감염 여부를 특이적으로 진단할 수 있다.
상기 조성물은 GFkV, GLRaV1, 및 GLRaV3의 검출 목적에 따라 제1 내지 제3 프라이머 세트 중 하나의 프라이머 세트를 단독으로 포함할 수 있으며, GFkV, GLRaV1, 및 GLRaV3 중 2 이상을 동시에 검출하기 위하여 제1 내지 제3 프라이머 세트 중 선택되는 2 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있다. GFkV, GLRaV1, 및 GLRaV3 바이러스 3종을 동시에 검출하기 위하여 제1 내지 제3 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다. 또한, 진단의 위양성을 제거하기 위하여 제4 프라이머 세트가 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 상기 프라이머 외에도, 상기 3종의 포도 바이러스 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 다양한 수단으로 표지될 수 있다.
상기 조성물은 상기 폴리뉴클레오티드를 안정화시키거나 보존하기 위한 용액 및 증폭에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 DNA 중합효소 이외에도 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 역전사 효소를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트에서, 프라이머 세트에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.　바람직하게는 상기 진단용 키트 및 진단용 조성물은 역전사 반응 및 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하지 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다.
상기 키트는 상기 폴리뉴클레오티드 외에 핵산 증폭에 필요한 시약 및 검출에 필요한 시약을 포함할 수 있다. 즉, 상기 키트는 상기 프라이머 세트 외에도, 3종의 포도 바이러스의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 적절한 컨테이너, pH 및 마그네슘 농도가 다양한　반응 완충액, 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP: deoxynucleoside triphosphate), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-워터(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 상기 조성물이 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담긴 형태일 수 있다.
상기 키트는 상기 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있다. 상기 시약 및 도구는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등을 포함할 수 있다.
상기 적합한 담체는 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 프라이머 세트를 포함하는 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 프라이머 세트에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
상기 방법은 주형으로서 포도 식물체 유래의 시료로부터 분리된 핵산, 및 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 혼합하는 혼합물을 인큐베이션하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 중합효소 연쇄반응에서 생성된 산물을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 특이적으로 진단하는 방법일 수 있다. 또한, 상기 방법은 2종 이상의 포도 바이러스 감염을 동시에 진단하는 방법일 수 있다.
상기 포도 식물체 시료는 상기 3종의 포도 바이러스의 감염이 의심되는 포도로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 예를 들어, 포도 식물체의 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화분, 종자 및 열매 등으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 중합효소 연쇄반응은 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR: reverse transcript-polymerase chain reaction)일 수 있다.
상기 역전사 중합효소 연쇄반응에서, 프라이머 세트의 농도는 1 내지 12 pmol/㎕, 구체적으로는 2.5 내지 10 pmol/㎕, 보다 구체적으로는 5 내지 8 pmol/㎕일 수 있다.
상기 역전사 중합효소 연쇄반응은 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계; 95℃에서 15분 동안 변성하는 단계; 95℃에서 20초 동안 반응시키고, 58℃에서 40초 동안 반응시킨 후, 72℃에서 1분 내지 3분 동안 증폭시키는 단계; 및 72℃에서 3분 동안 최종적으로 신장시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 변성하는 단계에서 15분 미만의 반응시간에서는 변성이 원활하게 이루어지지 않을 수 있으며, 15분 초과의 반응시간에서는 과도한 변성이 일어나 다음 단계의 증폭 반응을 수행하는데 부적합할 수 있다.
상기 증폭시키는 단계에서 95℃에서 20초간 반응시킨 다음 반응 온도가 58℃ 미만일 경우 원하는 서열이 충분히 증폭되지 않아 시료 내 바이러스의 존재를 검출할 수 없거나 어려울 수 있다. 반대로, 반응 온도가 58℃ 초과할 경우 과도한 증폭이 일어날 수 있다. 또한, 상기 증폭시키는 단계에서 20회 내지 50회, 구체적으로는 30회 내지 40회, 보다 구체적으로는 32회 내지 38회로 반복 수행하는 것일 수 있다.
상기 최종적으로 신장시키는 단계에서 72℃에서 3분 미만의 반응 시간에서는 원하는 서열이 충분히 신장이 이루어지지 않을 수 있고, 3분 초과의 반응 시간에서는 과도한 서열의 신장이 발생할 수 있다. 따라서, 72℃에서 3분 동안 최종적으로 신장시키는 단계는 상기 프라이머 세트를 이용하여 상기 3종의 포도 바이러스를 증폭하여 감염을 진단 또는 검출하기 위한 최적의 조건일 수 있다. 상기 수치범위를 벗어나는 경우, 시료 내 바이러스 증폭이 원할하게 이루어지지 않아 시료 내 존재하는 바이러스의 존재를 진단하는데 어려움이 있을 수 있다.
상기 방법은 예를 들어, 상기 다중 RT-PCR을 수행하여 시료 내 존재하는 유전자를 증폭시킨 후, 이를 아크릴 아미드 겔 또는 아가로스 겔에 전기영동하여 밴드를 확인함으로써, 시료 내 존재하는 바이러스의 존재를 검출 또는 진단할 수 있다.
상기 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계에서, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트를 더 포함하여 수행하는 것일 수 있다.
상기 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계에서 얻어진 산물 중 제1, 제2 및 제3의 프라이머 세트의 증폭산물 중 하나 이상이 존재하는 경우, 상기 포도 식물체는 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스에 감염된 것으로 진단할 수 있다.
일 양상에 따른 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 진단용 키트 및 진단방법은 RT-PCR 수행시 위양성 없이 감염 시료로부터 상기 3종의 포도 바이러스를 신속하고 간편하게 진단할 수 있으므로, 진단 비용 및 노력을 절감하는 효과가 있다.
또한, 과수 바이러스 효율적인 진단함으로써 고품질의 포도 묘목을 생산 및 유통할 수 있으므로, 농업 현장에서 발생하는 문제를 해결하는데 기여할 수 있다.
도 1은 포도 3종 바이러스 진단을 위한 프라이머 세트 선택의 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 단일 RT-PCR 검출의 한계를 평가하기 위한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 다중 RT-PCR 검출의 한계를 평가하기 위한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 포도 바이러스인 GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV, 양성 대조군인 내재 유전자 18S rRNA에 대한 다중 RT-PCR을 수행한 결과(a), 및 설계된 프라이머 세트를 이용하여 실제 포도 시료에서 바이러스 3종에 대한 다중 RT-PCR을 수행한 실험 결과(b)를 나타낸 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 포도에 발생하는 바이러스의 진단을 위한 다중 RT-PCR용 프라이머 세트의 설계
1. 프라이머 세트의 설계를 위한 포도 바이러스 감염 샘플의 수득
포도에 발생하는 3종의 바이러스인 포도얼룩반점바이러스(GFkV: Grapevine fleck virus), 포도잎말림바이러스 1(GLRaV1: Grapevine leafroll associated virus 1), 및 포도잎말림바이러스 3(GLRaV3: Grapevine leafroll associated virus 3)을 다중으로 진단할 수 있는 프라이머 세트를 설계하기 위해, GLRaV1, GLRaV3, GFkV에 감염된 샘플을 국립종자원 재배시험 포장 및 경산시 농업기술센터에서 포도 줄기를 포함한 어린잎부터 성엽까지의 모든 부위를 골고루 채취하여 수득하였다. 무작위로 채취한 시료에는 잎이 말리는 증상, 잎 변색 및 점무늬 같은 바이러스 유사 증상을 나타내는 샘플도 함께 포함되었다.
2. 수득된 바이러스 감염 포도 샘플의 총 RNA 추출
WizPrepTM plant RNA 미니 키트(Wizbio Solutions, Korea), NucleoSpin® Plant II(Macherey-Nagel, Germany) 또는 자동핵산추출기(BioMerieux)를 이용하여, 제조사가 제안한 방법에 따라 수득된 바이러스 감염 샘플로부터 총 RNA를 추출하였다. 구체적으로, 용해 단계에서는 균질화된 잎 0.1g을 1.5ml 튜브에 옮기고, RPL1(ribosomal protein L1) 완충액 450㎕ 및 β-머캅토 에탄올 4.5㎕와 혼합하였다. 혼합물 400 ㎕를 필터 컬럼으로 옮기고, 1분간 13,000 rpm로 원심분리하여 혼합물을 취하고 필터 컬럼을 버렸다. 바인딩 단계에서는 상기 혼합물에 에탄올 200 ㎕을 첨가하여 1차 세척을 수행하였다. 세척 후 얻어진 혼합물을 2.0ml 수집튜브에 연결된 RNA 스핀 컬럼에 가하고 30 초간 13,000rpm으로 원심분리 하였다. 스핀 컬럼의 통과액을 버리고 컬럼을 다시 연결하였다. 세척 단계에서는 RPW1 Buffer 700㎕를 RNA 스핀 컬럼에 넣고 30초간 13,000 rpm으로 원심 분리한 후 통과액을 버렸다. RPW2 완충액 500㎕를 RNA 스핀 컬럼에 넣고 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하고 통과액을 버렸으며, 이를 2회 반복하였다. RNA 필터 컬럼을 건조하기 위해 마지막으로 2분간 13,000 rpm으로 원심 분리하였다. 용출 단계에서는 RNA 스핀 컬럼을 1.5ml 튜브에 연결하고 DNase/RNase가 없는 용출 용액인 뉴클레아제 프리 워터(Nuclease free water)를 50㎕를 가한 후, 실온에서 3분간 배양하고, 1분간 13,000 rpm으로 원심 분리하였다. 상기 과정에 따라 추출된 총 RNA는 70℃에서 보관하였다.
3. 종-특이적 프라이머의 설계
종-특이적 프라이머를 설계하기 위하여, 각기 다른 바이러스 균주의 다양한 서열을 수집하고 정렬하여 바이러스의 공통된 서열을 선택하였다. 바이러스가 동일하게 가지고 있는 공통된 서열을 프라이머의 후보군으로 선정하였다. 프라이머 후보군들 중 동일한 속(genus)에 속하는 다른 바이러스들과 비교하여 가장 많은 양을 나타내는 특정한 서열을 종-특이적 프라이머로 선택하였다. 종-특이적 프라이머를 설계하기 위해, GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV 염기 서열을 Genbank(NCBI)로부터 수집하고, 프라이머의 설계를 DNAMAN 소프트웨어 (ver.5.2.2.10) 프로그램을 사용하여 수행하였다. 그 결과, 상기 설계된 GLRaV1을 검출하는 프라이머 세트, GLRaV3를 검출하는 프라이머 세트, GFkV를 검출하는 프라이머 세트, 및 18S rRNA 검출하는 프라이머 세트를 얻었다.
4. 종-특이적 프라이머의 확인
상기 3절에서 설계된 프라이머 세트 각각을 프라이머로 하고, 상기 2절에서 수득된 바이러스 감염 포도 샘플의 총 RNA를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응은 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계, 95℃에서 15분의 변성시키는 단계, 95℃에서 20초간 반응시킨 다음 58℃에서 40초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계로 수행되었다. 상기 증폭시키는 단계는 35회 반복 수행하였다. 이후, 72℃에서 3분 동안 최종적으로 신장시키는 단계를 수행하였다.
설계된 프라이머의 특이성을 확인하기 위해, 상기 PCR의 증폭 산물을 시퀀싱하였다. PCR 증폭 산물을 AccuRapidTM PCR 정제 키트 (Bioneer Co., Korea)로 정제하였다. 정제된 증폭 산물을 RBC TA 클로닝 벡터 키트 (RBC Bioscience Co., Taiwan) 및 DNA 라이게이션 키트 Ver 2. 1. (TakaRa, Korea)를 이용하여 TA 클로닝 플라스미드 벡터에 결합시키고, 얻어진 벡터를 42℃, 1분 30초 조건에서 대장균(E. coli DH5α)에 형질전환 시켰다. 이 산물을 37℃에서 24시간 배양하여 여러 개의 단일 콜로니를 확보하였다. 클로닝하였다. DNA-spinTM Plasmid DNA 정제 키트 (iNtRON Biotecnology, Korea)를 사용하여 상기 세포로부터 얻어진 플라스미드를 추출하고 SolGent Co., Ltd.(한국)에 의뢰하여 추출된 플라스미드의 염기 서열을 분석하였다.
그 결과, 각 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의한 증폭 산물의 서열을 확인하였다. 서열이 확인된 각 증폭 산물의 서열을 BLAST를 사용하여 검색한 결과, 이전에 보고된 바이러스와 90-98%의 상동성이 확인되어, 설계된 종-특이적 프라이머는 각각 GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV 바이러스를 특이적으로 증폭시킴을 확인하였다.
실시예 2: 포도 바이러스 감염의 다중 진단을 위한 프라이머 조합의 선택
동시에 진단이 가능한 프라이머의 조합을 선택하고, 선택된 포도 바이러스 감염의 다중 진단용 프라이머 세트가 종-특이적으로 간섭효과 없이 증폭시키는지 여부를 확인하기 위해, 다중 RT-PCR을 다양한 크기의 앰플리콘을 표적으로 하는 다양한 프라이머로 수행하였다. 또한, 상기 실험은 DNase/RNase가 없는 10배 단계로 희석된 양성 대조군으로부터 총 RNA를 추출하고 검출 한계를 시험하였다. PCR 산물을 아가로스 겔에서 전기영동하고 ExpinTM Combo GP, 200p (GeneAll, Korea)로 정제하여 복제하고 서열을 확인하였다.　 프라이머 쌍 사이의 간섭을 줄이는 프라이머 세트를 선택하기 위해 여러 번의 다중 RT-PCR 실험을 수행하였다. 다중 RT-PCR은 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계, 95℃에서 15분의 변성시키는 단계, 95℃에서 20초간 반응시킨 다음 58℃에서 40초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계로 수행되었다. 상기 증폭시키는 단계는 35회 반복 수행하였다. 이후, 72℃에서 3분 동안 최종적으로 신장시키는 단계를 수행하였다.
그 결과, 최종적으로 포도 바이러스 감염의 다중 진단을 위한 프라이머 세트를 선택한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 프라이머 위치 결정을 위한 참조 번호로서 각각 GLRaV1은 KJ827404.1, GLRaV3은 hg130315.1, GFkV는 AJ309022.1, 18S rRNA는 AF207053.1을 참조하여 결정하였다.
바이러스 ·내재 유전자 프라이머 크기 (bp) 위치 서열번호
GLRaV1 V1-F2 100 13452-13474 1
V1-R2 13530-13551 2
GLRaV3 V3-F4 310 278-300 3
V3-R2 564-587 4
GFkV kV-F6 166 6434-6458 5
kV-R3 6578-6599 6
18S rRNA 18S-F3 550 568-591 7
18S-R2 1094-1117 8
도 1은 상기 프라이머 세트의 다중 진단 효능을 확인한 결과를 나타내었다. 도 1의 M 레인은 사이즈 마커, P는 양성 대조군 및 N은 음성 대조군을 나타내었고 1, 4, 5, 7-11, 13, 14 레인은 2종 바이러스에 감염된 샘플을 나타내었고, 2, 3, 6, 12 레인은 1종 바이러스에 감염된 샘플을 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 표 1에 나타낸 프라이머 세트를 이용할 경우, 모든 앰플리콘은 각 바이러스에 대하여 특이성을 갖도록 원하는 증폭 산물을 수득할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 표 1에 나타낸 프라이머 세트는 GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV 감염에 대하여 간섭 효과 없이 다중 진단이 가능함을 확인하였다.
실시예 3: 단일 RT-PCR을 이용한 단일 진단 방법의 수행
1. 단일 RT-PCR 반응 조건의 확립 및 전기영동 실험의 수행
단일 RT-PCR은 Misogene 2 × one step RT-PCR Mastermix (Misogene Inc., Korea)에 의해 수행되었다. RT-PCR 예비 배합물(premix)에 총 RNA 주형 2.5 ㎕와 개별적으로 3종의 바이러스인 GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 7.5 pmol/㎕ 농도로, 내재 유전자용 18S rRNA에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 2.5 pmol/㎕ 농도로 각각 1/㎕씩 넣고 DNase/RNase-프리 워터(free water)를 첨가하여 최종 반응액 20㎕를 조성하였다.
각 프라이머 세트를 이용한 역전사 중합효소 연쇄반응을 하기 조건으로 수행하였다. 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계, 이후 95℃에서 15분 동안 변성 단계를 수행하였다. 이후, 95℃에서 20초간 반응시킨 다음 58℃에서 40초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계를 35회 반복 수행하고, 최종적으로 72℃에서 3분 동안 연장시키는 단계를 수행하였다. RT-RCR 실험을 수행한 후, 1.5% 아가로즈 겔(iNtRON Biotechnology Inc., Korea)에서 120V로 40분 동안 수행하여, 증폭물을 정제 및 분리하였다.
2. 단일 RT-PCR 측정법의 검출 한계 확인
설계된 프라이머를 이용한 단일 RT-PCR 측정법의 최소 검출 한계를 평가하기 위해, 총 RNA를 양성 대조군으로부터 추출하였다. 총 RNA는 10배 단계로 희석하여 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 농도로 상기 1절에 기재된 조건으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 2는 총 RNA의 희석 농도에 따라, 각 프라이머 세트를 이용한 단일 RT-PCR 측정법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 도 2의 레인 M은 사이즈 마커, N은 음성 대조군을 나타내며 레인 1은 감염된 샘플의 총 RNA로부터 만들어진 cDNA이며, 레인 2-7은 각각 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6로 희석된 샘플을 나타낸 것이다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 프라이머 세트를 이용한 단일 RT-PCR 측정법의 검출 한계는 총 RNA가 10-5로 희석된 농도인 2.5x10-5 ㎕임을 확인하였다.
즉, 설계된 프라이머 세트는 최대 10-5 농도까지 희석된, 낮은 농도의 RNA로부터 GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV 감염의 진단 가능하므로, 상기 프라이머 세프의 우수한 진단 효능을 확인하였다.
실시예 4: 다중 RT-PCR을 이용한 다중 진단 방법의 수행
1. 다중 RT-PCR 반응 조건의 확립 및 전기영동 실험의 수행
다중 RT-PCR은 Misogene 2 × one step RT-PCR Mastermix (Misogene Inc., Korea)에 의해 수행되었다. RT-PCR 예비 배합물에 총 RNA 주형 2.5 ㎕와 2종의 바이러스인 GLRaV1 및 GLRaV3에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 농도를 각각 7.5 pmol/㎕, 1종의 바이러스인 GFkV에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 농도를 10 pmol/㎕, 내재 유전자용 18S rRNA 정방향 및 역방향 프라이머 농도를 2.5 pmol/㎕로 하여, 각각 1/㎕씩 넣고 DNase/RNase-프리 워터 없이 최종 반응액 20㎕를 조성으로 하여 RT-PCR을 수행하였다.
각 프라이머 세트를 이용한 역전사 중합효소 연쇄반응을 하기 조건으로 수행하였다. 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계, 이후 95℃에서 15분 동안 변성 단계를 수행하였다. 이후, 95℃에서 20초간 반응시킨 다음 58℃에서 40초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계를 35회 반복 수행하고, 최종적으로 72℃에서 3분 동안 연장시키는 단계를 수행하였다. RT-RCR 실험을 수행한 후, 1.5% 아가로즈 겔(iNtRON Biotechnology Inc., Korea)에서 120V로 40분 동안 수행하여, 증폭물을 정제 및 분리하였다.
2. 다중 RT-PCR 측정법의 검출 한계 확인
설계된 프라이머를 이용한 단일 RT-PCR 측정법의 최소 검출 한계를 평가하기 위해, 총 RNA를 양성 대조군으로부터 추출하였다. 총 RNA는 10배 단계로 희석하여 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 농도로 상기 1절에 기재된 조건으로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 3은 총 RNA의 희석 농도에 따라, 각 프라이머 세트를 이용한 다중 RT-PCR에 의한 측정법의 검출 한계를 나타낸 것이다. 레인 M은 사이즈 마커, N은 음성대조군을 나타내며 레인 1은 감염된 샘플의 총 RNA로부터 만들어진 cDNA이며, 레인 2-7은 각각 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6로 2반복씩 희석된 샘플을 나타낸 것이다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 프라이머 세트를 이용한 다중 RT-PCR 측정법의 검출 한계는 총 RNA가 10-5로 희석된 농도인 2.5x10-5 ㎕임을 확인하였다.
즉, 설계된 프라이머 세트는 최대 10-5 농도까지 희석된, 낮은 농도의 RNA로부터 GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV 감염을 간섭 효과 없이 다중 진단이 가능하므로, 상기 프라이머 세프는 낮은 농도에서도 3종의 포도 바이러스를 동시에 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 내재 유전자를 포함한 다중 RT-PCR을 이용한 포도 바이러스 검출 확인
위양성(false positive)을 제거하기 위하여 내재 유전자인 18S rRNA의 프라이머 세트를 더 포함하는 프라이머 세트를 이용하여, 상기 실시예 4의 RT-PCR 조건과 동일한 조건 하에 포도 잎 8점에서 수득한 시료에 대하여, 3종의 포도 바이러스의 검출을 시도하였다.
그 결과, 도 4는 포도 바이러스인 GLRaV1, GLRaV3 및 GFkV, 양성 대조군인 내재 유전자 18S rRNA에 대한 다중 RT-PCR을 수행한 결과, 및 설계된 프라이머 세트를 이용하여 실제 포도 시료에서 바이러스 3종에 대한 다중 RT-PCR을 수행한 실험 결과를 나타낸 도면이다. 도 4a에서 레인 1-4까지는 바이러스 및 내재 유전자 크기별로 제작한 양성대조군을 레인 5는 레인 1-4의 상기 양성대조군의 혼합 조성물로 진단을 수행한 결과를 나타내었다. 도 4b에서 실제 수득한 포도 잎 시료 8점을 설계된 프라이머 세트로 진단한 결과를 나타내었다.
도 4a에 나타낸 바와 같이, 설계된 프라이머 세트를 사용하는 경우, PCR에 의하여 바이러스 및 내재 유전자를 모두 진단할 수 있음을 확인하였다. 도 4b에서, P는 양성 대조군이므로, PCR에 의하여 내재 유전자 및 3종의 포도 바이러스 프라이머 세트가 모두 검출되었다. 이와 달리, N은 음성 대조군이므로, PCR에 의하여 어떤 프라이머 세트도 검출되지 않았다. 레인 1은 3종 바이러스가 없는 시료로 내재 유전자인 18S rRNA만 증폭되었다. 레인 2는 GLRaV1 1종 감염, 레인 3은 GFkV 1종 감염, 레인 4는 GLRaV3 1종 감염, 레인 5는 GFkV, GLRaV1 2종 감염, 레인 6은 GLRaV3, GLRaV1 2종 감염, 레인 7은 GLRaV3, GFkV 2종 감염, 레인 8은 GLRaV3, GFkV, GLRaV1 3종 모두 감염된 시료인 것으로 진단할 수 있음을 확인하였다.
즉, 설계된 프라이머 세트를 이용하여 위양성 없이 실제 포도 시료에서 감염된 바이러스 3종을 모두 효율적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
<110> KOREA SEED and VARIETY SERVICE Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for simultaneous detection of three viruses in Grapevine and method for detecting three viruses in Grapevine using the same <130> PN125743 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLRaV1-F2 <400> 1 tatgtgctga agtgatgggt aat 23 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLRaV1-R2 <400> 2 gtgtctggtg acgtgctaaa cg 22 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLRaV3-F4 <400> 3 gcccgaaaaa tacgtattcg cca 23 <210> 4 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GLRaV3-R2 <400> 4 cttcttacac agctccatca atgc 24 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFkV-F6 <400> 5 atgccgcctc tccgtctgct gacca 25 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFkV-R3 <400> 6 gtgatgtcat accacaggaa ct 22 <210> 7 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA-F3 <400> 7 tccaatagcg tatatttaag ttgt 24 <210> 8 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18S rRNA-R2 <400> 8 aagtttcagc cttgcgacca tact 24

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트;
    서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트를 포함하는,
    포도잎말림바이러스 1(GLRaV1: Grapevine leafroll associated virus 1), 포도잎말림바이러스 3(GLRaV3: Grapevine leafroll associated virus 3) 및 포도얼룩반점바이러스(GFkV: Grapevine fleck virus)의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트를 더 포함하는 것인 프라이머 세트.
  3. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트;
    서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트를 포함하는,
    식물체에서 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 다중으로 진단하기 위한 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트를 더 포함하는 것인 조성물.
  5. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트;
    서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및
    서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트를 포함하는,
    포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 다중으로 진단하기 위한 키트.
  6. 청구항 5에 있어서, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트를 더 포함하는 것인 키트.
  7. 주형으로서 포도 식물체 유래 시료로부터 분리된 핵산, 및
    서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트를 혼합하는 혼합물을 인큐베이션하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스의 감염을 진단하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 시료는 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 또는 포도얼룩반점바이러스의 감염이 의심되는 포도 식물체로부터 분리된 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화분, 종자 및 열매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 생물학적 시료인 것인 방법.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응은 역전사 중합효소 연쇄반응인 것인 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응에서 생성된 중합효소 연쇄반응 산물을 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계에서, 프라이머 세트의 농도는 2.5 내지 10 pmol/㎕인 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 역전사 중합효소 연쇄반응은 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계; 95℃에서 15분 동안 변성하는 단계; 95℃에서 20초 동안 반응시키고, 58℃에서 40초 동안 반응시킨 후, 72℃에서 3분 동안 증폭시키는 단계; 및 72℃에서 3분 동안 최종적으로 신장시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 증폭시키는 단계를 30회 내지 40회로 반복 수행하는 것인 방법.
  14. 청구항 7에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계에서, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트를 더 포함하여 수행하는 것인 방법.
  15. 청구항 7에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계에서 얻어진 산물 중 제1, 제2 및 제3의 프라이머 세트의 증폭 산물 중 하나 이상이 존재하는 경우, 상기 포도 식물체는 포도잎말림바이러스 1, 포도잎말림바이러스 3 및 포도얼룩반점바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스에 감염된 것으로 진단하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
KR1020190029369A 2019-03-14 2019-03-14 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 KR102212379B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190029369A KR102212379B1 (ko) 2019-03-14 2019-03-14 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190029369A KR102212379B1 (ko) 2019-03-14 2019-03-14 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200109767A KR20200109767A (ko) 2020-09-23
KR102212379B1 true KR102212379B1 (ko) 2021-02-04

Family

ID=72708825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190029369A KR102212379B1 (ko) 2019-03-14 2019-03-14 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102212379B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102414947B1 (ko) 2020-11-09 2022-06-30 서울대학교산학협력단 복숭아에서 발생하는 5종의 곰팡이 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gambino 등, Phytopathology, Vol. 96, No. 11, 페이지 1223-1229 (2006.06.07.)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200109767A (ko) 2020-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101985654B1 (ko) 패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
KR102165043B1 (ko) 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단방법
Delić Polymerase chain reaction for phytoplasmas detection
KR101149422B1 (ko) 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법
KR102318379B1 (ko) 어위니아 아밀로보라와 어위니아 피리폴리애의 신속 동시 검출용 마커 조성물
Li et al. An improved reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the detection of two cherry flexiviruses in Prunus spp.
KR102212379B1 (ko) 포도에서 발생하는 3종의 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법
KR102424329B1 (ko) 토마토 반점 위조 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 토마토 반점 위조 바이러스 검출방법
KR101546758B1 (ko) 가루이 매개 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
JP2019110810A (ja) イチゴの病原ウイルス由来の核酸を特異的に増幅するためのプライマーセットおよびイチゴの病原ウイルスの検出方法
KR101459616B1 (ko) 고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법
Fu et al. Rapid and quantitative detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in sugarcane stalk juice using a real‐time fluorescent (TaqMan) PCR assay
KR20110039575A (ko) 바이로이드 ＰＳＴＶｄ 및 ＴＣＤＶｄ의 동시 검출 방법
KR20230137097A (ko) 마이코플라스마 갈리셉티쿰 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출방법
KR101705577B1 (ko) 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 멜론 괴저반점 바이러스 저항성 및 이병성 품종 선별방법
JP6226460B2 (ja) 核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、ｄｎａチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法
KR102317218B1 (ko) 체리 바이러스 3종의 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도
KR102137500B1 (ko) 기장 또는 조 유래 바이러스의 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도
KR101493910B1 (ko) 딸기잠재원형반점 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102661069B1 (ko) 일천궁 및 토천궁에 발생하는 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트
CN107110864B (zh) 用于检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法
KR20230041366A (ko) 떫은감에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 3종의 다중 진단용 조성물 및 이의 이용
KR101750837B1 (ko) MNSV, SqMV, WMV, 및 CABYV 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법
KR102334568B1 (ko) 낭충봉아부패병에 저항성을 갖는 토종벌 판별용 조성물
KR102143795B1 (ko) 뎅기바이러스 혈청형 2 또는 4의 검출을 위한 등온고리매개 증폭 프라이머 세트 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right