KR102165043B1 - 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단방법 - Google Patents

사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 역전사 중합효소 연쇄반응용 프라이머 세트, 조성물, 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 Apple mosaic virus(ApMV), Apple stem grooving virus(ASGV), Apple stem pitting virus(ASPV), Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV) 및 Apple scar skin viroid(ASSVd)를 동시에 효율적으로 진단할 수 있는 프라이머 세트의 조합으로 이루어진 다중 진단용 프라이머 세트, 조성물, 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것으로, 본 발명의 진단 조성물을 이용하여 RT-PCR 수행 시 위양성 없이 감염 시료로부터 사과 및 배의 바이러스 및 바이로이드만을 신속, 간편하게 진단할 수 있어 진단 비용 및 노력 절감 효과가 있다. 본 발명을 이용하면 과수 바이러스 및 바이로이드의 효율적인 진단으로 인해 고품질의 사과 및 배 묘목을 생산·유통하여 농업 현장에서 발생하는 문제를 해결하는데 기여할 수 있다.

Description

사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 프라이머 세트 및 진단방법{Primer set for multiple detection apple and pear viruses and viroid and method for detecting said viruses and viroid using the same}
본 발명은 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 역전사 중합효소 연쇄반응용 프라이머 세트, 조성물, 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것이다.
영년생 목본성 과수인 사과와 배는 체내에 바이러스 농도가 비교적 낮고 불균일하게 분포하며 잠복 감염되어 있는 경우가 많다. 이러한 이유로 바이러스 감염 여부를 파악하지 않고 과수를 계속적으로 재배하게 되어 오히려 바이러스를 확산시키는 결과를 초래하고 있다. 또한 대다수의 과수는 접목을 실시하는 경우가 많아, 바이러스 축적을 가속화 시키고 있다.
바이러스는 사과 및 배에서 심각한 병을 유발하기도 하며 수세약화, 수명단축, 결실지연, 수량감소, 과실의 착색불량, 기형과 발생 및 과실의 당도 감소 등의 품질저하를 야기할 뿐만 아니라 접목 불친화성 증대로 묘목 생산율을 감소시킬 수 있다. 이러한 과수 바이러스에 의한 병해를 방지하기 위하여 치료법 개발과 더불어 감염여부를 쉽게 확인할 수 있는 검출방법의 개발이 시급한 실정이다.
ACLSV(Apple Chlorotic leaf Spot Virus)는 접목 전염되어 고접병을 야기한다. 새로운 품종을 갱신하기 위하여 접목할 경우 접수 품종이 이들 바이러스에 잠재 감염되어 있으면 2-3년 후에 나무 전체가 급속히 약해지고 심한 경우는 고사하는 병이 발생할 수 있다.
과수 바이러스 중 사과줄기패임바이러스(Apple Stem Pitting Virus)는 지금까지 국내 여러 지역의 과수원에서 발견되고 있는 문제 병해로써 사과줄기패임바이러스(ASPV)에 감염되면, 사과 및 배에 고접병이 발병한다. 사과 및 배 묘목에 고접병에 감염되면 잎이 작아지고 잎에 황백색의 선명한 모자이크가 발생하고 조기에 홍엽으로 변하며, 신초의 생육이 나빠지고 수세가 점차 쇠약해져서 과실도 작아지고 결실율이 떨어져 수피에 균일이 생기기도 하여, 재배 농민에게 심각한 피해를 준다.
국내에서 보고된 주요 과수 바이러스 중 ASGV (Apple stem grooving virus)는 배 ‘신고’ 품종에서 검은점병의 원인이 되는 바이러스로 알려졌다. ‘신고’ 배 검은점병 (pear black necrotic leaf spot)의 발병은 생산량 저하와 직접적으로 연결되며, 이의 원인이 되는 ASGV는 감염 후 잠재적으로 존재하면서 병징이 잘 나타나지 않는다. 그러나 일단 병징이 나타나면 농가에 많은 피해를 초래하므로 이 바이러스를 발병 전에 검출하는 것은 매우 중요하다.
과수 바이로이드 중 ASSVd(Apple scar skin viroid)는 1998년 경북지역의 한 농가에서 처음 발견된 이후로 지금까지 여러 지역의 과수원에서 발견되고 있어 큰 문제가 되고 있다. ASSVd 감염과실은 크기가 작아지며 과피가 얼룩덜룩해지고 상품성을 잃게 되어 농가에 큰 손실을 주게 되었고 특히 어린열매 생육기에는 잎이나 줄기 등에 병징이 나타나지 않고 결실기의 과일 표피에 비로소 병징이 나타나기 때문에 막대한 손실을 야기하고 있다.
사과 바이러스 중 ApMV(Apple mosaic virus)는 지금까지 국내 여러 지역의 과수원에서 발견되고 있는 문제 병해로써 잎에 황백색의 선명한 모자이크가 발생하고 품종에 따라 모자이크 발현 병징이 다양하며 수세가 약해져 수량이 감소해 재배 농민에게 심각한 피해를 준다. 뿐만 아니라 어린열매 생육기에는 병징이 잘 나타나지 않고 성목기에 들어서야 병징이 나타나므로 피해가 더욱 커지고 또한 동시에 나무의 활력이 많이 떨어지게 되어 농가에 손실을 입히고 있다. 따라서 ApMV가 감염되어 있지 않은 무병묘를 선발, 보급하는 것이 가장 근본적인 대책이기 때문에 ApMV를 정밀하게 진단하는 여러 방법이 개발되어 왔다.
사과 및 배에 발생하는 바이러스·바이로이드의 진단기술로는 지표식물을 이용한 생물 검정법, 항혈청 검정법, PCR 검정법 등이 있다.
지표식물을 이용한 생물검정은 바이러스에 감수성을 가지는 목본 지표식물을 이용한 검정방법으로, 바이러스 무병묘 육성이나 검역시에 필수적인 과정으로 이용된다. 그러나 바이러스 종류에 따라 병징 발현이 빠르고 감수성이 우수한 지표식물을 탐색하여야 하는 단점이 있다.
항혈청 검정법은 ELISA(효소결합면역항체법) 등을 이용하는 방법으로 검출 감도가 낮아 과수 바이러스와 같이 수체내 바이러스 농도가 낮고 불균일하게 분포되어 있는 식물체에서는 검출결과를 얻기 어려우며, 재현성이 부족한 단점이 있다.
PCR 검정법은 바이러스만 DNA 단편을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여 검정하는 방법으로, 각 바이러스에 특이적인 프라이머 및 PCR 반응 조건 등을 확립하기 어렵고 검정비용이 비싼 단점이 있다.
따라서, 사과 및 배에 발생하는 바이러스·바이로이드를 신속 진단하기 위한 더욱 효과적인 진단 기술에 대한 개발이 필요한 실정이다.
Development of multiplex RT-PCR for apple viruses and viroid and the incidence of apple viral disease in Gyeongsangbuk-do
이에 본 발명자들은 RTase에 의한 PCR 반응의 DNA 중합효소 활성 저해 효과를 완화 또는 방지할 수 있는 방법을 개발하고 이에 더하여 RT-PCR의 증폭 효율까지를 개선시키고자 노력한 결과, 사과 및 배에 발생하는 바이러스·바이로이드의 다중 진단에 특이적 프라이머 세트를 이용한 다중적인 RT-PCR 방법이 상당한 효과가 있다는 것을 발견하고 이를 적용함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 역전사 중합효소 연쇄반응용 프라이머 세트, 조성물, 진단용 키트 및 진단방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 ACLSV(Apple chlorotic leaf spot virus) 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASPV(Apple stem pitting virus) 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASGV(Apple stem grooving virus) 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASSVd(Apple scar skin viroid) 감염 진단용 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ApMV(Apple mosaic virus) 감염 진단용 프라이머 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 ACLSV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASPV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASGV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASSVd 감염 진단용 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ApMV 감염 진단용 프라이머 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 조성물을 포함하는 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 시료에 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 ACLSV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASPV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASGV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASSVd 감염 진단용 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ApMV 감염 진단용 프라이머 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 첨가하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계; 및 (b) 역전사 중합효소 연쇄반응 산물에서 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드를 검출하는 단계;를 포함하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 Apple mosaic virus(ApMV), Apple stem grooving virus(ASGV), Apple stem pitting virus(ASPV), Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV) 및 Apple scar skin viroid(ASSVd)를 동시에 효율적으로 진단할 수 있는 프라이머 세트의 조합으로 이루어진 다중 진단용 프라이머 세트, 조성물, 진단용 키트 및 진단방법에 관한 것으로, 본 발명의 진단 조성물을 이용하여 RT-PCR 수행 시 위양성 없이 감염 시료로부터 사과 및 배의 바이러스 및 바이로이드만을 신속, 간편하게 진단할 수 있어 진단 비용 및 노력 절감 효과가 있다. 본 발명을 이용하면 과수 바이러스 및 바이로이드의 효율적인 진단으로 인해 고품질의 사과 및 배 묘목을 생산·유통하여 농업 현장에서 발생하는 문제를 해결하는데 기여할 수 있다.
도 1은 사과 바이러스 및 바이로이드 진단을 위한 프라이머 세트 선택의 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 다중 RT-PCR 검출의 한계를 평가하기 위한 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 공지된 다중 진단 방법과 본원 발명의 다중 RT-PCR 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 공지된 다중진단방법과 본원 발명의 다중 RT-PCR 방법을 이용한 비교실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 바이러스(ApMV, ASGV, ASPV, ACLSV), 바이로이드(ASSVd), 양성대조군인 내재유전자 nad5에 대한 다중 RT-PCR을 수행한 결과(도 5A) 및 본원 발명의 프라이머 세트로 실제 사과(도 5B) 및 배(도 5C) 시료의 바이러스·바이로이드 총 5종에 대한 다중 RT-PCR을 수행한 실험의 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 ACLSV(Apple chlorotic leaf spot virus) 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASPV(Apple stem pitting virus) 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASGV(Apple stem grooving virus) 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASSVd(Apple scar skin viroid) 감염 진단용 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ApMV(Apple mosaic virus) 감염 진단용 프라이머 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 용어 "다중 RT-PCR(multiplex reverse transcript-polymerase chain reaction)"은 복수의 프라이머 쌍을 동시에 사용하여, 복수의 표적 유전자를 같은 반응액 중에서 증폭하는 방법을 지칭한다. 또한 본 발명에서 설계한 프라이머 이외에 역전사 반응과 중합반응을 수행하기 위한 당업계에 공지된 DNA 중합효소, 역전사효소, dNTP 및 반응 완충액을 포함할 수 있다. 나아가 필요한 경우 DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 Apple mosaic virus(ApMV), Apple stem grooving virus(ASGV), Apple stem pitting virus(ASPV), Apple chlorotic leaf spot virus(ACLSV) 및 Apple scar skin viroid(ASSVd)를 간섭 없이 동시에 진단할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트는 하기 표 1와 같다.
[표 1]
Figure 112018078451266-pat00001
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2 +의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
또한, 본 발명에서와 같이 2이상의 프라이머 쌍을 혼합하여 동시에 RT-PCR을 수행함으로써 대상 시료 내 2이상의 유전자를 1회에 확인하는 멀티플렉스 RT-PCR 반응에서는, 프라이머 설계시 단독 RT-PCR의 경우보다 조건이 더욱 엄격한 조건이 요구되며, 또한 반응완료 후 겔 상에서 증폭되는 유전자 산물의 구별을 위해서는 유전자 산물의 크기가 각각 구별이 되어야 하는 크기의 제약까지 따른다. 반응조건의 설정에 있어서도 한번에 RT-PCR 하고자 하는 프라이머 모두에 대한 공통의 반응조건이 설정되어야 하므로, 단독 RT-PCR에 비해서 매우 어려운 조건 설정 과정이 요구된다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머들은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 ACLSV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASPV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASGV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASSVd 감염 진단용 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ApMV 감염 진단용 프라이머 세트;로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 사과 및 배에 발생하는 바이러스·바이로이드 감염 다중 진단을 위한 프라이머 세트 또는 조성물에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 nad5(NADH dehydrogenase subunit 5) 진단용 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 바람직한 일예로, 사과 및 배에 발생하는 바이러스·바이로이드 감염 진단에 있어서 위양성(false positive)을 제거하기 위하여 사과 및 배의 미토콘드리아에 존재하는 내재유전자 nad5(NADH dehydrogenase subunit 5) 유전자를 사용하였다. 증폭을 수행한 결과에서 밴드가 나타나지 않은 경우에 상기 유전자의 RNA 증폭 산물을 확인함으로써 RT-PCR이 제대로 수행되지 않은 경우나 RNA가 제대로 추출되지 않아 바이러스 및 바이로이드에 감염되어 있지 않은 것으로 판단하는 오류 즉, 위양성을 제거할 수 있다. nad5 유전자의 RNA 증폭과정은 앞서 과수 바이러스 및 바이로이드 RNA의 증폭방법과 동일한 절차를 통해 이루어진다.
본 발명의 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단을 위한 조성물을 포함하는 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있다. 상기 키트는 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다.
상기 적합한 담체로는, 이에 제한되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 시료에 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 ACLSV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASPV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASGV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASSVd 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ApMV 감염 진단용 프라이머 세트; 로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 첨가하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계; 및 (b) 역전사 중합효소 연쇄반응 산물에서 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드를 검출하는 단계;를 포함하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 역전사 중합효소 연쇄반응에서 서열번호 11로 표시되는 염기서열 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 nad5(NADH dehydrogenase subunit 5) 진단용 프라이머 세트를 더 포함하여 수행할 수 있다. 상기와 같이 nad5 진단용 프라이머 세트를 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하면, 증폭을 수행한 결과에서 밴드가 나타나지 않은 경우에 상기 유전자의 RNA 증폭 산물을 확인함으로써 RT-PCR이 제대로 수행되지 않은 경우나 RNA가 제대로 추출되지 않아 바이러스 및 바이로이드에 감염되어 있지 않은 것으로 판단하는 오류 즉, 위양성을 제거할 수 있다.
본 발명에 따른 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단 방법을 수행함에 있어, 바람직하게는 상기 (a) 단계의 프라이머 세트는 5 내지 23 pmol/㎕의 농도로 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게 서열번호 1 내지 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 사과 및 배의 바이러스 및 바이로이드 진단용 프라이머 세트를 20 pmol/㎕의 농도로 사용할 수 있으며, 서열번호 11 내지 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 내재유전자 진단용 프라이머 세트는 5 pmol/㎕ 농도로 사용할 수 있다.
또한 RT-PCR을 수행함에 있어, 상기 (a) 단계는 (a-1) 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계; (a-2) 95℃에서 10분의 변성 단계; (a-3) 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 58℃에서 30초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계를 포함하며 상기 (a-3) 단계를 35 사이클을 반복하고, 마지막으로 (a-4) 단계를 통해 72℃에서 5분 동안 최종적으로 신장(elongation)시키는 단계를 수행한다.
RT-PCR을 수행함에 있어서, 상기 (a-2) 단계에서 10분 미만의 반응시간에서는 변성이 원활하게 이루어지지 않으며, 10분이 초과하면 과도한 변성이 일어나 다음 단계의 증폭 반응을 수행하는데 부적합하게 된다. 상기 (a-3) 단계에서 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 반응 온도가 58℃ 미만이라면 충분히 원하는 서열이 증폭되지 않아 시료 내 바이러스 또는 바이로이드의 존재를 검출할 수 없게 되며, 58℃ 초과하면 과도한 증폭이 일어날 수 있다. 상기 (a-4) 단계에서 72℃에서 5분 미만의 반응시간에서는 원하는 서열의 신장이 충분히 이루어지지 않으며, 5분 초과인 경우에는 과도한 서열의 신장이 발생할 수 있다. 따라서, (a-1) 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계; (a-2) 95℃에서 10분의 변성 단계; (a-3) 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 58℃에서 30초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계;를 포함하며 상기 (a-3) 단계를 35번 반복하고, 마지막으로 (a-4) 단계를 통해 72℃에서 5분 동안 최종적으로 신장(elongation)시키는 단계는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 총 5종의 바이러스 및 바이로이드를 증폭하여 진단, 검출하기 위한 최적의 조건이다. 상기 수치 범위를 벗어나는 경우, 시료 내 바이러스 및 바이로이드의 증폭이 원활하게 이루어지지 않아 시료 내 존재하는 바이러스 및 바이로이드의 존재를 진단하는데 어려움이 있을 수 있다.
상기 다중 RT-PCR을 수행하여 시료에 존재하는 유전자를 증폭한 후 이를 아크릴아미드 겔 또는 아가로오스 겔에 전기영동하고 밴드를 확인한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 사과 및 배에 발생하는 바이러스· 바이로이드의 진단을 위한 다중 RT- PCR용 프라이머 세트의 설계
1.1 프라이머 세트 설계를 위한 감염 샘플의 수득
사과에 발생하는 바이러스 및 바이로이드를 다중 진단하기 위해, ApMV+ACLSV에 감염된 샘플은 국립원예특작과학원 사과연구소에서 수득하였고, ASGV + ASPV + ASSVd 감염된 샘플은 한국 안동에 있는 과수원에서 수득하였다. 안동에 있는 과수원에서 수집한 샘플은 2015 년 5 월 경상북도 11 개 경작지 20개 과수원에서 무작위로 200개의 사과나무 잎을 채취하여 수득하였다. 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 다중 진단하기 위해, 2017년 6월 무작위로 국립종자원 시험포장에서 100개의 배 잎을 채취하여 시료를 수득하였다. 무작위로 채취한 시료에는 모자이크, 엽상 기형 및 엽록소와 같은 바이러스 유사 증상을 나타내는 샘플도 함께 포함되었다.
1.2 수집된 사과 및 배 샘플의 총 RNA의 추출
WizPrepTM Plant RNA Mini Kit (Wizbio Solutions, Korea) 또는 자동핵산추출기(BioMerieux)을 이용하여 총 RNA를 추출하고 제조사가 제안한 방법에 따라 총 RNA 추출을 다음과 같이 수행하였다:
1. 용해 단계 : 균질화된 잎 0.1g을 1.5ml 튜브에 옮기고, RPL1 완충액 450㎕ 및 β-머캅토 에탄올 4.5㎕와 혼합하였다. 혼합물(400 ㎕)을 필터컬럼으로 옮기고 1분간 13,000 rpm로 원심분리하고 필터 컬럼을 버렸다.
2. 바인딩 단계 : 에탄올을 가하여 여과하고, RNA 스핀 컬럼을 2.0ml 수집튜브에 연결하고 혼합물을 RNA 스핀 컬럼에 가하고 30 초간 13,000rpm으로 원심분리 하였다. 스핀 컬럼의 통과액을 버리고 컬럼을 다시 연결하였다.
3. 세척 단계 : RPW1 Buffer 700㎕를 RNA 스핀 컬럼에 넣고 30초간 13,000 rpm으로 원심 분리한 후 통과액을 버렸다. RPW2 완충액 500㎕를 RNA 스핀 컬럼에 넣고 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하고 통과액을 버렸으며, 이를 2회 반복하였다. RNA 필터 컬럼을 건조하기 위해 마지막으로 2분간 13,000 rpm으로 원심 분리하였다.
용출 단계 : RNA 스핀 컬럼을 1.5ml 튜브에 연결하고 DNase/RNase가 없는 용액을 50㎕를 가한 후, 실온에서 3분간 배양하고, 1분간 13,000 rpm으로 원심 분리하였다. 추출한 총 RNA는 70℃에서 보관하였다.
1.3 종-특이적 프라이머의 설계
종-특이적 프라이머를 설계하기 위하여, 각기 다른 바이러스 균주의 다양한 서열을 수집하고 정렬하여 바이러스 및 바이로이드의 공통된 서열을 선택하였다. 바이러스 및 바이로이드가 동일하게 가지고 있는 공통된 서열을 프라이머의 후보군으로 선정하였다. 프라이머 후보군들 중 동일한 속 (genus)에 속하는 다른 바이러스들과 비교하여 가장 많은 양을 나타내는 특정한 서열을 종-특이적 프라이머로 선택하였다. 종-특이적 프라이머를 설계하기 위해, ACLSV, ASGV, ASSVd, ASPV 및 ApMV 염기 서열을 Genbank(NCBI)로부터 수집하고, 프라이머의 설계를 DNAMAN 소프트웨어 (ver.5.2.2.10) 프로그램을 사용하여 수행하였다. 상기 설계된 ACLSV를 검출하는 프라이머 세트를 표 2에 나타내었고, ASGV를 검출하는 프라이머 세트를 표 3에, ASSVd를 검출하는 프라이머 세트를 표 4에, ASPV를 검출하는 프라이머 세트를 표 5에, ApMV를 검출하는 프라이머 세트를 표 6에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112018078451266-pat00002
[표 3]
Figure 112018078451266-pat00003
[표 4]
Figure 112018078451266-pat00004
[표 5]
Figure 112018078451266-pat00005
[표 6]
Figure 112018078451266-pat00006
1.4 종-특이적 프라이머의 확인
설계된 프라이머의 특이성을 확인하기 위해, PCR 증폭물을 시퀀싱하였다. PCR 증폭 물을 AccuRapidTM PCR 정제 키트 (Bioneer Co., Korea)로 정제 하였다. RBC TA 클로닝 벡터 키트 (RBC Bioscience Co., Taiwan) 및 DNA 라이게이션 키트 Ver 2. 1. (TakaRa, Korea)로 클로닝 하였다. 플라스미드를 DNA-spinTM Plasmid DNA 정제 키트 (iNtRON Biotecnology, Korea)로 추출하고 SolGent Co., Ltd.(한국)에 의뢰하여 염기 서열을 분석하였다. BLAST 검색 결과, 이전에 보고된 바이러스 및 바이러스와 92-98%의 상동성이 확인되어, 설계된 종-특이적 프라이머가 본원 발명의 진단 바이러스 및 바이로이드를 특이적으로 증폭함을 확인하였다.
실시예 2. 동시 진단 프라이머 조합의 선택
동시 진단 프라이머의 조합 선택 및 선택된 동시 진단용 프라이머 세트가 종-특이적으로 간섭효과 없이 증폭시키는지 여부를 확인하기 위해 다중 RT-PCR을 다양한 크기의 앰플리콘을 표적으로 하는 다양한 프라이머로 수행하였다. 상기 실험은 DNase/RNase가 없는 10배 단계로 희석된 양성 대조군으로부터 총 RNA를 추출하고 검출 한계를 시험하였다. PCR 산물을 아가로스 겔에서 전기영동하고 ExpinTM Combo GP, 200p (GeneAll, Korea)로 정제하여 복제하고 서열을 확인하였다. 프라이머 쌍 사이의 간섭을 줄이는 프라이머 세트를 선택하기 위해 여러 번의 다중 RT-PCR 실험을 수행하였고, 최종적으로 다중 진단을 위한 1개의 프라이머 세트를 선택한 결과를 도 1에 나타내었고, 선택한 프라이머 세트를 표 1에 나타내었다. 도 1의 M 레인은 사이즈 마커, 1-5레인은 1가지 바이러스 및 바이로이드에 감염된 샘플을 나타내었고, 6-15레인은 2가지 바이러스 및 바이로이드에 감염된 샘플을 나타내었고, 16-25 레인은 3가지 바이러스 및 바이로이드에 감염된 샘플을 나타내었고, 26-30레인은 4가지 바이러스 및 바이로이드에 감염된 샘플을 나타내었고, 31레인은 5가지 바이러스 및 바이로이드에 감염된 샘플을 나타내었다.
[표 1]
Figure 112018078451266-pat00007
a 프라이머 위치 결정을 위한 참조 번호(National Center for Biotechnology Information)로 Apple chlorotic leaf spot virus는 KC935956, Apple stem pitting virus는 KF915809, Apple stem grooving virus는 AB004063, Apple scar skin viroid는 HG764200, Apple mosaic virus는 U15608를 참조해 결정하였다.
* 표시된 프라이머는 (Menzel et al., 2002)를 참조해 결정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 표 1에서 선택된 프라이머 세트를 사용하였을 때, 모든 앰플리콘은 각 바이러스 및 바이로이드에 대해 특이성을 갖도록 원하는 증폭산물을 수득하여, 각각의 ACLSV, ASGV, ASPV, ApMV 및 ASSVd에 대한 다중 진단 분석이 간섭효과 없이 진단 가능함을 확인하였다.
실시예 3. 다중 RT- PCR을 이용한 다중진단 방법의 수행
3.1 다중 RT-PCR 반응조건의 확립 및 전기영동 실험 수행
다중 RT-PCR은 Genetbio suprimescript RT-PCR premix SR-8000 (GeNeTBio Inc., 한국)에 의해 수행되었다. RT-PCR premix에 총 RNA 주형 2.5 ㎕와 4개의 바이러스와 1 개의 바이로이드[ApMV, ASSVd, ACLSV, ASGV, ASPV]에 대한 정방향/역방향 프라이머를 농도 20 pmol/㎕로 각각 0.75 ㎕씩, 내재유전자용 nad5 정방향/역방향 프라이머를 농도 5 pmol/㎕로 0.75 ㎕씩 넣고 DNase/RNase-free water 없이 최종 반응액 20㎕를 조성으로 하여 RT-PCR을 수행하였다.
역전사 중합효소를 조건을 하기와 같이 하여 수행하였다. 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계 후, 95℃에서 10분의 변성 단계를 수행하였다. 이후, 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 58℃에서 30초간 반응 후 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계를 35 사이클을 수행하고 최종적으로 72℃에서 5분 동안 연장시키는 단계를 수행하였다.
RT-RCR 실험을 수행 후, 1.5% 아가로즈 겔(iNtRON Biotechnology Inc., Korea)에서 150V로 60분 동안 수행하여, 증폭물을 정제 및 분리하였다.
3.2 다중 역전사 중합효소 연쇄 반응 측정법의 검출 한계
선택된 다중 진단 프라이머 조합의 바이러스 검출 한계를 평가하기 위해, 총 RNA를 양성 대조군으로부터 추출하였다. 총 RNA는 10배 단계로 희석하여(10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7), 상기 실험을 수행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 레인 M은 사이즈 마커이고, 레인 1은 감염된 샘플의 총 RNA로부터 만들어진 cDNA이며, 레인 2-8은 각각 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7로 희석된 샘플을 나타낸 것이다.
도 2에서 나타난 바와 같이, 본원 발명의 다중 RT-PCR 검출의 한계는 10-2임을 확인하였다.
비교예 . 공지된 다중 진단 방법과 본원 발명의 검출의 특이도 확인
공지된 논문(Development of multiplex RT-PCR for apple viruses and viroid and the incidence of apple viral disease in Gyeongsangbuk-do)에서 수행한 다중 RT-RCR과 본원 발명의 다중 RT-RCR을 비교하였다. 공개된 논문과 본원 발명은 PCR의 용액의 조성과 반응 조건을 달리하므로, 이에 따른 다중 RT-RCR의 검출 특이도를 비교하였으며, 상기 비교의 결과로써 사과에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 다중 RT-PCR 전기영동 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 도 4는 레인 1, 3, 5, 7은 공개된 논문의 조성 및 조건의 결과이며, 레인 2, 4, 6, 8은 본원 발명의 조성 및 조건의 결과를 나타내었다. 레인 1, 2는 ASGV 단독감염, 레인 3,4는 ACLSV 단독감염, 레인 5, 6은 ACLSV, ASPV, ASGV 3종 복합감염 및 레인 7, 8은 5종 복합감염 샘플의 실험결과를 나타내었다.
도 3에서 나타난 바와 같이, 레인 1의 공지된 논문의 조성 및 조건에서는 4종의 바이러스 및 1종의 바이로이드 중 2개만이 검출된 것을 확인하였으나, 본원 발명의 조성 및 조건을 가하면 5개의 밴드가 검출되어 모두 검출됨을 확인하였다.
또한, 도 4에서 나타난 바와 같이, 레인 1, 3, 5, 7에서는 밴드가 나타나지 않았거나 흐리게 나타난 반면, 레인 2, 4, 6, 8에서는 감염된 모든 바이러스 및 바이로이드에 관한 밴드가 나타나, 다중 RT-PCR의 간섭 없이 모든 바이러스 및 바이로이드를 진단할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본원 발명의 다중 RT-PCR의 반응 용액의 조성 및 조건으로 할 경우, 다중진단의 검출도의 특이성이 상승함을 확인하여, 5가지 바이러스 및 바이로이드를 모두 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 내재유전자를 포함한 다중 RT- PCR을 이용한 사과 및 배 바이러스· 바이로이드 검출 확인
위양성을 제거하기 위하여 내재유전자인 nad5를 포함한 선택된 멀티플렉스 실시예 3.의 RT-PCR 조건으로 사과 및 배 바이러스·바이로이드 잎에서 수득한 시료에 대한 진단을 수행하였다. 진단의 정확성과 편리성을 위해 도 5의 A에서 레인 1-6 까지는 바이러스, 바이로이드 및 내재유전자 크기별로 제작한 양성대조군을, 레인 7은 레인 1-6의 상기 양성대조군의 혼합 조성물로 진단을 수행한 결과를 나타내었다. 도 5의 B에는 실제 수득한 사과 잎 시료를 본 발명의 프라이머 세트로 진단한 결과를 나타내었으며, 도 5 C에서는 실제 수득한 배 잎 시료 14점을 본 발명의 프라이머 세트로 진단한 결과를 나타내었다.
도 5A에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트로 바이러스, 바이로이드 및 내재유전자를 모두 진단할 수 있음을 확인하였다. 도 5B에서 확인한 바와 같이, 레인 1은 바이러스·바이로이드가 없는 시료로 내재유전자인 nad5만 증폭되었고, 레인 2는 ASGV 1종 감염, 레인 3은 ACLSV 및 ASPV 2종 감염, 레인 4는 ACLSV, ASPV 및 ASGV 3종 감염, 레인 5는 ACLSV, ASPV, ASGV 및 ASSVd 4종 감염, 레인 6는 ACLSV, ASPV, ASGV, ASSVd 및 APMV으로 총 5종이 감염된 시료인 것을 확인할 수 있었다. 도 5C에서 확인한 바와 같이, 레인 1, 2, 5, 7, 9, 14에서는 내재유전자인 nad5만 증폭된 것을 확인하여 바이러스 및 바이로이드가 감염되지 않은 샘플인 것을 확인할 수 있었으며, 레인 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13은 ASGV만이 단독으로 감염된 시료임을, 레인 12는 ASPV, ASGV 복합감염 시료의 실험결과임을 확인하였다. 따라서 본원 발명의 다중 RT-PCR의 반응 용액의 조성 및 조건으로 실험을 할 경우에 위양성 없이 실제 사과 및 배 시료에서 감염된 바이러스 및 바이로이드를 5종 모두 효율적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
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  3. 삭제
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  5. (a) 시료에 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 ACLSV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASPV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASGV 감염 진단용 프라이머 세트; 서열번호 7로 표시되는 염기서열 및 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 ASSVd 감염 진단용 프라이머 세트; 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 ApMV 감염 진단용 프라이머 세트;로 구성된 프라이머 세트를 첨가하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계; 및
    (b) 역전사 중합효소 연쇄반응 산물에서 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드를 검출하는 단계;를 포함하되,
    상기 (a) 단계의 개별 프라이머 세트의 농도는, 17 내지 23 pmol/㎕이며,
    상기 (a) 단계의 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은, (a-1) 50℃에서 30분 동안 역전사하는 단계; (a-2) 95℃에서 10분의 변성 단계; (a-3) 95℃에서 30초간 반응시킨 다음 58℃에서 30초간 반응 후, 72℃에서 1분간 증폭시키는 단계; (a-4) 단계를 통해 72℃에서 5분 동안 최종적으로 신장(elongation)시키는 단계로 수행되는 것인, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 개별 프라이머 세트의 농도는 20 pmol/㎕인 것을 특징으로 하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단 방법.
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서, 상기 (a-3) 단계는 35 사이클을 수행하는 것인, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 역전사 중합효소 연쇄반응은 서열번호 11로 표시되는 염기서열 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함하는 nad5(NADH dehydrogenase subunit 5) 진단용 프라이머 세트를 더 포함하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 사과 및 배에 발생하는 바이러스 및 바이로이드 감염 다중 진단 방법.
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