JP3459976B2

JP3459976B2 - リンゴクロロティックリーフスポットウイルスの検出方法及び検出用プライマー

Info

Publication number: JP3459976B2
Application number: JP2000081878A
Authority: JP
Inventors: 幸二吉田; 健二中原; 伝伊藤; 浩一須崎
Original assignee: National Agricultural Research Organization
Current assignee: National Agricultural Research Organization
Priority date: 2000-03-23
Filing date: 2000-03-23
Publication date: 2003-10-27
Anticipated expiration: 2020-03-23
Also published as: JP2001258571A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物ウイルスの検出方
法に関し、より詳細には、リンゴクロロティックリーフ
スポットウイルス（apple chlorotic leaf spot viru
s、以下「ACLSV」という。）の複数の分離株を同時に検
出する方法、及び該方法に用いることのできるオリゴヌ
クレオチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】ACLSVは、リンゴ高接病を引き起こす３
種類の病原ウイルスの一つで、リンゴ台木であるマルバ
カイドウを衰弱させる。世界にも広く分布し、リンゴの
他にモモ、スモモ、オウトウ、アンズを犯す重要病害で
ある。

【０００３】ACLSVは、約2.5×10³kDaの一本鎖ＲＮＡと
22kDaの外皮タンパク質からなるウイルスである。従っ
て、被検植物がACLSVに感染しているかどうかの診断
は、指標植物への接ぎ木による生物検定法、外皮タンパ
ク質に対する抗体を用いた免疫検定法、例えば固相酵素
免疫検定法（enzyme-linked immunosorbent assay、以
下「ELISA」という。）、ウイルスゲノムに対する相補
的なＤＮＡ又はＲＮＡをプローブとして用いるハイブリ
ダイゼーション法などにより行われていた。

【０００４】しかし、生物検定法は感度が高いものの、
数ヶ月から数年の検定期間を要し、さらにACLSV潜在系
統では病徴が弱いか又は病徴を示さない場合があるた
め、判定が困難である。また、ELISAやハイブリダイゼ
ーションでは、指標植物においてはACLSVを検出できる
ものの、ウイルス濃度が低いリンゴ樹から直接検出する
には感度が充分でなく、検出できるのは花弁と同時期に
採取された若葉だけである（菅野善明・吉川信幸・高橋
荘、日本植物病理学会報、第57巻、第278頁）。

【０００５】最近、遺伝子の特定の配列を指数関数的に
増幅する方法が開発された。一つは、特定のＤＮＡ断片
を指数関数的に増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法である（Saiki, R.K.ら、Science 239, 487-491
(1988)）。もう一つは、特定のＲＮＡ断片を指数関数的
に増幅する方法で、Nucleic Acid Sequence-Based Ampl
ification (NASBA)法である（Davey and Malek, 1989,
European Patent No. EP0329822）。これらの方法はウ
イルス診断にも応用されている。すなわち、ウイルスゲ
ノムの一部の配列を指数関数的に増幅した後に、得られ
る増幅断片をゲル電気泳動やハイブリダイゼーションで
検出することにより、非常に高感度にウイルスを検出す
ることができる。さらに、より高感度にウイルス等を検
出する方法として、ネスティドＰＣＲやネスティドNASB
A（Kievits, T.ら、J. Virol. Methods 35, 273-286 (1
991)）が開発されている。

【０００６】ACLSVには、マルバカイドウに対して病原
性の違う分離株（潜在系から強毒系）がある。一方、リ
ンゴ、スモモ及びオウトウが保毒するACLSVのゲノムの
全塩基配列がそれぞれ決定されており（German, S.ら、
Virology, Vol. 179, 104-112 (1990), Sato, K.ら、J.
Gen. Virol., Vol. 74, 1927-1931 (1993), German,S.
ら、Arch. Virol., Vol. 142, 833-841 (1997)）、それ
らの間で塩基配列を比較すると、多くの領域で配列の違
いが認められる（相同性：76〜82％）。従って、リンゴ
樹の保毒する病原性の違うACLSV分離株間で、ゲノムの
塩基配列に違いがある可能性が考えられる。さらに、リ
ンゴ樹が保毒する各ACLSV分離株は複数の塩基配列を含
むヘテロな集団であることが判明している（中原ら、日
本植物病理学会報、第64巻605頁 (1998)）。従って、上
述の遺伝子増幅法をACLSVの検出に応用する場合、あるA
CLSVゲノムに対して設計した一種類のプライマーでは、
全てのACLSV分離株のゲノム配列を増幅することはでき
ないと考えられる。リンゴ樹が保毒するACLSVの検出方
法として遺伝子増幅法を用いた方法は非常に有望である
が、上述のように、従来の方法は、ACLSV分離株全てを
診断するには適していない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、複数
のACLSV分離株を同時に被検植物から直接検出できる高
感度診断法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、病原性の異な
る複数のACLSV分離株のゲノムＲＮＡに基づいて設計し
た複数組のプライマーを用いる遺伝子増幅法により、該
複数のACLSV分離株の全てをリンゴ樹から直接検出でき
ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、（i）被検植物の組
織から抽出したＲＮＡを鋳型として使用し、リンゴクロ
ロティックリーフスポットウイルスの複数の分離株のゲ
ノムＲＮＡの第１の部分領域を増幅し得る第１の相同プ
ライマー及び第１の相補プライマーを用いる核酸増幅を
行って第１の増幅産物を取得し；次いで（ii）前記第１
の増幅産物を鋳型として使用し、リンゴクロロティック
リーフスポットウイルスの前記複数の分離株のゲノムＲ
ＮＡの前記第１の部分領域に含まれる第２の部分領域を
増幅し得る第２の相同プライマー及び第２の相補プライ
マーを用いる核酸増幅を行って第２の増幅産物を取得す
る；ことにより、前記被検植物からリンゴクロロティッ
クリーフスポットウイルスを検出する方法を提供する。

【００１０】ここで、リンゴクロロティックリーフスポ
ットウイルスの前記複数の分離株は、P205株、P195株、
P195L株、PK32株、PK51株、P142株、P143株、P202株、P
K5株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO41株
及びB81株であることが好ましい。

【００１１】前記第１の相同プライマーは配列番号１、
２又は３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドであり、かつ前記第２の相同プライマーは、（i）前
記第１の相同プライマーが配列番号１で表わされる塩基
配列を含むオリゴヌクレオチドである場合には、配列番
号２、３若しくは４で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチド；（ii）前記第１の相同プライマーが配列
番号２で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
である場合には、配列番号３若しくは４で表わされる塩
基配列を含むオリゴヌクレオチド；又は（iii）前記第
１の相同プライマーが配列番号３で表わされる塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドである場合には、配列番号４
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；であ
ることが好ましい。

【００１２】また、前記第１の相補プライマーは配列番
号６、７又は８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドであり、かつ前記第２の相補プライマーは、
（iv）前記第１の相補プライマーが配列番号６で表わさ
れる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合に
は、配列番号５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌク
レオチド；（v）前記第１の相補プライマーが配列番号
７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであ
る場合には、配列番号５若しくは６で表わされる塩基配
列を含むオリゴヌクレオチド；又は（vi）前記第１の相
補プライマーが配列番号８で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドである場合には、配列番号５、６若
しくは７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド；であることが好ましい。

【００１３】より好ましくは、前記第１の相同プライマ
ーは配列番号３で表わされる塩基配列を含むオリゴヌク
レオチドであり、前記第２の相同プライマーは配列番号
４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであ
り、前記第１の相補プライマーは配列番号６で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、かつ前記
第２の相補プライマーは配列番号５で表わされる塩基配
列を含むオリゴヌクレオチドである。前記被検植物は、
リンゴ、モモ、スモモ、オウトウ又はアンズであること
が好ましい。また、前記組織は、花弁、葉又は樹皮であ
ることが好ましい。

【００１４】さらに、本発明は、（i）リンゴクロロテ
ィックリーフスポットウイルスの複数の分離株のゲノム
ＲＮＡの第１の部分領域を増幅し得る相同プライマー及
び相補プライマー；並びに（ii）リンゴクロロティック
リーフスポットウイルスの前記複数の分離株のゲノムＲ
ＮＡの前記第１の部分領域に含まれる第２の部分領域を
増幅し得る相同プライマー及び相補プライマー；を含
む、被検植物からリンゴクロロティックリーフスポット
ウイルスを検出するためのプライマーセットを提供す
る。

【００１５】ここで、リンゴクロロティックリーフスポ
ットウイルスの前記複数の分離株は、P205株、P195株、
P195L株、PK32株、PK51株、P142株、P143株、P202株、P
K5株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO41株
及びB81株であることが好ましい。

【００１６】また、上記プライマーセットは、好ましく
は、配列番号１〜４で表わされる塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドからなる群より選択される２種類の相同プ
ライマー、及び配列番号５〜８で表わされる塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドからなる群より選択される２種
類の相補プライマーを含み、より好ましくは、配列番号
３〜６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
を含む。

【００１７】さらに、本発明は、（i）被検植物の組織
から抽出したＲＮＡを鋳型として使用し、リンゴクロロ
ティックリーフスポットウイルスの複数の分離株のゲノ
ムＲＮＡの第１及び第２の部分領域を増幅し得る第１及
び第２の相同プライマー並びに第１及び第２の相補プラ
イマーを用いる核酸増幅を行って第１の増幅産物を取得
し；次いで（ii）第１の増幅産物を鋳型として使用し、
リンゴクロロティックリーフスポットウイルスの前記複
数の分離株のゲノムＲＮＡの第３及び第４の部分領域を
増幅し得る第３及び第４の相同プライマー並びに第３及
び第４の相補プライマーを用いる核酸増幅を行って第２
の増幅産物を取得する；ことにより、前記被検植物から
リンゴクロロティックリーフスポットウイルスを検出す
る方法を提供する。

【００１８】ここで、前記第１〜４の部分領域の相互の
位置関係については、第１の部分領域及び第２の部分領
域が、それぞれ第３の部分領域及び第４の部分領域を内
包することが必要であり、好ましくは、第４の部分領域
が第２の部分領域に内包され、第２の部分領域が第３の
部分領域に内包され、第３の部分領域が第１の部分領域
に内包されるようにする。

【００１９】ここで、リンゴクロロティックリーフスポ
ットウイルスの前記複数の分離株は、P205株、P195株、
P195L株、PK32株、PK51株、P142株、P143株、P202株、P
K5株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO41株
及びB81株であることが好ましい。

【００２０】前記第１の相同プライマーは配列番号１で
表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、
前記第２の相同プライマーは配列番号３で表わされる塩
基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第３の相
同プライマーは配列番号２で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドであり、前記第４の相同プライマー
は配列番号４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドであり、前記第１の相補プライマーは配列番号８
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであ
り、前記第２の相補プライマーは配列番号６で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第３
の相補プライマーは配列番号７で表わされる塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドであり、かつ前記第４の相補プ
ライマーは配列番号５で表わされる塩基配列を含むオリ
ゴヌクレオチドであることが好ましい。

【００２１】前記被検植物は、リンゴ、モモ、スモモ、
オウトウ又はアンズであることが好ましい。また、前記
組織は、花弁、葉又は樹皮であることが好ましい。さら
に、本発明は、（i）リンゴクロロティックリーフスポ
ットウイルスの複数の分離株のゲノムＲＮＡの第１の部
分領域を増幅し得る相同プライマー及び相補プライマ
ー；（ii）リンゴクロロティックリーフスポットウイル
スの複数の分離株のゲノムＲＮＡの第２の部分領域を増
幅し得る相同プライマー及び相補プライマー；（iii）
リンゴクロロティックリーフスポットウイルスの複数の
分離株のゲノムＲＮＡの第３の部分領域を増幅し得る相
同プライマー及び相補プライマー；並びに（iv）リンゴ
クロロティックリーフスポットウイルスの前記複数の分
離株のゲノムＲＮＡの第４の部分領域を増幅し得る相同
プライマー及び相補プライマー；を含む、被検植物から
リンゴクロロティックリーフスポットウイルスを検出す
るためのプライマーセットを提供する。

【００２２】ここで、前記第１〜４の部分領域の相互の
位置関係については、第１の部分領域及び第２の部分領
域が、それぞれ第３の部分領域及び第４の部分領域を内
包することが必要であり、好ましくは、第４の部分領域
が第２の部分領域に内包され、第２の部分領域が第３の
部分領域に内包され、第３の部分領域が第１の部分領域
に内包されるようにする。

【００２３】ここで、リンゴクロロティックリーフスポ
ットウイルスの前記複数の分離株は、P205株、P195株、
P195L株、PK32株、PK51株、P142株、P143株、P202株、P
K5株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO41株
及びB81株であることが好ましい。また、上記プライマ
ーセットは、配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含
むオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。

【００２４】

【発明の実施の形態】１．本発明のウイルス検出方法本発明のウイルス検出方法は、被検植物からのＲＮＡの
抽出、ACLSV検出用合成オリゴヌクレオチドプライマー
を用いる遺伝子増幅反応及び該増幅反応により得られる
増幅産物の検出を含む。以下、これらの各工程を詳細に
説明する。

【００２５】（１）被検植物組織からのＲＮＡの抽出本発明のウイルス検出方法では、リンゴ樹その他の被検
植物組織から全ＲＮＡを抽出し、これを増幅のための鋳
型として用いる。また、ACLSVのゲノムＲＮＡは宿主植
物のｍＲＮＡと同様に3'末端にアデニンの連続配列（ポ
リＡ）が付加されているため、被検植物組織からｍＲＮ
Ａを抽出して鋳型に用いることもできる。さらに、ウイ
ルス粒子を分離後、ウイルスゲノムＲＮＡを抽出して鋳
型に用いることもできる。

【００２６】上記被検植物は、ACLSVのいずれかの分離
株が感染し得る植物であればよく、特に限定されない
が、好ましくはリンゴ、モモ、スモモ、オウトウ又はア
ンズ、より好ましくはリンゴである。また、上記組織
は、ACLSVのいずれかの分離株が感染し得る組織であれ
ばよく、特に限定されないが、好ましくは花弁、葉又は
樹皮である。

【００２７】被検植物組織からの全ＲＮＡの抽出は、例
えば、該組織を液体窒素で凍結後、その細胞組織を磨砕
し、グアニジウムチオシアネートやフェノール・クロロ
フォルム溶液等で全ＲＮＡを抽出した後にエタノール沈
殿等することにより行うことができる。被検植物組織か
らのｍＲＮＡは、前記全ＲＮＡ又は組織の磨砕液からオ
リゴdTセルロース等により精製することができる。具体
的な操作方法は、Molecular Cloning（Maniatisら、A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, 1982）等に記載されている。このような全ＲＮＡ
又はｍＲＮＡの抽出・精製は、市販のＲＮＡ抽出キット
を用いて行うこともできる。被検植物組織からのウイル
スゲノムＲＮＡの抽出は、ウイルス粒子に対する抗体に
より組織磨砕液から簡便に分離して行うイムノキャプチ
ャー法（Jansenら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 87, 28
67-2871(1990)）等、公知の方法をACLSVに適用して行う
ことができる。

【００２８】（２）ACLSV検出用合成オリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いる遺伝子増幅反応本発明のウイルス検出方法では、上記（１）で得られる
ＲＮＡ試料を鋳型として用い、ACLSV検出用合成オリゴ
ヌクレオチドプライマーを用いる遺伝子増幅反応を行
う。

【００２９】遺伝子増幅反応としては、ネスティドＰＣ
Ｒ法、ネスティドNASBA法等のネスティド（nested）様
式の増幅反応を用いる。特に、デュアルネスティドＰＣ
Ｒ法、デュアルネスティドNASBA法等は有用である。こ
れらの詳細については後述するが、通常のネスティドＰ
ＣＲ法又はネスティドNASBA法を用いる場合には少なく
とも２種の相同プライマー及び少なくとも２種の相補プ
ライマーが必要となり、デュアルネスティドＰＣＲ法又
はデュアルネスティドNASBA法を用いる場合には少なく
とも４種の相同プライマー及び少なくとも４種の相補プ
ライマーが必要となる。

【００３０】本発明のウイルス検出方法において使用す
るプライマーは、ACLSVの複数の分離株のゲノムＲＮＡ
の部分領域を増幅し得るものであり、これは、該複数の
分離株のゲノムＲＮＡの間で保存性の高い領域（保存領
域）に基づいて設計することができる。ここで、上記複
数の分離株は本発明のウイルス検出方法によって同時に
検出しようとする分離株である。ただし、検出対象とな
る分離株はプライマーの設計に用いたものに限定される
ものではなく、設計されたプライマーにより検出し得る
分離株、すなわち、上記保存領域を有する分離株であれ
ばいずれも検出対象とすることができる。このようなAC
LSV分離株は当業者に公知のものであってよく、特に限
定されないが、例えば、P205株、P195株、P195L株、PK3
2株、PK51株、P142株、P143株、P202株、PK5株、P125
株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO41株、B81株等が
挙げられる。ここに挙げた１６種の分離株は、農林水産
省果樹試験場リンゴ支場病害研究室（岩手県盛岡市下厨
川字鍋屋敷92）で保存されている、マルバカイドウに対
する病原性の異なるACLSV分離株である。

【００３１】上記保存領域は、上記複数の分離株のゲノ
ムＲＮＡ又はそのｃＤＮＡの塩基配列を比較することに
より特定することができる。このような塩基配列は、当
業者に公知のヌクレオチド配列データベース、例えばGe
nBank等を検索することにより容易に入手することがで
き、また、新たに配列決定したものを用いることもでき
る。例えば、上記複数の分離株として、P205株、P195
株、P195L株、PK32株、PK51株、P142株、P143株、P202
株、PK5株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO
41株及びB81株を用いる場合には、これらのゲノムにお
ける3'末端部分のｃＤＮＡ塩基配列である配列番号１１
〜４２で表わされる塩基配列（これらのｃＤＮＡ配列中
に未決定の領域が存在するため、それぞれ前半と後半に
分けて示す。）；配列番号１１（P205株前半）及び配列
番号１２（P205株後半）：配列番号１３（P195株前半）
及び配列番号１４（P195株後半）：配列番号１５（P195
L株前半）及び配列番号１６（P195L株後半）：配列番号
１７（PK32株前半）及び配列番号１８（PK32株後半）：
配列番号１９（PK51株前半）及び配列番号２０（PK51株
後半）：配列番号２１（P142株前半）及び配列番号２２
（P142株後半）：配列番号２３（P143株前半）及び配列
番号２４（P143株後半）：配列番号２５（MK8株前半）
及び配列番号２６（MK8株後半）：配列番号２７（B81株
前半）及び配列番号２８（B81株後半）：配列番号２９
（P202株前半）及び配列番号３０（P202株後半）：配列
番号３１（PK5株前半）及び配列番号３２（PK5株後
半）：配列番号３３（PI25株前半）及び配列番号３４
（PI25株後半）：配列番号３５（MK1株前半）及び配列
番号３６（MK1株後半）：配列番号３７（MO31株前半）
及び配列番号３８（MO31株後半）：配列番号３９（MO41
株前半）及び配列番号４０（MO41株後半）：配列番号４
１（MK9株前半）及び配列番号４２（MK9株後半）；を用
いることができる。このうち、P205株のｃＤＮＡ塩基配
列についてはGenBankに登録されている（登録番号：D14
996）。

【００３２】また、配列未知の分離株のゲノム由来のｃ
ＤＮＡ塩基配列は、上記配列番号１１〜４２を決定した
方法と同様の方法を用いて決定することができる。すな
わち、まず、既にゲノムＲＮＡの全塩基配列が決定され
ているリンゴ、スモモ及びオウトウから分離された3つ
のACLSV分離株において相同な配列を示す部分に基づ
き、合成オリゴヌクレオチドプライマーをいくつか設計
する。次いで、ACLSVの濃度が比較的高い花弁若しくは
同時期の若葉をそれぞれの分離株を保毒するリンゴ樹か
ら採取して全ＲＮＡを抽出する。この全ＲＮＡを鋳型と
し、上記の合成オリゴヌクレオチドプライマーにより逆
転写及びＰＣＲを行って、良好に増幅された増幅産物を
配列決定の対象とする。

【００３３】例えば、ゲノムにおける3'末端部分のｃＤ
ＮＡ塩基配列を決定するためには、相同プライマー：5'
-GAAGATCGCAGAAGGGGATATTC-3'（配列番号９）、及び相
補プライマー：5'-GTCTACAGGCTATTTATTATAAG-3'（配列
番号１０）の組み合わせをプライマーとして用いること
ができ、これにより、その分離株のゲノムにおける3'末
端部分約1800塩基のｃＤＮＡを増幅することができる。

【００３４】こうして得られるｃＤＮＡ断片の塩基配列
は、はじめに増幅に用いた上記のプライマーで、このｃ
ＤＮＡ断片を鋳型にシークエンス反応を行うことにより
決定することができ、さらに決定した配列を基づいて新
たなプライマーを合成し、同様に塩基配列を決定するこ
とができる。これを繰り返してｃＤＮＡ断片の塩基配列
のほぼ全てを決定することができる。

【００３５】上記保存領域は、以上のようにして得られ
る塩基配列のアライメントを取ることにより特定するこ
とができる。複数の配列のアライメントを取るには、当
業者に公知の方法を用いることができるが、例えば、市
販のソフトウエアを用いることもできる。このようなア
ライメント（配列比較）に基づいてプライマー設計の基
礎となる保存領域を特定するには、特定される保存領域
の塩基配列全てが完全に相同である必要はないが、プラ
イマーを設計したときに3'末端となる部分の近辺では保
存性が特に高くなるようにする。これは、プライマーと
標的ACLSVゲノムとの相補性は非常に重要で、特に、プ
ライマーの塩基配列の3'末端付近が標的と相補的に結合
しない場合には、増幅効率が著しく低下してしまうから
である。それぞれのプライマーの塩基数は、通常プライ
マーとして用いられる塩基数であればよく、特に限定さ
れないが、好ましくは１６塩基以上、より好ましくは２
０塩基以上とする。設計されるプライマーによって増幅
される断片の塩基数は、通常のＤＮＡ断片分離法、例え
ば電気泳動法によって分離可能な塩基数であればよく、
特に限定されないが、好ましくは１００塩基〜２０００
塩基、より好ましくは１５０塩基〜１０００塩基とす
る。

【００３６】例として、検出対象となる分離株をP205
株、P195株、P195L株、PK32株、PK51株、P142株、P143
株、P202株、PK5株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO
31株、MO41株及びB81株とした場合の、これらの配列の
アライメントを示す図を図１〜５に示す。これらの配列
比較図に基づいて保存領域を特定し、全分離株のｃＤＮ
Ａが増幅されるように複数の塩基配列からなるオリゴヌ
クレオチドを設計することができる。設計されるオリゴ
ヌクレオチドの具体的な塩基配列は特に限定されない
が、例えば、配列番号１〜４で表わされる塩基配列（相
同プライマー）及び配列番号５〜８で表わされる塩基配
列（相補プライマー）を挙げることができ、これらの設
計の基となる保存領域を図１〜５の比較配列の上部（示
された番号は配列番号に対応する。）に示す。ここで、
配列番号１〜４はそれぞれACLSVゲノム上の5'上流域か
ら下流域に順に設計された相同プライマーである。ま
た、配列番号５〜８は同様にそれぞれ5'上流域から下流
域に設計された相補プライマーである。

【００３７】以上のようにして設計される相同プライマ
ー及び相補プライマーを常法に従って合成し、これを用
いて遺伝子増幅法を行う。この際に鋳型として用いるの
は、上記（１）で得られるＲＮＡ試料である。

【００３８】遺伝子増幅法としては、上述のように、ネ
スティド様式の遺伝子増幅法として知られるいかなる方
法をも用いることができるため、特に限定されないが、
好ましくはネスティドＰＣＲ法を用いる。このような方
法は、通常の遺伝子増幅法よりも検出感度が高いという
利点を有するものである。以下、ネスティドＰＣＲを用
いた方法を詳述する。

【００３９】ＰＣＲによりACLSVゲノムＲＮＡの塩基配
列を増幅する場合、ＰＣＲの前に逆転写酵素によるｃＤ
ＮＡ合成を行う必要がある。逆転写酵素としては、当業
者に公知のものを用いることができ、特に限定されない
が、通常はレトロウイルス等の逆転写酵素、例えば、市
販のAMV逆転写酵素XL（Life Sciences社）を利用するこ
とができる。逆転写反応に用いるプライマーとしては、
第1鎖ｃＤＮＡ合成に用いられることが知られているプ
ライマー、例えば、ランダムプライマー等を用いること
ができるが、後に行うＰＣＲによって増幅しようとする
配列に特異的なプライマーを用いることもできる。この
ような特異的プライマーとしては、上述のようにして設
計される相補プライマー、好ましくは配列番号５〜８で
表わされる塩基配列を有するプライマーを使うことが可
能である。ただし、後に行う２回目のＰＣＲで使用する
相補プライマーよりも、ACLSVゲノムにおいて5'側上流
域に設計したプライマーは使えない。上記のようなｃＤ
ＮＡ合成は、通常のＲＴ−ＰＣＲにおける第１鎖ｃＤＮ
Ａ合成に用いられる方法により、当業者であれば容易に
行うことができる。逆転写とＰＣＲを同一の反応液で行
うことのできるキット、例えばRNA PCRキット（Gene Am
p EZ rTth RNA PCR kit、パーキンエルマー社）を使う
ことにより操作を簡素化できる。

【００４０】次に、逆転写により合成したｃＤＮＡを鋳
型にしてネスティドＰＣＲを行う。ＰＣＲ法は、鋳型
（ここでは上記ｃＤＮＡ）への相同プライマーのアニー
リング、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応によ
りセンス鎖のＤＮＡを合成し、その後は、反応液の温度
を変化させることにより、熱変性、センス鎖及びアンチ
センス鎖ＤＮＡに対する相補プライマー及び相同プライ
マーのアニーリング、並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
による伸長をこの順番で行うサイクル反応を30〜50回程
度繰り返し、結果として標的配列の２本鎖ＤＮＡを指数
関数的に(10^5-8倍程度)増幅する方法である。詳しい原
理については、例えばMolecular Cloning（Maniatis
ら、A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1982）に記載されている。ＰＣＲでは、標
的遺伝子配列を増幅するためにその両末端部分の20〜30
塩基の配列を持つ合成オリゴヌクレオチドのプライマー
組を用いる。ネスティドＰＣＲは標的遺伝子配列を増幅
するために2回の連続したＰＣＲを行う。その際、２回
目のＰＣＲは、１回目のＰＣＲ産物を鋳型にして、１回
目のＰＣＲに用いた相同プライマーより3'側下流域に設
計した相同プライマーと、１回目の相補プライマーより
5'側上流域に設計した相補プライマーによって、より短
い配列を増幅する。こうすることにより、１回目に非特
異的に増幅された配列は２回目には増幅されず、増幅さ
れる配列の特異性が向上して、結果として検出感度が向
上する。

【００４１】本発明においては、ACLSV検出のために、
上述のようにして設計した相同プライマー及び相補プラ
イマーを用いてネスティドＰＣＲを行う。該相同プライ
マーとしては、好ましくは配列番号１〜４で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる。該相補プ
ライマーとしては、好ましくは配列番号５〜８で表わさ
れる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる。配列
番号１〜４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チドは、それぞれ上記したようにACLSVゲノム上の5'上
流域から下流域に向けて順に設計された相同プライマー
である。また、配列番号５〜８で表わされる塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドは、それぞれ5'上流域から下流
域に向けて順に設計された相補プライマーである。従っ
て、例えば、配列番号１〜４から２つを選び、配列番号
の小さい方を１回目、残りを２回目のＰＣＲに相同プラ
イマーとして用いる。同様に、配列番号５〜８から２つ
を選び、配列番号の大きい方を１回目、残りを２回目の
ＰＣＲに用いればよい。

【００４２】上記の鋳型及びプライマーを用いるネステ
ィドＰＣＲは、公知の方法により、当業者であれば容易
に行うことができるが、市販のキットを用いて行うこと
もできる。例えば、上記の逆転写反応及び１回目のＰＣ
ＲをRNA PCRキット（Gene Amp EZ rTth RNA PCR kit、
パーキンエルマー社）を用いて行い、２回目のＰＣＲを
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq、宝酒造
製）を用いて行うことができる。

【００４３】本発明のウイルス検出法において用いる遺
伝子増幅法は、上記のような通常のネスティドＰＣＲで
あってもよいが、本発明者らが開発したデュアルネステ
ィドＰＣＲを用いることもできる。

【００４４】一般に、ＰＣＲの増幅効率は理論値よりも
低い。それはいくつかの要因による制限があるからであ
り、その要因の１つは使用するプライマーである。すな
わち、ＰＣＲの増幅効率は、２つのプライマーのうち、
標的と正確にアニールする効率の低い方により制限され
ることになる。そこで、本発明者らは、ネスティドＰＣ
Ｒの各ＰＣＲ反応において２組のプライマーペア（計４
つのプライマー）を加えて行うことにより、制限要因と
なっているプライマー側からのＤＮＡ合成を別のプライ
マーからのＤＮＡ合成により補うことができ、これによ
り増幅効率が向上することを見出した。この方法が上述
のデュアルネスティドＰＣＲである。

【００４５】本発明のウイルス検出法においてデュアル
ネスティドＰＣＲを利用するには、上述のネスティドＰ
ＣＲにおいて、１回目のＰＣＲ及び２回目のＰＣＲにそ
れぞれ２組ずつのプライマーペアを用いる。この場合に
は、１回目のＰＣＲに用いる２組のプライマーペアによ
り増幅されるべき第１の部分領域及び第２の部分領域
が、それぞれ２回目のＰＣＲに用いる２組のプライマー
ペアにより増幅されるべき第３の部分領域及び第４の部
分領域を内包することが必要であり、好ましくは、第４
の部分領域が第２の部分領域に内包され、第２の部分領
域が第３の部分領域に内包され、第３の部分領域が第１
の部分領域に内包されるようにする。

【００４６】例えば、上記デュアルネスティドＰＣＲに
おいて配列番号１〜８で表わされる塩基配列を含むオリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合には、１
回目のＰＣＲを配列番号１、３、６及び８の４つのプラ
イマーを用いて行い、２回目のＰＣＲを配列番号２、
４、５及び７の４つのプライマーを用いて行うことがで
きる。これにより、通常のネスティドＰＣＲに比べて増
幅効率の安定的な向上が見られる。上記の場合におい
て、１回目のＰＣＲで配列番号１、２、７及び８のプラ
イマー、２回目のＰＣＲで配列番号３、４、５及び６の
プライマーを用いてもよいように考えられるが、このよ
うに行った場合、逆に増幅効率の低下が見られる。この
理由はわからないがＤＮＡポリメラーゼの5'-3'エクソ
ヌクレアーゼ活性が原因になっている可能性があると思
われる。

【００４７】さらに、本発明のウイルス検出法が検出対
象とするACLSVはＲＮＡゲノムを有するウイルスである
ため、上記のＰＣＲに代えて、NASBA法（Nucleic Acid
Sequence Based Amplification, Davey and Malek, 198
9, European Patent No. EP0329822）を用いることがで
きる。NASBA法は、ＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補
的なＲＮＡ（アンチセンス鎖）を増幅するＲＮＡ特異的
増幅法であり、その原理は、例えば、以下のようなもの
である。なお、ここで用いる相補プライマーは、その5'
末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列が付加
されている。

【００４８】（ａ）相補プライマーを標的ＲＮＡ（セン
ス鎖）にアニールする。（ｂ）AMV-RT（逆転写酵素）を用いる伸長反応により、
第１鎖ｃＤＮＡが合成される。（ｃ）上記（ｂ）により得られる標的ＲＮＡ／第１鎖ｃ
ＤＮＡハイブリッドの標的ＲＮＡはRNaseHにより分解さ
れ、第１鎖ｃＤＮＡ（アンチセンス鎖）は１本鎖とな
る。このとき、１本鎖のＲＮＡは、RNaseHの基質とはな
らないので、分解されない。

【００４９】（ｄ）上記（ｃ）により得られる１本鎖ｃ
ＤＮＡに相同プライマーがアニールする。（ｅ）１本鎖ｃＤＮＡにアニールした相同プライマーは
AMV-RTのＤＮＡポリメラーゼ活性によって伸長され、こ
れにより、次のＲＮＡ増幅の鋳型とＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼのプロモータが２本鎖ＤＮＡとなる。（ｆ）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがこのプロモータ配列を
認識し、相同プライマーの5'末端までの、標的ＲＮＡの
アンチセンス鎖ＲＮＡのコピーを多数合成する。

【００５０】（ｇ）新たに合成されたアンチセンスＲＮ
Ａに相同プライマーがアニールし、AMV-RTによって第１
鎖ｃＤＮＡ（センス鎖）が合成される。これにより生ず
るＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡがRNaseHによ
り分解され、前記第１鎖ｃＤＮＡが１本鎖となる。この
１本鎖ｃＤＮＡの3'末端に相補プライマーがアニール
し、該相補プライマーはAMV-RTにより伸長され、次のＲ
ＮＡ増幅の鋳型とＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ
が２本鎖ＤＮＡとなり、多数のＲＮＡ（アンチセンス
鎖）のコピーの生産が誘導される。このようなステップ
が一定温度で連続的に起こることにより、標的ＲＮＡの
アンチセンス鎖が指数関数的に増幅される。

【００５１】上記NASBA法は、上記文献及び上記の原理
の説明を参照することにより、当業者であれば容易に実
施することができる。また、上記NASBA法は、NASBA Amp
lification Kit（ORGANON TEKNIKA）等の市販のキット
を用いることにより、簡便に行うことができる。本発明
のウイルス検出法において上記NASBAを用いる場合に
は、ＰＣＲの場合と同様に、ネスティドNASBA法（Kievi
ts, T.ら、J. Virol. Methods 35, 273-286 (1991)）又
はデュアルネスティドNASBA法を用いる。

【００５２】通常のネスティドNASBA法を行う場合に
は、２回のNASBAを行う。１回目のNASBAは、上記（１）
で得られるＲＮＡ試料を鋳型とし、上記ネスティドＰＣ
Ｒにおける１回目のＰＣＲの場合と同様の相同プライマ
ー及び相補プライマーを用いて行う。これにより、標的
ＲＮＡの相補鎖に相当するＲＮＡが増幅産物として得ら
れる。次いで、該増幅産物を鋳型とし、上記ネスティド
ＰＣＲにおける２回目のＰＣＲの場合と同様の相同プラ
イマー及び相補プライマーを用いて、２回目のNASBAを
行う。ここで、２回目のNASBAにおける鋳型との関係で
は、２回目のＰＣＲにおいて相同プライマーとして用い
たものが相補プライマーとして使用され、逆に相補プラ
イマーとして用いられたものが相同プライマーとして使
用される点に注意すべきである。なお、ここで用いる相
補プライマー（これは、２回目のNASBAにおいては、鋳
型（アンチセンス鎖）との関係では相補プライマーであ
り、ACLSVのゲノムＲＮＡ（センス鎖）との関係では相
同プライマーである）はいずれも、その5'末端にＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモータ配列が付加されている。

【００５３】デュアルネスティドNASBA法を行う場合に
は、１回目及び２回目の各NASBAにおいて、それぞれ２
本ずつの相同プライマー及び相補プライマーを用いる点
を除き、上記通常のネスティドNASBA法と同様に行うこ
とができる。使用する相同プライマー及び相補プライマ
ーとしては、上記デュアルネスティドＰＣＲについて記
載したものを同様に用いることができる。ここで、２回
目のNASBAにおける鋳型との関係では、２回目のＰＣＲ
において相同プライマーとして用いたものが相補プライ
マーとして使用され、逆に相補プライマーとして用いら
れたものが相同プライマーとして使用される点に注意す
べきである。なお、ここで用いる相補プライマー（これ
は、２回目のNASBAにおいては、鋳型（アンチセンス
鎖）との関係では相補プライマーであり、ACLSVのゲノ
ムＲＮＡ（センス鎖）との関係では相同プライマーであ
る）はいずれも、その5'末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
のプロモータ配列が付加されている。

【００５４】（３）増幅産物の検出前記の増幅産物は、増幅反応液をアガロース又はポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分離した後、臭化エチ
ジウム染色等により検出できる。この場合には、電気泳
動により予想される増幅断片の分子量からACLSVのゲノ
ム由来の増幅断片であるかどうかを判断することができ
る。ただし、増幅断片の分子量だけでなく、増幅産物に
対するｃＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーション
により特異性を確認することが好ましい。その方法とし
ては、常法のドットブロットハイブリダイゼーションの
他、マイクロプレートハイブリダイゼーションなどが挙
げられる。さらに、ＰＣＲ反応と同時にハイブリダイゼ
ーションによる特異性検定を行うことができるPCR/RT-P
CRタックマン法（パーキンエルマー社）が公知の技術と
して利用できる。

【００５５】２．本発明のプライマーセット本発明はさらに、上記の本発明のウイルス検出法に使用
することのできるプライマーセットに関する。該プライ
マーセットに含まれる各プライマーは、上述のようにし
て設計することができる。

【００５６】上記プライマーセットは、通常のネスティ
ド様式の増幅方法、例えばネスティドＰＣＲ、ネスティ
ドNASBA等に用いるためのものである場合には、２種の
相同プライマー及び２種の相補プライマーを含む。この
ようなプライマーセットは、好ましくは、配列番号１〜
４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから
なる群より選択される２種類の相同プライマー、及び配
列番号５〜８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドからなる群より選択される２種類の相補プライマ
ーを含み、より好ましくは、配列番号３〜６で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。

【００５７】また、上記プライマーセットは、デュアル
ネスティド様式の増幅方法、例えばデュアルネスティド
ＰＣＲ、デュアルネスティドNASBA等に用いるためのも
のである場合には、４種の相同プライマー及び４種の相
補プライマーを含み、好ましくは、配列番号１〜８で表
わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。

【００５８】なお、上記のプライマーセットがNASBAに
用いるためのものである場合には、１回目のNASBAに用
いるための相補プライマー及び２回目のNASBAに用いる
ための相同プライマー（これは、２回目のNASBAの鋳型
（アンチセンス鎖）との関係では相補プライマーである
が、ACLSVのゲノムＲＮＡ（センス鎖）との関係では相
同プライマーである）はいずれも、その5'末端にＴ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼのプロモータ配列が付加されているこ
とが好ましい。

【００５９】さらに、本発明のウイルス検出法に使用す
るプライマー以外の試薬類を本発明のプライマーセット
に加えて、ACLSV検出用キットとすることもできる。こ
のような試薬類としては、ＲＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用
試薬若しくはNASBA用試薬、電気泳動用試薬などが挙げ
られるが、これらに限定されない。前記ＲＮＡ抽出用試
薬としては、例えば、粉砕用緩衝液、グアニジンチオシ
アン酸塩、フェノール、β−メルカプトエタノール、Ｓ
ＤＳ、クロロホルム等が挙げられる。前記ＰＣＲ用試薬
としては、例えば、Tris-HCl、KCl、MgCl2、各種ｄＮＴ
Ｐ、Taq DNAポリメラーゼ、水等が挙げられる。前記NAS
BA用試薬としては、例えば、AMV-RT、RNaseH、Ｔ７ＲＮ
Ａポリメラーゼ、BSA（ウシ血清アルブミン）、ヌクレ
オチド混合物、DTT、MgCl2、72％DMSO、2M KCl、水等が
挙げられる。前記電気泳動用試薬としては、例えば、ア
ガロース又はポリアクリルアミドゲル、ローディング緩
衝液、臭化エチジウム染色用試薬等が挙げられる。

【００６０】

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。〔調製例１〕リンゴ樹からのＲＮＡ試料の調製 ACLSVを保毒するリンゴ樹５株（農林水産省果樹試験場
リンゴ支場病害研究室にて保存）の５月の若葉と２月の
樹皮を採取して-80℃の冷凍機で保存した。これらの保
存試料のそれぞれ100mgを液体窒素で凍結し、RNeasy Pl
ant Mini Kit（キアゲン社）により全ＲＮＡを抽出し
た。得られた抽出液をＲＮＡ試料とした。

【００６１】〔実施例１〕プライマーの設計及び合成マルバカイドウに対する病原性の異なるACLSV分離株15
株（農林水産省果樹試験場リンゴ支場病害研究室にて保
存）、すなわち、P195株、P195L株、PK32株、PK51株、P
142株、P143株、P202株、PK5株、P125株、MK1株、MK8
株、MK9株、MO31株、MO41株及びB81株のゲノムＲＮＡの
塩基配列を解析した。

【００６２】すでにゲノムＲＮＡの全塩基配列が決定さ
れている、リンゴ、スモモ及びオウトウから分離された
3つのACLSV分離株において、相同な配列を示す部分はAC
LSVにおいて保存性が高いと考え、この部分に基づいて
オリゴヌクレオチドプライマーをいくつか設計し、常法
に従って合成した。ACLSVの濃度が比較的高い花弁若し
くは同時期の若葉をそれぞれの分離株を保毒するリンゴ
樹から採取して、調製例１に記載の方法に従って全ＲＮ
Ａを抽出した。上記の合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーにより逆転写及びＰＣＲを行ったところ、相同プライ
マー：5'-GAAGATCGCAGAAGGGGATATTC-3'（配列番号
９）、及び相補プライマー：5'-GTCTACAGGCTATTTATTATA
AG-3'（配列番号１０）の組み合わせにおいて全分離株
のゲノムにおける3'末端部分約1800塩基のｃＤＮＡ断片
を増幅することができた。

【００６３】次いで、このｃＤＮＡ断片の塩基配列を解
析した。はじめに、増幅に用いた上記のプライマーを用
いて、このｃＤＮＡ断片を鋳型としてシークエンス反応
を行い、塩基配列を決定した。さらに、決定した配列に
基いて新たにプライマーを合成し、上記と同様のシーク
エンス反応により塩基配列を決定した。これを繰り返し
て上記ｃＤＮＡ断片の塩基配列のほぼ全てを決定した。
これらのｃＤＮＡ断片の内部に配列未決定の領域が存在
するため、各ｃＤＮＡ断片の塩基配列を前半部分と後半
部分に分けて、配列番号１３（P195株前半）、配列番号
１４（P195株後半）、配列番号１５（P195L株前半）、
配列番号１６（P195L株後半）、配列番号１７（PK32株
前半）、配列番号１８（PK32株後半）、配列番号１９
（PK51株前半）、配列番号２０（PK51株後半）、配列番
号２１（P142株前半）、配列番号２２（P142株後半）、
配列番号２３（P143株前半）、配列番号２４（P143株後
半）、配列番号２５（MK8株前半）、配列番号２６（MK8
株後半）、配列番号２７（B81株前半）、配列番号２８
（B81株後半）、配列番号２９（P202株前半）、配列番
号３０（P202株後半）、配列番号３１（PK5株前半）、
配列番号３２（PK5株後半）、配列番号３３（PI25株前
半）、配列番号３４（PI25株後半）、配列番号３５（MK
1株前半）、配列番号３６（MK1株後半）、配列番号３７
（MO31株前半）、配列番号３８（MO31株後半）、配列番
号３９（MO41株前半）、配列番号４０（MO41株後半）、
配列番号４１（MK9株前半）及び配列番号４２（MK9株後
半）に示す。

【００６４】上記15分離株由来ｃＤＮＡ断片の塩基配
列、及びP205株由来ｃＤＮＡ断片の塩基配列（前半：配
列番号１１；後半：配列番号１２，GenBank登録番号：D
14996）のアライメントをとり、これを図１〜５に示し
た。図１の上段において、各塩基配列の左側に各分離株
の名称を示した。これらの図に基き、全分離株のｃＤＮ
Ａの増幅に用いることのできる、配列番号１〜８で表わ
される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを設計し、
常法に従って合成した。配列番号１〜４はそれぞれACLS
Vゲノム上の5'上流域から下流域に順に設計された相同
プライマーである。また、配列番号５〜８は同様にそれ
ぞれ5'上流域から下流域に順に設計された相補プライマ
ーである。

【００６５】〔実施例２〕ネスティドＰＣＲによる検出調製例１で得られたＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、
ネスティドＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。ネスティ
ドＰＣＲは以下のように行った。まず、RNA PCRキット
（Gene Amp EZrTth RNA PCR kit、パーキンエルマー
社）により逆転写と１回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲ反
応液は、５μlの系でＲＮＡ試料約50ngを鋳型として添
加し、配列番号３及び６で表わされる塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてそれぞれ終濃度
10μMになるよう加えて調製した。その後の反応はキッ
トの説明書に従って行った。増幅反応の温度条件は、６
０℃で３０分間、９４℃で１分間に続いて、９４℃で１
５秒間−６０℃で２分間を４０サイクル、その後、６０
℃で７分間とした。２回目のＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼ（TaKaRaEx Taq、宝酒造製）を用いて行っ
た。次に、説明書に従って、配列番号４及び５で表わさ
れる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー
としてそれぞれ終濃度10μMになるように加えた反応液9
5μlを、上記の逆転写及び１回目のＰＣＲを行った溶液
に加えて２回目のＰＣＲを常法により行った。増幅反応
の温度条件は、９４℃で２分間に続いて、９４℃で３０
秒間−６０℃で３０秒間−７２℃で２分間を３５サイク
ル、その後、７２℃で７分間とした。

【００６６】得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳
動することにより、ACLSVのｃＤＮＡの検出を行った
（図６、パネルＢ）。図６のパネルＢでは、全ての感染
組織からACLSVが検出され、健全（MO38）からは検出さ
れず、ACLSVの診断が正確にできることが確認された。

【００６７】〔実施例３〕デュアルネスティドＰＣＲに
よる検出調製例１で得られたＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、
デュアルネスティドＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。
デュアルネスティドＰＣＲは以下のように行った。ま
ず、実施例２と同様にして逆転写及びＰＣＲを行った。
ただし、配列番号１及び３、並びに６及び８で表わされ
る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーと
して反応液に加えた。次に、２回目のＰＣＲも実施例２
と同様に行った。ただし、配列番号２及び４、並びに５
及び７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして反応液に加えた。

【００６８】得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳
動することにより、ACLSVのｃＤＮＡの検出を行った
（図６、パネルＣ）。図６のパネルＣでは、全ての感染
組織からACLSVが検出され、健全（MO38）からは検出さ
れず、ACLSVの診断が正確にできることが確認された。
また、この結果を実施例２（パネルＢ）と比較すると、
デュアルネスティドＰＣＲではネスティドＰＣＲに比べ
て臭化エチジウムによるｃＤＮＡの染色像の試料間にお
ける変動が少なく、安定してｃＤＮＡが増幅されている
ことが考えられた。

【００６９】〔比較例１〕通常のＰＣＲによる検出調製例１で得られたＲＮＡ試料からｃＤＮＡを合成し、
通常のＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した。通常のＰＣＲ
を用いる上記増幅は、逆転写とＰＣＲを1つの反応液中
で行うことのできるRNA PCRキット（Gene Amp EZ rTth
RNA PCR kit、パーキンエルマー社）により行った。Ｐ
ＣＲ反応液は、20μlの系でＲＮＡ試料約250ngを鋳型と
して添加し、配列番号４及び５で表わされる塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてそれぞれ
終濃度10μMになるよう加えて調製した。その後の反応
はキットの説明書に従って行った。増幅反応の温度条件
は、６０℃で３０分間、９４℃で１分間に続いて、９４
℃で１５秒間−６０℃で２分間を４０サイクル、その
後、６０℃で７分間とした。

【００７０】得られた増幅産物をアガロースゲル電気泳
動することにより、ACLSVのｃＤＮＡの検出を行った
（図６、パネルＡ）。図６のパネルＡでは、比較的ACLS
Vのリンゴ樹組織中の濃度が高い５月の若葉からは一部
検出されるが、２月の樹皮からは全く検出できなかっ
た。

【００７１】

【発明の効果】本発明により、ACLSVの複数の分離株を
同時に検出することが可能となる。従って、本発明によ
れば、時期を選ばないリンゴ樹の正確なACLSV感染診断
が可能となり、これにより、ACLSV未感染のリンゴ苗木
を供給することが可能となる。

【００７２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of National Institute of Fruit Tree Science, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries <120> Methods for Detecting Apple Chlorotic Leaf Spot Virus and Primers used therein <130> P00-0008 <160> 42 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> degenerate <222> (18) <223> n is a, t, c or g <220> <221> degenerate <222> (21) <223> n is a, t, c or g <400> 1 tcvaaytcva thwgbgtngc ngtvatgtt 29 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> degenerate <222> (7) <223> n is a, t, c or g <220> <221> degenerate <222> (13) <223> n is a, t, c or g <400> 2 mgaygtnagr gtnggbmaya tgtg 24 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> degenerate <222> (6) <223> n is a, t, c or g <400> 3 artccnytdh ttcagarggg tcatc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> degenerate <222> (6) <223> n is a, t, c or g <400> 4 thtctncaag rgartttcar tttgc 25 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 5 atcgctatgt tcgcgaagat gg 22 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <220> <221> degenerate <222> (3) <223> n is a, t, c or g <220> <221> degenerate <222> (9) <223> n is a, t, c or g <400> 6 ganyybayna cyttykgvtc ctccat 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 7 gytdatrtty ggrtcyraag adgtagt 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 8 gcytcacava cytgrcggaa rgtcat 26 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 9 gaagatcgca gaaggggata ttc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 10 gtctacaggc tatttattat aag 23 <210> 11 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 11 gagagagtac caactacgtg cattggggag cactatcaat atccattgac gcactgttca 60 gaaagaatgc cggggtttca gggtggtgtt atgtgtacga caacagatgg gaaacttttg 120 agcaggcgat gctacaaaag tttcggttca acctggatag tggctcggcc acattggtga 180 cctcaccgaa ttttccagtt tcattggatg atcctggttt gtccaattcg atcagtgtag 240 cggtgatgtt tgagaatctg aacttcaagc ttgaaagcta ccctataagt gttagggtag 300 ggaacatgtg tagattcttc gacagcttct tgagttgcgt caagaataaa gtggactcca 360 actttttgct tgaggccgct aatgcagatc cgcttggcgc gggtgctttc gggtttgaac 420 aggacgatca ggt 433 <210> 12 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 12 ggcaaaggaa aagctggaac tgaatccatt acttcagaag ggtcatcctt cgataacatt 60 tctgcaagag agtttcagtt tgctagacaa gatcagaagg cgaaggatgg cggcagtgct 120 gaacctccaa ttaaaagtgg acgcagatct gaaagcgttc ctggccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caattctgga acagacactg gaggccatct tcgcgaacat 240 agcgatacag gggacctcgg aacaaacaga gttcctggac gtgctggtgg aggtgaaatc 300 catggaggat cagaaggtgg tggggtcatt caatctgaag gaggtagtcg gtttgatcaa 360 aatattcagg actacatctt cggacccgaa tataagcagc atgaccttcc gccaagtgtg 420 tgaggcattt gcccc 435 <210> 13 <211> 434 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (11) <220> <221> unsure <222> (44) <220> <221> unsure <222> (53) <220> <221> unsure <222> (381) <400> 13 grgaragcac naaytaygtg caytggggrg crytgtcaat atcnatwgay gcnytgttya 60 graaraaygc wggrgtbtcm gghtggtgyt aygtgtayga yawyagrtgg gagacdtttg 120 agcargcmat gctrcagaaa ttycgdttca ayytvgayag tggytcrgch acrttggtga 180 chtcwccaaa ytttccdgtt tcaytrgatg atccaggyct gtcvaattca atcagygtrg 240 cagtvatgtt ygagaaycts aayttcaarc twgagagyta cccaatcagt gtsagrgtrg 300 gbaacatgtg cagrttctty gayagcttct tgagcagtgt gaagaayaar gttgattcma 360 ayttyactry tdgargcygc naaygcdgwy cckytkgghg ydggwgcytt yggatttgag 420 caggaygacc aggt 434 <210> 14 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 14 ggaaaaggda argctggamc haaatccvtt rcttcagarg ggtcatccrt kgataacatw 60 tctscaagag artttcagtt tgctmgacar grtmaggmga aggagratgg cagcagtkct 120 gaayytwcag ctaaargtgg acgcagatct gaargcgttc ctggccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caatcctgga acagacactg gagtccatct tcgcgaacat 240 agcratmcag ggaacgtcgg agcagacgga rttcctggay ctrrtsgtgg aggtgaartc 300 gatggaggay cagaaggtca tmgggtcctw caatytgaag gaggtggtca ayatgatcaa 360 agcwttcaar actacctctt cggatccgaa catcagcaac atgactttcc gccaggtgtg 420 tgaggctttc gcacc 435 <210> 15 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (11) <220> <221> unsure <222> (44) <220> <221> unsure <222> (53) <220> <221> unsure <222> (83) <220> <221> unsure <222> (398) <400> 15 grgadagcac naaytaygtg cattggggrg cdytgtcaat atcnatwgay gcnytgttya 60 graaramygc hggrgtbtch ggntggtgyt acgtgtayga yaayagrtgg garacktttg 120 agcargchat gctrcagaaa ttycgdttca ayytsgayag yggytcrgcm acrttggtga 180 chtchccraa ytttccdgtt tcaytrgayg atccaggyct gtcvaattcr atyagygtgg 240 cagtsatgtt ygagaayctb aayttcaarc thgagagyta cccaatcagt gtsagrgtrg 300 gbaacatgtg cagrttctty gayagcttct tgagywgtgt gaagaayaar gttgattcma 360 ayttthtrct kgargcygcb aatgcagayc cdttgggngc dggmgcytty ggatttgagc 420 aggaygayca ggt 433 <210> 16 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 16 ggmaaaggra argctggamc maartccrtt rmttcagarg ggtcatccdt cgataacatw 60 tctscaagag artttcagtt tgctmgacaa rrtmaggmga aggagratgg crgcrrttct 120 gaayytwcag ctaaargtgg acgcagatct gaargcrtty ctggccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caaycytgga acagacactg gagtccatct tcgcgaacat 240 agcratycag ggracrtcgg agcaracgga rttcctggay ctrrtggtgg argtgaartc 300 vatggaggay cagaaggtca tvgggtcmta caatytgaag gaggtggtca ayatgatcaa 360 agcattcaar actacctctt crgatccgaa catcagcarc atgactttcc gycaggtgtg 420 tgaggcttty gcacc 435 <210> 17 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (53) <220> <221> unsure <222> (83) <220> <221> unsure <222> (128) <220> <221> unsure <222> (146) <220> <221> unsure <222> (185) <220> <221> unsure <222> (299) <220> <221> unsure <222> (302) <400> 17 grgarrgyac saaytaygtg cattggggrg cwytgtcrat atcmattgay gcnytkttya 60 graaraatgc yggdgtbtcw ggntggtgyt aygtstayga yaayagrtgg garacdtttg 120 agcargcnat gytrcaraar ttymgnttca ayytggayag tggbtcrgcc acrttggtga 180 cytcnccraa ytttccdgtb tcrytrgatg ayccdggyyt ktcmaattcr atyagygtrg 240 cvgtvatgtt tgagaayyts aayttyaagc twgaragyta cccmatmagt gtbagrgtng 300 gnaayatgtg ymgrttctty gayagcttct tgagcagygt cargaayaar gttgaytcca 360 acttyctgct tgargctgch aatgcwgayc crytggghgc aggggcyttc ggrtttgarc 420 aggatgayca rgt 433 <210> 18 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 18 ggvaaargmr argctggavc haaatccatt dcttcagarg ggtcatccrt kgayaacath 60 tctscaagrg artttcartt tgctmgacaa ratcargmga aggagratgg crgcrgttyt 120 saayctdcar ctaaargtrg acgcagatyt gaargcrttc ctggccgcrg aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caatcctgga acagayrctg gagkccatct tcgcgaacat 240 agcgattcag ggaacstcag agcagacgga gtttctggay ctavtggtgg aggtgaartc 300 matggaggab cagaaggtgr tcgggtcctw caatctgaag gaggtggtca aywtgrtcaa 360 rgccttcaag actacmtctt cggayccraa catmagcaac atgacyttcc gccaggtgtg 420 tgaggccttt ygcac 435 <210> 19 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (53) <220> <221> unsure <222> (83) <220> <221> unsure <222> (140) <220> <221> unsure <222> (146) <220> <221> unsure <222> (242) <220> <221> unsure <222> (302) <220> <221> unsure <222> (380) <220> <221> unsure <222> (392) <400> 19 grgarrgyac saaytaygtg cattggggrg caytgtcrat atcmattgay gcnytkttya 60 graagaatgc yggrgtytch ggntggtgyt aygtrtayga caacagatgg garacdtttg 120 arcargcvat gytrcaraan ttycgnttca ayytdgayag yggbtcrgcc acrttggtga 180 cytcwccraa ytttccdgtb tcrytrgatg ayccdggyyt ktcmaaytcr atyagygtrg 240 cngtratgtt ygagaayctb aayttcaagc twgaragyta ccchatmagt gtbagrgtdg 300 gnaayatgtg yagrttctty gacagyttyt tgagyagygt cargaayaar gtkgaytcca 360 ayttyytgct kgargcygcn aatgcwgayc cnytggghgc aggdgcttty ggrtttgarc 420 aggaygayca rgt 433 <210> 20 <211> 437 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (285) <220> <221> unsure <222> (323) <400> 20 ggaaaaggca argytggacc aaaatccvtt gcttcagagg ggtcatccrt ggayaacatm 60 tctgcaagag agtttcagtt tgctcgacaa gatcaggmga argaggatgg cagcrgttct 120 saatctacag ctaaargtgg acgcagatct gaaagcgttc ctgcccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caathctgga acagayactg gaggccatct tcgcgaacat 240 agcratwcar ggracstyrg arcaramgga gttcctggay ckkrnrgtgg argtgaartc 300 matggaggay cmvaargktg atngggtcmt wcaatctgaa ggaggtggkk caayhtratc 360 aarrymttca rgactacmtc ttyggayccr aayatmarca rcatgacytt ccgccargtg 420 tgtgaggcwt tygchcc 437 <210> 21 <211> 434 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (53) <220> <221> unsure <222> (83) <220> <221> unsure <222> (200) <220> <221> unsure <222> (284) <220> <221> unsure <222> (299) <220> <221> unsure <222> (302) <220> <221> unsure <222> (380) <400> 21 grgagrgyac vaaytaygtg cattggggrg cwytgtcrat atcmattgay gcnytkttya 60 graaraatgc hggrgtbtcw ggntggtgyt aygtrtayga yaacagrtgg garacdtttg 120 arcargcvat gytrcaraar ttycggttca ayytggayag tggbtcrgcc acrttggtga 180 cytcwccraa ytttccrgtn tcrytrgatg ayccdggyyt ktcmaattcr atyagygtrg 240 cvgtgatgtt tgagaaycts aacttcaagc twgaaagyta cccnatmagt gtbagrgtng 300 gnaayatgtg yagrttctty gacagcttct tgagcagygt caagaayaaa gtkgaytcma 360 ayttyctgyt ggargcygcn aatgcwgayc crytggghgc agggagcttt cggatttgar 420 caggaygayc argt 434 <210> 22 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 22 ggmaaaggma argctggacc haaatccatt rcttcagarg ggtcatccrt kgataacatw 60 tctgcaagag artttcagtt tgctmgacar raymaggmga mgragratgg cagcagttct 120 gaayytrcar ctaaargtgg acgcagatct gaargcrtyc ctggccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caatyctgga acagacactg gagkccatct tcgcgaacat 240 agcgatmcag gggacctcgg agcagacsga gttcctggav ctgatggtgg aggtgaartc 300 catggaggay cagaaggtka tcgggtcmtw caatctgaag raggtggtca ayatgatcaa 360 agycttcaag actacmtctt tggayccgaa yattagcaac atgaccttcc gccargtgtg 420 tgaggsaktc gcacc 435 <210> 23 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (53) <220> <221> unsure <222> (83) <220> <221> unsure <222> (128) <220> <221> unsure <222> (215) <220> <221> unsure <222> (284) <220> <221> unsure <222> (293) <220> <221> unsure <222> (299) <220> <221> unsure <222> (302) <220> <221> unsure <222> (380) <220> <221> unsure <222> (392) <400> 23 grgarrgyac saaytaygtg cattggggrg cwytgtcrat atcmattgay gcnytkttya 60 graaraaygc hggrgtbtcw ggntggtgyt aygtrtayga yaacagrtgg garacdtttg 120 agcargcnat gytrcaraar ttycgdttca ayctggayag tggbtcrgcc acrttggtga 180 cbtcwccraa ytttccdgtb tcrytrgatg ayccnggyyt gtcvaattcr atyagygtrg 240 cvgtratgtt ygagaayctb aayttyaagc twgaragyta yccnatmagy gtnagrgtng 300 gnaayatgtg yagrttctty gayagcttyy tgagyagygt cargaayaar gtkgaytcca 360 ayttyytgct dgargcygcn aatgcdgayc cnytgtgghg caggrtgctt tyggrtttga 420 rcaggaygay cargt 435 <210> 24 <211> 436 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 24 ggvaaaggca argctggacc haaatccatt rcttcagagg ggtcatccrt kgayaacath 60 tctgcaagag agtttcagtt tgctcgacaa rrtcaggmga aggagratgg crgcagttct 120 saayytdcar ctaaargtgg acgcagatyt gaaagcgttc ctggccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caathctgga acagayaytg gagkccatct tcgcgaacat 240 agcratmcar gggacstcrg arcagackga gttcctggay gtgayggtgg aggtcaagtc 300 aatggaggac cagaaggtga tmggstcwtw caatctgaag gaggtggtcv ayhtratmaa 360 rrymttcarr gactacmtct tyggayccga ayatharcav catgacyttc cgccargtgt 420 gtgaggcwtt ygcmcc 436 <210> 25 <211> 434 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (53) <220> <221> unsure <222> (83) <220> <221> unsure <222> (128) <220> <221> unsure <222> (303) <400> 25 gagarrgyac saaytaygtg cattggggrg cwytgtcrat atcmattgay gcnytgttya 60 graaraaygc hggrgtbtcw ggntggtgyt aygtrtayga caacagatgg garacdtttg 120 agcargcnat gytrcaraar ttycgrttca aycyggayag yggbtcrgcc acrttggtga 180 cbtcwccraa ytttccdgtb tcdhtrgatg aycmdggyyt tgtcvaaytc ratyagygtr 240 gcvgtvatgt ttgagaayct saacttcaag ctwgaragyt accchatmag tgtbagrgtr 300 ggnaayatgt gyagrttctt ygacagctty ttgagyagtg tcaagaayaa rgttgaytcc 360 aacttyctgc tkgargctgc haatgcwgay ccryttgghg cdggdgcytt yggrtttgar 420 caggatgayc argt 434 <210> 26 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 26 ggaaaaggca aagctggacc haaatcchtt gmttcagarg ggtcatccgt ggayaacata 60 tctgcaagag agtttcagtt tgctcgacaa aatcaggaga aggagaatgg cggcagtrct 120 caatcttcag ctaaaggtgg acgcagatct gaaagcrttc ctggccgyag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caathctgga acagacactg gaggccatct tcgcgaacat 240 agcgatccaa gggacctcgg arcagacgga gttyctggac ctrayggtgg argtsaagtc 300 matggaggay cmgaargkva tvggvtcmtw caatctgaag gaggtrgtca atatratcaa 360 rrymttcarg actacatctt cggatccgaa yataarcaac atgacyttcc gccargtktg 420 tgaggctttt gcccc 435 <210> 27 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 27 gagaaagcac aaattacgtg cactggggag cattgtccat atcaattgac gctcttttca 60 gaaagaacgc aggagtttcc ggctggtgct acgtgtatga caacaggtgg gaaacttttg 120 agcaggccat gctgcagaaa tttcgtttca atttagacag tggttcagcc acattggtga 180 cttctccaaa ctttcctgtt tcactggatg acccaggtct ttcaaattca ataagcgtag 240 cggtaatgtt cgaaaatctc aatttcaagc ttgagagtta cccaattagt gtgagagtgg 300 gcaatatgtg cagattcttt gatagtttct tgagttgtgt gaagaataaa gtggactcaa 360 atttcctact tgaggccgcc aacgcagatc ctcttggtgc aggagctttt gggtttgaac 420 aggatgatca ggt 433 <210> 28 <211> 442 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (64) <400> 28 aggaaaagaa aagctggaac cgaatccatt kcttcagagg ggtcatccat cgataacatt 60 tctncaagag aatttcagtt tgctagacag gatcagaagg cgaaggagga tggcrrcrgt 120 kctraacytb carytaaarg tggacgcaga tctgaaagcg ttcctggccg cagaaggcag 180 accccttcat ggaaagacag gggcaatcct ggaacagaya ctggagkcca tcttcgcgaa 240 catagcgatw carggracst cggagcarac rgagttcytg gacstrstgg trgargtgaa 300 rtcmatggag gatcagaarg tgrtrggrtc stwcaatctg aargaagtgg tcaacttaat 360 ratcaaagmt attcaagact acatcttcgg ayccgaacat magcaayatg acyttccgyc 420 aggtgtgtga rgcwttcgcw cc 442 <210> 29 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 29 gagagagtac caactacgtg cactggggag cactatcaat atccattgac gcactgttca 60 gaaagaatgc cggggtttca gggtggtgtt atgtgtacga camcagatgg gaaacttttg 120 agcaggcgat gctacaaaag tttcggttca acctggatag tggctcggcc acattggtga 180 cctcaccaaa ttttccagtt tcattggatg atcctggttt gtccaattcg atcagtgtas 240 cggtgatgtt tgagaatctg aacttcaagc ttgaaagcta ccctataagt gttagggtag 300 ggaacatgtg tagattcttc gacagcttct tgagttgcgt caagaataaa gtggactcca 360 actttttgct tgaggccgct aatgcagatc cgcttggcgc gggtgctttc gggtttgaac 420 aggacgatca ggt 433 <210> 30 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 30 ggcaaaggaa aagctggaac tgaatccatt acttcagaag ggtcatcctt cgataacatt 60 tctgcaagag agtttcagtt tgctagacaa gatcagaagg cgaaggatgg cggcagtgct 120 gaacctccaa ctaaaagtgg acgcagatct gaaagcgttc ctggccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caattctgga acagacactg gaggccatct tcgcgaacat 240 agcgatacag gggacctcgg aacaaacaga gttcctggac gtgctggtgg aggtgaaatc 300 catggaggat cagaaggtgg tggggtcatt caatctgaag gaggtagtcg gtttgatcaa 360 aatattcagg actacatctt cggacccgaa tataagcagc atgaccttcc gccaagtgtg 420 tgaggcattt gcccc 435 <210> 31 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (164) <220> <221> unsure <222> (197) <220> <221> unsure <222> (299) <400> 31 grgagagcac waaytaygtg caytggggrg caytrtcwat atcmatwgay gcdttgttca 60 graaraatgc wggdgtttcm ggwtggtgyt aygtrtmyga caacagrkgg gagacrttyg 120 agcargcvat gctrcagaar ttymrwttya ayctkgacag tggntcvgcv acattggkra 180 cktcwccaaa yttyccngtt tcattggayg atccaggycy ytcsaattca atyagbgtkg 240 cwgtsatgtt tgagaaycts aayttcaagc tkgaragtta ycchatmagt gtdagggtng 300 gyaacatgtg caggttctty gayagyttcy tgagyagtgt baagaayarr gtdgattcma 360 acttyytgyt rgaagctgcm aatgcrgacc ctttaggagy aggagctttt gggtttgagc 420 aggaygatca rgt 433 <210> 32 <211> 437 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 32 ggsaaaggva argctggamc haaatccvtt rcttcagrgg ggtcatccrt kcgataacat 60 wtctscaagg agaatttcag tttgctcgac arartmaggv gaargagrat ggcagcgrtw 120 ctgaayytwc agctaaargt ggacgcagat ctgaaggcrt tcctggccgc agaaggcaga 180 ccccttcatg gaaagacagg ggcaatcctg gaacagacac tggagkccat cttcgcgaac 240 atagcgatcc aaggracstc rgagcagacg garttyctgg acctrrtggt ggaggtgaar 300 tcvatggagg aycagaaggt sataggstcm twcaatctga aggaggtggt caatatgatc 360 aarrymttca agactacmtc ttcggatccg aayatmagca acatgacytt ccgycaggtg 420 tgtgaggcyt tcgcacc 437 <210> 33 <211> 434 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (11) <220> <221> unsure <222> (83) <220> <221> unsure <222> (84) <400> 33 gggaaagtac naattatgts cattggggag cattgtcgat atccattgac gcdttgttca 60 ggaaaaatgc tggggtatcg ggnnggtgtt acgtgtatga taacaggtgg gagacrtttg 120 agcaggccat gctgcaaaaa tttcgattca atttrgacag tggytcrgcm ackttggtga 180 cwtcwccaaa ttttccggts kcattggatg atccaggttt gtccaattca atyagcgtgg 240 ccgtratgtt tgagaayctc aatttcaagc ttgagagtta ccctataagc gtcaggggtg 300 ggtaacatgt gyaggttctt tgacagcttc cttagcagtg tgaaaaacaa ggttgaytcw 360 aaytttctgc twgaggctgc aaatgcagac cctttgggag cmggggcttt tggrtttgar 420 cargatgacc aggt 434 <210> 34 <211> 437 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <220> <221> unsure <222> (86) <400> 34 ggaaaaggwa ragctggacc maaaatccmt tgyttcagar ggvtcaycyr tkgataacat 60 htctscaaga gartttcagt wtgctngmca wgmwcaggmg aaggaggatg gcagcagkbc 120 tvaacytgca rctaaaagtg gacgcagatc tgaaagcgty cctggccgca gaaggcagac 180 cccttcatgg aaagacaggg gcaathctgg aacagayact ggagkccatc ttcgcgaaca 240 tagcgatwca rggracstcg garcaracrg arttcctsga ybtgvyrgtg gaggtsaart 300 cmatggagga ycagaaggtg rtvggstcmt wcaatctgaa ggaggtrgtc rrywtgatsa 360 arryhttcar gaactacmtc ttcggayccg aayatmarca rcatgacytt ccgccargtk 420 tgtgargctt tcgcmcc 437 <210> 35 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 35 gagagaacac taattacaty cattgggggg ctctttcrat atcaatagat gcattgttca 60 agaaaaatgc tggtgtttcw ggrtggtgyt atgtrtatga caaccggtgg garacttttg 120 agcargcsag gytrcaaaar ttymgkttya ayttggayag tggwtcmgcc acwttggtga 180 cytcwccraa cttccctgtt tctcttgatg atccwggact ttcaaattcc atttgygttg 240 crgtcatgtt cgagaatctr aayttcaart tggacagcta yccyattagy gtyagggtag 300 gaactatgtg caggttctty gacagctttc tvagyaahgt taagaayaag agcgattcca 360 acttccttct agaggcttcr aatgcwgayc cattgggtgc aagcgccttt gggtttgatg 420 ctgacgatca rgt 433 <210> 36 <211> 436 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 36 gggaaaggra argctggacc vaagtccatt gcttcagarg ggtcatcckt ggataacatt 60 tccrcaagag aatttcagtt tgctagacaa agtcaggcga aggaggatgg cggcagttct 120 aaatcttcar ytaaaggtgg acgcagatct gaaagcgttc ctrgccgcak aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caatcctgga acagacaytt ggagtccatc ttcgcgaaca 240 tagcaatcca rgggacctcg garcagacgg agttcctgga yrtgayggtg gaagtgaagt 300 caatggagga tcagaaggtg rtaagttcct acaacctgaa atcggtrgtg gatcttatca 360 aggcattcaa gactacatct tcggacccga atataaacgg ratgaccttc cgccaggttt 420 gtgaggcctt tgcycc 436 <210> 37 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 37 gagaaagcac aaattatgtg cattggggag ctttgtcaat atcaatagat gctttattca 60 ggaaaaatgc aggggtttcc ggttggtgct atgtatatga caacaggtgg gaaacatttg 120 agcaggcaat gctmcagaaa tttcgtttca acttggatag tggatcagcc acattggtga 180 cctccccaaa ctttcctgtc tcgttggacg atccaggcct ctcgaattca atcagcgtgg 240 cggtgatgtt tgagaatctg aacttcaaat tggaaagtta tccaattagt gtgagagtag 300 gcaacatgtg caggttcttt gacagcttct tgagcagtgt taagaacaaa gttgattcta 360 attttctact tgaagccgca aatgcagacc ctctgggagc aggagctttt gggtttgaac 420 aggatgatca agt 433 <210> 38 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 38 ggaaaaggaa aagctggaac caaatccatt gcttcagagg ggtcatccat tgataacatt 60 tctccaagag aatttcagtt tgctcgacaa gatcaggcga aggagaatgg cagcagttct 120 gaatttacag ctaaaagtgg acgcagatct gaaagcgttc ctggccgcag aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caatcctgga acagatactg gagtccatct tcgcgaacat 240 agcgatwcag ggcacgtcag agcagacaga attcctggat ctartggtgg aggtgaartc 300 matggaggat cagaaggtaa tcgggtctta caacctgaag gaggtggtca acatgatcaa 360 agchttcaag actacctctt cggatccgaa catcagcaac atgactttcc gycaggtgtg 420 tgaggcwtty gcmcc 435 <210> 39 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 39 grgagagyac maaytaygtg cactgkgggg agcaytrtcm atatcmattg aygcmctttt 60 caggaagaat gctggagttt cgggttggtg ttacgtatac gacaatagat gggaaacttt 120 cgagcaggcc atgctgcaaa agtttcgttt taatttggac agtggttcag ctacgttggt 180 gacctcccca aattttccag tttcattgga cgatccaggt ctttcaaatt ccataagcgt 240 ggcggtgatg ttcgagaacc tcaatttcaa gctagagagt tacccaatca gtgtgagggt 300 gggcaatatg tgcagrttct ttgacagctt cctaagtagt gtgaagaaca aagtggattc 360 caactttcta cttgaggctg ctaatgcwga tccgcttgga gcaggggtct ttggttttga 420 gcaggacgat caagt 435 <210> 40 <211> 438 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 40 ggcaagagca agactggagc aaaatccact tcttcagagg ggtcatcctt tgataacatt 60 tctacaagag agtttcagtt tgctagacaa gatcagaagg cgaaggcatg gcggcagtat 120 tgaatcttca attaaaggtg gacgcagtat ctgaaggcgt tcctggccgc agaaggcaga 180 ccccttcatg gaaagacagg ggcaattctg gaacagacac tggaggccat ctthgcgaac 240 atagcgatac aagggacctc ggagcaaacg gagttcctgg acgtactggt ggaggtgaaa 300 tccatggagg accagmaggt ggtggggtca ttcaattctg aaggaggtag tcaacttgat 360 caaaatattc aggactactt cttcggaccc gaacataagc aatatgacct tccgccaggt 420 gtgtgaagca tttgctcc 438 <210> 41 <211> 433 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 41 gagagagtac gaactatgtg cattgggggg ctttatctat atcgattgac gccctcttca 60 ggaaaaatgc tggtgtgtct ggttggtgct acgtttatga caataggtgg gaaacttttg 120 aacaagctat gttgcagaag ttcaggttca atttggatag cggatccgcg acattggtca 180 cttcaccaaa ctttccagtg tcattggatg acccaggcct ttcaaattca ataagtgtgg 240 ccgtgatgtt cgagaactta aatttcaagc ttgagagcta tccgattagc gttagagtcg 300 gcaacatgtg ccggttcttt gatagtttct tgagcagtgt caagaacagg gtggattcaa 360 actttctgct ggaggcatca aatgctgaac cccttggggc tggagctttt ggatttgaac 420 aggacgatca agt 433 <210> 42 <211> 435 <212> DNA <213> Apple chlorotic leaf spot virus <400> 42 ggaaaaggga aagctggacc aaaatccatt acttcagagg ggtcatccgt tgataacatt 60 tctgcaagag agtttcagtt tgctcgacaa aatcaggcga aggaggatgg cagcagttct 120 gaatctgcaa ctaaaggtag acgcagattt gaaggctttc ctggccgcgg aaggcagacc 180 ccttcatgga aagacagggg caatcctgga acagatgttg gagtccatct tcgcgaacat 240 agcgatacag gggacgtcgg agcaaacgga gttcctggat ctggtggtgg aagtgaagtc 300 aatggaggac caaaaggtga tcgggtcata caacctgagg gaggtggtca atatgatcaa 360 ggccttcaag actacatctt cggacccaaa catcagcaac atgactttcc gccaggtgtg 420 tgaggccttc gcacc 435

【００７３】

【配列表フリーテキスト】〔配列番号１〕プライマー。
第18塩基及び第21塩基のｎは、ａ、ｔ、ｃ、又はｇであ
る。〔配列番号２〕プライマー。第7塩基及び第13塩基のｎ
は、ａ、ｔ、ｃ、又はｇである。〔配列番号３〕プライマー。第6塩基のｎは、ａ、ｔ、
ｃ、又はｇである。

【００７４】〔配列番号４〕プライマー。第6塩基のｎ
は、ａ、ｔ、ｃ、又はｇである。〔配列番号５〕プライマー。〔配列番号６〕プライマー。第3塩基及び第9塩基のｎ
は、ａ、ｔ、ｃ、又はｇである。〔配列番号７〜１０〕プライマー。

【図面の簡単な説明】

【図１】各種ACLSV分離株由来ｃＤＮＡ断片のアライメ
ントを示す図である。

【図２】各種ACLSV分離株由来ｃＤＮＡ断片のアライメ
ントを示す図である。

【図３】各種ACLSV分離株由来ｃＤＮＡ断片のアライメ
ントを示す図である。

【図４】各種ACLSV分離株由来ｃＤＮＡ断片のアライメ
ントを示す図である。

【図５】各種ACLSV分離株由来ｃＤＮＡ断片のアライメ
ントを示す図である。

【図６】通常のＰＣＲ、ネスティドＰＣＲ及びデュアル
ネスティドＰＣＲによるACLSVの検出を示す電気泳動写
真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｒ 1:92 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者須崎浩一岩手県盛岡市下厨川字赤平４番地農試宿舎ＲＣ３棟15号 (56)参考文献Ｐｌａｎｔ．Ｄｉｓ．，Ｖｏｌ．80, Ｎｏ．６（1996），ｐ．616−621 蛋白質核酸酵素，Ｖｏｌ．41，Ｎｏ．５（1996），ｐ．419（５．ＮｅｓｔｅｄＰＣＲの項) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．35，Ｎｏ．３（1991），ｐ．273 −286 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（i）被検植物の組織から抽出したＲＮ
Ａを鋳型として使用し、リンゴクロロティックリーフス
ポットウイルスの複数の分離株のゲノムＲＮＡの第１の
部分領域を増幅し得る第１の相同プライマー及び第１の
相補プライマーを用いる核酸増幅を行って第１の増幅産
物を取得し；次いで（ii）前記第１の増幅産物を鋳型と
して使用し、リンゴクロロティックリーフスポットウイ
ルスの前記複数の分離株のゲノムＲＮＡの前記第１の部
分領域に含まれる第２の部分領域を増幅し得る第２の相
同プライマー及び第２の相補プライマーを用いる核酸増
幅を行って第２の増幅産物を取得する；ことにより、前
記被検植物からリンゴクロロティックリーフスポットウ
イルスを検出する方法であって、前記第１の相同プライマーが配列番号１、２又は３で表
わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、か
つ前記第２の相同プライマーが、（i）前記第１の相同
プライマーが配列番号１で表わされる塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである場合には、配列番号２、３若し
くは４で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ド；（ii）前記第１の相同プライマーが配列番号２で表
わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合
には、配列番号３若しくは４で表わされる塩基配列を含
むオリゴヌクレオチド；又は（iii）前記第１の相同プ
ライマーが配列番号３で表わされる塩基配列を含むオリ
ゴヌクレオチドである場合には、配列番号４で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；であり、前記第１の相補プライマーが配列番号６、７又は８で表
わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、か
つ前記第２の相補プライマーが、（iv）前記第１の相補
プライマーが配列番号６で表わされる塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドである場合には、配列番号５で表わさ
れる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；（v）前記第
１の相補プライマーが配列番号７で表わされる塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドである場合には、配列番号５
若しくは６で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオ
チド；又は（vi）前記第１の相補プライマーが配列番号
８で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであ
る場合には、配列番号５、６若しくは７で表わされる塩
基配列を含むオリゴヌクレオチド；であることを特徴と
する、ウイルス検出方法。
【請求項２】前記第１の相同プライマーが配列番号３
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであ
り、前記第２の相同プライマーが配列番号４で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第１
の相補プライマーが配列番号６で表わされる塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドであり、かつ前記第２の相補プ
ライマーが配列番号５で表わされる塩基配列を含むオリ
ゴヌクレオチドである請求項１記載のウイルス検出方
法。
【請求項３】リンゴクロロティックリーフスポットウ
イルスの前記複数の分離株が、P205株、P195株、P195L
株、PK32株、PK51株、P142株、P143株、P202株、PK5
株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO41株及
びB81株である請求項１又は２記載のウイルス検出方
法。
【請求項４】前記被検植物が、リンゴ、モモ、スモ
モ、オウトウ又はアンズである請求項１〜３のいずれか
１項に記載のウイルス検出方法。
【請求項５】前記組織が花弁、葉又は樹皮である請求
項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス検出方法。
【請求項６】以下の第１の相同プライマーとその相補
プライマー及び第２の相同プライマーとその相補プライ
マーからなる、プライマーセット：（i）第１の相同プライマーが配列番号１で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合には、第
２の相同プライマーが配列番号２、３若しくは４で表わ
される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；（ii）第１の相同プライマーが配列番号２で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合には、第
２の相同プライマーが配列番号３若しくは４で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；又は（iii）第１の相同プライマーが配列番号３で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合には、
第２の相同プライマーが配列番号４で表わされる塩基配
列を含むオリゴヌクレオチド；であり、かつ、（iv）第１の相補プライマーが配列番号６で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合には、第
２の相補プライマーが配列番号５で表わされる塩基配列
を含むオリゴヌクレオチド；（v）第１の相補プライマーが配列番号７で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合には、第
２の相補プライマーが配列番号５若しくは６で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチド；又は（vi）第１の相補プライマーが配列番号８で表わされる
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである場合には、第
２の相補プライマーが配列番号５、６若しくは７で表わ
される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項７】配列番号３、配列番号４、配列番号５、
及び配列番号６で表される塩基配列をそれぞれ含むオリ
ゴヌクレオチドからなるプライマーセット。
【請求項８】（i）被検植物の組織から抽出したＲＮ
Ａを鋳型として使用し、リンゴクロロティックリーフス
ポットウイルスの複数の分離株のゲノムＲＮＡの第１及
び第２の部分領域を増幅し得る第１及び第２の相同プラ
イマー並びに第１及び第２の相補プライマーを用いる核
酸増幅を行って第１の増幅産物を取得し；次いで（ii）
第１の増幅産物を鋳型として使用し、リンゴクロロティ
ックリーフスポットウイルスの前記複数の分離株のゲノ
ムＲＮＡの第３及び第４の部分領域を増幅し得る第３及
び第４の相同プライマー並びに第３及び第４の相補プラ
イマーを用いる核酸増幅を行って第２の増幅産物を取得
する；ことにより、前記被検植物からリンゴクロロティ
ックリーフスポットウイルスを検出する方法であって、前記第１の相同プライマーが配列番号１で表わされる塩
基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２の相
同プライマーが配列番号３で表わされる塩基配列を含む
オリゴヌクレオチドであり、前記第３の相同プライマー
が配列番号２で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドであり、前記第４の相同プライマーが配列番号４
で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであ
り、前記第１の相補プライマーが配列番号８で表わされ
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであり、前記第２
の相補プライマーが配列番号６で表わされる塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドであり、前記第３の相補プライ
マーが配列番号７で表わされる塩基配列を含むオリゴヌ
クレオチドであり、かつ前記第４の相補プライマーが配
列番号５で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチ
ドである、ウイルス検出方法。
【請求項９】リンゴクロロティックリーフスポットウ
イルスの前記複数の分離株が、P205株、P195株、P195L
株、PK32株、PK51株、P142株、P143株、P202株、PK5
株、P125株、MK1株、MK8株、MK9株、MO31株、MO41株及
びB81株である請求項８記載のウイルス検出方法。
【請求項１０】前記被検植物が、リンゴ、モモ、スモ
モ、オウトウ又はアンズである請求項８又は９に記載の
ウイルス検出方法。
【請求項１１】前記組織が花弁、葉又は樹皮である請
求項８〜１０のいずれか１項に記載のウイルス検出方
法。
【請求項１２】配列番号１、配列番号２、配列番号
３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号
７、及び配列番号８で表わされる塩基配列をそれぞれ含
むオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。