KR100442987B1 - 과수 바이러스 검정용 프라이머 및 이를 이용한 바이러스검출방법 - Google Patents

과수 바이러스 검정용 프라이머 및 이를 이용한 바이러스검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 과수 바이러스 검정용 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 ASGV, ACLSV, CTV 또는 CTLV에 의한 감염여부를 쉽고 간단하게 검정할 수 있는 서열번호 1의 ASGV-Pf 프라이머, 서열번호 2의 ASGV-Pr 프라이머, 서열번호 3의 ACLSV-CPf 프라이머, 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머, 서열번호 5의 CTLV-CPf 프라이머, 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머, 서열번호 7의 CTV-CPf 프라이머 및 서열번호 8의 CTV-CPr 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 과수 바이러스 검정용 프라이머에 관한 것이다.

Description

과수 바이러스 검정용 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출방법{PRIMERS FOR DETECTING FRUIT TREE INFECTING VIRUS INFECT AND SCREENING METHOD OF VIRUS USING SAME}
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 과수 바이러스 검정용 프라이머 및 이를 이용한 바이러스 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 사과 또는 귤에 감염되는 ASGV(apple stem grooving virus), ACLSV(apple chlorotic leaf spot virus), CTLV(citrus tatter leaf virus) 및 CTV(citrus tristeza virus)를 특이적으로 증폭시키는 PCR 프라이머 및 상기 프라이머를 이용한 4종의 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
[종래기술]
영년생 목본성 과수는 체내에 바이러스 농도가 비교적 낮고 불균일하게 분포하며 잠복 감염되어 있는 경우가 많다. 이러한 이유로 바이러스 감염 여부를 파악하지 않고 과수를 계속적으로 재배하게 되어 오히려 바이러스를 확산시키는 결과를 초래하고 있다. 또한 대다수의 과수는 접목을 실시하는 경우가 많아, 바이러스 축적을 과속화시키고 있다.
과수 바이러스는 심각한 병을 유발하기도 하여 수세약화, 수명단축, 결실지연, 수량감소, 과실의 착색불량, 기형과 발생 및 과실의 당도 감소 등의 품질저하를 야기시킬 뿐만 아니라 접목 불친화성 증대로 묘목 생산율을 감소시킬 수 있다. 이러한 과수 바이러스에 의한 병폐를 방지하기 위하여 치료법 개발과 더불어 감염여부를 쉽게 확인할 수 있는 검출방법의 개발이 시급히 요구된다.
대표적인 과수 바이러스로는 ACLSV(apple chlorotic leafspot trichovirus), ASPV(apple stem pitting virus), ASGV(apple stem groving capillovirus), CRLV(cherry rasp leaf nepovirus), ApMV(apple mosaic ilarvirus), TAMV(tulare apple mosaic ilarvirus), ToRSV(tomato ringspot nepovirus), PNRSV(prunus necrotic ringspot ilarvirus), ACLSV(apple chlorotic leafspot trichovirus), CTLV(citrus tatter leaf virus) 및 CTV(citrus tristeza virus) 등이 있다.
ASGV(apple stem grooving virus) 및 ACLSV(apple chlorotic spot virus)는 접목 전염되어 고접병을 야기한다. 새로운 품종을 갱신하기 위하여 접목할 경우 접수 품종이 이들 바이러스에 잠재 감염되어 있으면 2-3년 후에 나무 전체가 급속히 약해지고 심한 경우는 고사하는 병이 발생할 수 있다.
또한 CTLV에 감염된 감귤나무는 대목과 접수사이에 이층이 형성되어 접합면에서 수액이 나오거나 영양분의 이동이 차단될 수 있으며, 결실이 불량해질 수 있다. CTV는 온주밀감(citrus unshiu)에는 저항성을 나타내어 실제로 피해가 나타내진 않으나 유자(citrus junos)에는 줄기나 가지의 표피에 갈색무늬의 가는 줄이나 줄무늬를 보여 수세를 떨어뜨리고, 신장을 약화시켜 큰 경제적 손실을 야기한다.
과수 바이러스의 진단기술로는 지표식물을 이용한 생물 검정법, 항혈청 검정법, PCR 검정법 등이 있다.
지표식물을 이용한 생물검정은 바이러스에 감수성을 가지는 목본 지표식물을 이용한 검정방법으로, 바이러스 무독수 육성이나 검역시에 필수적인 과정으로 이용된다. 그러나 바이러스 종류에 따라 병징 발현이 빠르고 감수성이 우수한 지표식물을 탐색하여야 하는 단점이 있다.
항혈청 검정법은 ELISA(효소결합면역항체법) 등을 이용하는 방법으로, 과수 바이러스와 같이 수체내 바이러스 농도가 낮고 불균일하게 분포되어 있는 식물체에서는 동일한 검출결과를 얻기 어려우며, 재현성이 부족한 단점이 있다.
PCR 검정법은 바이러스만 DNA 단편을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여 검정하는 방법으로, 각 바이러스에 특이적인 프라이머 및 PCR 반응 조건 등을 확립하기 어려운 단점이 있다.
본 발명은 과수 바이러스를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 과수의 바이러스 감염여부를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 다수의 과수 바이러스를 한번에 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 ASGV 검정용 프라이머로 증폭된 ASGV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이고,
도 2는 ACLSV 특이 프라이머로 증폭된 ACLSV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이고,
도 3은 CTLV 검정용 프라이머로 증폭된 CTLV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이고,
도 4는 CTV 검정용 프라이머로 증폭된 CTV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이고,
도 5는 과수에서 추출한 RNA를 주형으로 EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트로 PCR하였을 때 증폭된 PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이고,
도 6은 ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트, ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트 및 EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트로 다중 RT-PCR한 결과를 나타낸 것이고,
도 7은 CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트, CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트 및 EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트로 다중 RT-PCR한 결과를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 ASGV-Pf 프라이머, 서열번호 2의 ASGV-Pr 프라이머, 서열번호 3의 ACLSV-CPf 프라이머, 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머, 서열번호 5의 CTLV-CPf 프라이머, 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머, 서열번호 7의 CTV-CPf 프라이머 및 서열번호 8의 CTV-CPr 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 과수 바이러스 검정용 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 9의 EF1a-Pf 프라이머 또는 서열번호 10의 EF1a-Pr 프라이머를 포함하는 과수 바이러스 검정용 대조군 프라이머를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 시료로부터 추출한 RNA를 주형으로 서열번호 1의 ASGV-Pf 프라이머, 서열번호 2의 AS GV-Pr 프라이머, 서열번호 3의 ACLSV-CPf 프라이머, 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머, 서열번호 5의 CTLV-CPf 프라이머, 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머, 서열번호 7의 CTV-CPf 프라이머 및 서열번호 8의 CTV-CPr 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 과수 바이러스 검정용 프라이머로 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계 및 (b) 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하여 과수 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는 과수 바이러스 검출방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 과수 바이러스 검정용 프라이머에 관한 것으로, ASGV (apple stem grooving virus), ACLSV (apple chlorotic leaf spot virus) , CTLV (citrus tatter leaf virus) 및 CTV (citrus tristeza virus)를 검정할 수 있는 프라이머를 제공한다.
ASGV는 6496 bp로 이루어진 ssRNA (+) 가닥 바이러스(D14995)로, 카필로바이러스(Capillovirus)에 속한다. ASGV 검정용 프라이머는 서열번호 1의 ASGV-Pf 프라이머 또는 서열번호 2의 ASGV-Pr 프라이머이다. ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트는 ASGV의 중합효소 유전자의 N 말단의 404 bp를 증폭시킨다(도 1).
ACLSV는 7555 bp로 이루어진 ssRNA (+)가닥 바이러스(AJ243438)로, 트리코바이러스(Trichovirus)에 속한다. ACLSV 검정용 프라이머는 서열번호 3의 ACLSV-CPf 프라이머 또는 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머이다. ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트는 ACLSV의 외피단백질(coat protein) 유전자 중 566 bp의 절편을 증폭시킨다 (도 2).
CTLV는 ssRNA (+) 가닥 바이러스(D16681)로, 카필로바이러스(Capillovirus)에 속한다. CTLV 검정용 프라이머는 서열번호 5의 CTLV-CPf 프라이머 또는 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머이다. CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트는 CTLV 의 외피단백질 유전자내의 503 bp의 절편을 증폭시킨다(도 3).
CTV는 19296 bp로 이루어진 ssRNA (+)가닥 바이러스(NC_001661)로, 클로스테로바이러스(Closterovirus)에 속한다. CTV 검정용 프라이머는 서열번호 7의 CTV-CPf 프라이머 또는 서열번호 8의 CTV-CPr 프라이머로, CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트는 CTV 외피 단백질 유전자내의 372 bp 절편을 증폭시킨다(도 4).
또한 본 발명에서는 EF1a(Elongation factor 1a, AJ223969)를 증폭시킬 수 있는 대조군 프라이머를 제공한다. 대조군 프라이머는 과수 바이러스 검정용 프라이머로 RT-PCR을 실시할 때 함께 사용하여 RT-PCR 여부를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명에서는 일예로, 서열번호 9의 EF1a-Pf 프라이머 또는 서열번호 10의 EF1a-Pr 프라이머를 사용할 수 있다. EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트는 236 bp의 절편을 증폭시킨다(도 5).
본 발명의 과수 바이러스 검정용 프라이머는 과수 식물체 또는 일부 즉, 식물 세포, 잎, 종자, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 열매 또는 종자로부터 RNA를 추출하여 1종의 프라이머 세트 또는 1종 이상의 프라이머 세트로 RT-PCR을 실시하여 과수 바이러스를 검출할 수 있다. 상기 과수 식물체는 ASGV, ACLSV, CTLV 또는 CTV가 감염될 수 있는 모든 종류의 식물일 수 있으며, 일예로 사과 및 감귤 등이 있다.
본 발명의 과수 바이러스 검정용 프라이머들은 ASGV, ACLSV, CTV 및 CTLV에 의한 감염여부를 쉽고 간단하게 검정할 수 있을 뿐만 아니라 바이러스들의 복합 감염 역시 정확하게 파악할 수 있다. 따라서, 본 발명의 과수 바이러스 검정용 프라이머를 이용하여 과수 바이러스의 감염경로를 추적하거나 종실이나 대목에 대한 감염여부를 진단할 수 있으며, 과수 바이러스를 사전에 예방, 방제할 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 시료로부터 추출한 RNA를 주형으로 서열번호 1의 ASGV-Pf 프라이머, 서열번호 2의 ASGV-Pr 프라이머, 서열번호 3의 ACLSV-CPf 프라이머, 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머, 서열번호 5의 CTLV-CPf 프라이머, 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머, 서열번호 7의 CTV-CPf 프라이머 및 서열번호 8의 CTV-CPr 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 과수 바이러스 검정용 프라이머로 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계 및 (b) 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하여 과수 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는 과수 바이러스 검출방법을 제공한다. 본 발명의 과수 바이러스 검출방법은 상기 (a) 단계에서 역전사 중합효소 연쇄반응은 대조군 프라이머를 더욱 포함하여 실시할 수 있다. 대조군 프라이머는 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 결과 유무 용도로 사용되어지는 것이다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 과수 바이러스 검정용 프라이머 제작
1-1. ASGV 검정용 프라이머
ASGV의 중합효소 유전자의 N 말단의 일부(D14995, 148-551)를 증폭할 수 있는 서열번호 1의 ASGV-Pf 및 서열번호 2의 ASGV-Pr 프라이머 세트를 제작하였다. ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트는 404 bp의 DNA 절편을 증폭시킨다.
1-2. ACLSV 검정용 프라이머
ACLSV의 외피단백질 유전자의 DNA 절편(AJ243438, 6742-7307)을 증폭할 수 있는 서열번호 3의 ACLSV-CPf 및 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머 세트를 제작하였다. ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트는 566 bp의 DNA 절편을 증폭시킨다.
1-3. CTLV 검정용 프라이머
CTLV의 외피단백질 유전자의 DNA 절편(D16681, 5871-6373)을 증폭할 수 있는 서열번호 5의 CTLV-CPf 및 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머 세트를 제작하였다. CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트는 503 bp의 DNA 절편을 증폭시킨다.
1-4. CTV 검정용 프라이머
CTV의 외피단백질 유전자의 DNA 절편(AF339088, 301-672)을 증폭할 수 있는 서열번호 5의 CTV-CPf 및 서열번호 6의 CTV-CPr 프라이머 세트를 제작하였다. CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트는 372 bp의 DNA 절편을 증폭시킨다.
1-5. 대조군 프라이머
역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)시 추출된 과수 RNA에서 DNA 절편증폭 유무를 확인하기 위한 대조군 프라이머를 제작하였다.
대조군 프라이머는 서열번호 9의 EF1a-Pf 및 서열번호 10의 EF1a-Pr 프라이머 세트이다. 상기 프라이머 세트는 EF1-a(elongation factor 1a, AJ223969) 유전자 부위(710-945)에 작용하여 약 236 bp의 단편을 증폭시킨다.
실시예 2: 과수 바이러스 검정용 프라이머에 의한 과수바이러스 검출
ASGV, ACLSV, CTLV 및 CTV 각각을 동정하였고, RNA를 정제하였다.
먼저 ELISA법에 의해서 바이러스별 감염주로 선별하였다. ELISA에 사용된 항체는 스위스 BIOREBA 사로부터 구입한 항체를 이용하였고 선발된 바이러스 감염주는 지표식물(Chenopodium quinoa 등)을 이용하여 신초 및 꽃을 접종함으로써 바이러스를 생물학적 순수 분리 및 증식에 사용하였다. 동정된 바이러스는 계대 배양하여 실험재료로 사용하고, 감염주는 폿트를 이식하여 격리 재배하여 보존하였다.
바이러스는 인산염 완충액 0.1 ml에 혼합한 다음 시약(Molecular research center, Tri-reagent) 1 ml을 첨가하여 혼합하였다. 상온에서 5분간 반응시킨 다음 0.5 ml 클로로포름을 혼합하고, 상온에서 5-10분간 반응시켰다. 이후 4 ℃에서 10000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층을 취하고, 여기에 0.5 ml 이소프로필 알콜을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 이를 상온에서 7000 rpm으로 원심분리하여 수득한 RNA 펠렛에 75 % 에탄올 1 ml을 첨가하여 세척한 다음 원심분리로 에탄올을 제거하고 건조시켜 RNase가 함유하지 않은 증류수에 용해시켰다.
2-1. ASGV
정제한 ASGV RNA를 주형으로 ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트로 RT-PCR을 실시하였다(TitanTMone Tube RT-PCR system, BOEHRINGER MANNHEIM).
RT-PCR 조성물
RNA ------------- 1 ul(ug/ul)
5 X 완충액 ------------- 10 ul
ASGV-Pf -------------- 1 ul(10 pM)
ASGV-Pr -------------- 1 ul(10 pM)
dNTP -------------- 4 ul(2 mM)
DTT-solution -------------- 2.5 ul(100 mM)
Enzyme mix -------------- 1 ul
DEPC-water -------------- 29.5 ul
RT-PCR 조건
50 ℃, 30분 -> 94 ℃, 2분 -> (94 ℃, 1분-> 54 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분) 10회 반복 ->℃, 1분-> 54 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분*) 25회 반복,*: 1회당 5초씩 증가 -> 68 ℃, 7분.
PCR 반응 후 아가로즈젤에 전기영동하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다.
도 1은 ASGV 검정용 프라이머로 증폭된 ASGV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진으로, 404 bp에서 PCR 산물이 확인되었으며, 그 외의 증폭된 PCR 산물은 관찰되지 않았다. 따라서, 실시예 1에서 제조한 ASGV-Pf/ASGV-Pr프라이머 세트는 ASGV를 증폭시킴을 확인할 수 있었다.
2-2. ACLSV
정제한 ACLSV RNA를 주형으로 ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트로 RT-PCR을 실시하였다(TitanTMone Tube RT-PCR system, BOEHRINGER MANNHEIM).
RT-PCR 조성물
RNA ------------- 1 ul(ug/ul)
5 X 완충액 ------------- 10 ul
ACLSV-CPf ------------- 1 ul(10 pM)
ACLSV-CPr -------------- 1 ul(10 pM)
dNTP -------------- 4 ul(2 mM)
DTT-solution -------------- 2.5 ul(100 mM)
Enzyme mix -------------- 1 ul
DEPC-water -------------- 29.5 ul
RT-PCR 조건
50 ℃, 30분 -> 94 ℃, 2분 -> (94 ℃, 1분-> 54 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분) 10회 반복 ->℃, 1분-> 54 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분*) 25회 반복,*: 1회당 5초씩 증가 -> 68 ℃, 7분.
PCR 반응 후 아가로즈젤에 전기영동하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다.
도 2는 ACLSV 검정용 프라이머로 증폭된 ACLSV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이다. ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머세트는 약 566 bp의 ACLSV DNA 단편을 증폭시켰다.
2-3. CTLV
정제한 CTLV RNA를 주형으로 CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트로 RT-PCR을 실시하였다(TitanTMone Tube RT-PCR system, BOEHRINGER MANNHEIM).
RT-PCR 조성물
RNA ------------- 1 ul(ug/ul)
5 X 완충액 ------------- 10 ul
CTLV-CPf -------------- 1 ul(10 pM)
CTLV-CPr -------------- 1 ul(10 pM)
dNTP -------------- 4 ul(2 mM)
DTT-solution -------------- 2.5 ul(100 mM)
Enzyme mix -------------- 1 ul
DEPC-water -------------- 29.5 ul
RT-PCR 조건
50 ℃, 30분 -> 94 ℃, 2분 -> (94 ℃, 1분-> 52 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분) 10회 반복 ->℃, 1분-> 52 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분*) 25회 반복,*: 1회당 5초씩 증가 -> 68 ℃, 7분.
PCR 반응 후 아가로즈젤에 전기영동하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다.
도 3은 CTLV 검정용 프라이머로 증폭된 CTLV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이다. CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머세트는 약 503 bp의 CTLV RNA 단편을 증폭시켰다.
2-4. CTV
정제한 CTV RNA를 주형으로 CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트로 RT-PCR을 실시하였다(TitanTMone Tube RT-PCR system, BOEHRINGER MANNHEIM).
RT-PCR 조성물
RNA ------------- 1 ul(ug/ul)
5 X 완충액 ------------- 10 ul
CTV-CPf -------------- 1 ul(10 pM)
CTV-CPr -------------- 1 ul(10 pM)
dNTP -------------- 4 ul(2 mM)
DTT-solution -------------- 2.5 ul(100 mM)
Enzyme mix -------------- 1 ul
DEPC-water -------------- 29.5 ul
RT-PCR 조건
50 ℃, 30분 -> 94 ℃, 2분 -> (94 ℃, 1분-> 52 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분) 10회 반복 ->℃, 1분-> 52 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분*) 25회 반복,*: 1회당 5초씩 증가 -> 68 ℃, 7분.
PCR 반응 후 아가로즈젤에 전기영동하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다.
도 4는 CTV 검정용 프라이머로 증폭된 CTV PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이다. CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머세트는 약 372 bp의 CTV RNA 단편을 증폭시켰다.
2-5. 대조군 프라이머
사과잎 및 감귤잎으로부터 RNA를 추출한 다음 EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머세트로 PCR을 각각 실시하였다.
PCR 조성물
RNA ------------- 1 ul(ug/ul)
5 X 완충액 ------------- 10 ul
EF1a-Pf -------------- 0.5 ul(10 pM)
EF1a-Pr -------------- 0.5 ul(10 pM)
dNTP -------------- 4 ul(2 mM)
DTT-solution -------------- 2.5 ul(100 mM)
Enzyme mix -------------- 1 ul
DEPC-water -------------- 30.5 ul
PCR 조건
50 ℃, 30분 -> 94 ℃, 2분 -> (94 ℃, 1분-> 52 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분) 10회 반복 ->℃, 1분-> 52 ℃, 1분 ->68 ℃, 1분*) 25회 반복,*: 1회당 5초씩 증가 -> 68 ℃, 7분.
PCR 반응 후 아가로즈젤에 전기영동하여 PCR 산물의 크기를 확인하였다.
도 5는 과수에서 추출한 RNA를 주형으로 EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트로 PCR하였을 때 증폭된 PCR 산물을 나타낸 전기영동사진이다. 도 5에서 “1”은 사과잎에서 추출한 RNA에 대하여 실시한 PCR 결과이고, “2”는 감귤잎에서 추출한 RNA에 대하여 실시한 PCR결과로, EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트는 약 236 bp의 EF1a DNA 단편을 증폭시켰다.
실시예 3: 과수 바이러스의 다중검출
사과 무독묘, 감귤 무독묘, ASGV 감염 사과나무, ACLSV 감염 사과나무, ASGV/ACLSV 감염 사과나무, CTV 감염 감귤나무, CTLV 감염 감귤나무, CTV/CTLV의 잎으로부터 각각 RNA를 분리하고(QIAGEN, RNeasy Plant RNA prep kit), 실시예 1의 프라이머로 RT-PCR을 실시하였다.
RT-PCR 결과는 도 6 및 7에 나타내었다.
도 6은 ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트, ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트 및 EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트로 다중 RT-PCR한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 “1”은 RT-PCR 주형으로 사과 무독묘 RNA를 사용한 것이고, “2”는 ASGV 감염 사과나무 RNA를 사용한 것이고, “3”은 ACLSV 감염 사과나무 RNA를 사용한 것이고, “4” 내지 “11”은 ASGV/ACLSV 감염 사과나무 RNA이다.
사과 무독묘는 과수 바이러스에 감염되지 않아 ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트 및 ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물이 관찰되지 않았고, EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트에 의한 PCR 산물만 236 bp 위치에서 관찰되었다.
ASGV 감염 사과나무 RNA는 ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트에 의하여 404 bp의 ASGV 중합효소 N-말단의 유전자 일부가 검출되어, ASGV로 감염되었음을 나타내었다.
ACLSV 감염 사과나무 역시 ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트에 의하여 566 bp의 ACLSV 외피단백질 유전자 일부가 검출되어, ACLSV로 감염되었음을 나타내었다.
ASGV/ACLSV 감염 사과나무는 ASGV-Pf/ASGV-Pr 프라이머 세트 및 ACLSV-CPf/ACLSV-CPr 프라이머 세트에 의하여 각각 404 bp, 566 bp의 바이러스 유전자 일부가 검출되어 ASGV 및 ACLSV로 복합감염 되었음을 나타내었다.
도 7은 CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트, CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트 및 EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트로 다중 RT-PCR한 결과를 나타낸 것이다.
도 7에서 “1”은 RT-PCR 주형으로 감귤 무독묘 RNA를 사용한 것이고, “2”는 CTV 감염 감귤나무 RNA를 사용한 것이고, “3”은 CTLV 감염 감귤나무 RNA를 사용한 것이고, “4” 내지 “6”은 CTV/CTLV 감염 감귤나무 RNA를 사용한 것이다.
감귤 무독묘는 과수 바이러스에 감염되지 않아 CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트 및 CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트로 증폭된 PCR 산물이 관찰되지 않았고, EF1a-Pf/EF1a-Pr 프라이머 세트에 의한 PCR 산물만 236 bp 위치에서 관찰되었다.
CTV 감염 감귤나무 RNA는 CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트에 의하여 372 bp의 CTV 외피단백질 유전가 일부가 검출되어, CTV로 감염되었음을 나타내었다.
CTLV 감염 감귤나무 역시 CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트에 의하여 503 bp의 CTLV 외피단백질 유전자 일부가 검출되어, CTLV로 감염되었음을 나타내었다.
CTV/CTLV 감염 사과나무는 CTLV-CPf/CTLV-CPr 프라이머 세트 및 CTV-CPf/CTV-CPr 프라이머 세트에 의하여 각각 503 bp, 372 bp의 바이러스 유전자 일부가 검출되어 CTV 및 CTLV로 복합 감염되었음을 나타내었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 과수 바이러스를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 제공하여 ASGV, ACLSV, CTV 및 CTLV에 의한 감염여부를 쉽고 간단하게 검정할 수 있을 뿐만 아니라 바이러스들의 복합 감염 역시 정확하게 파악할 수 있다. 따라서, 본 발명의 과수 바이러스 검정용 프라이머를 이용하여 과수 바이러스의 감염경로를 추적하거나 종실이나 대목에 대한 감염여부를 진단할 수 있으며, 과수 바이러스를 사전에 예방, 방제할 수 있다.
<110> KYUNGHEE UNIVERSITY <120> PRIMERS FOR DETECTING FRUIT TREE INFECTING VIRUS INFECT AND SCREENING METHOD OF VIRUS USING SAME <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV-Pf <400> 1 gtgaccaatc gcttcttttc t 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV-Pr <400> 2 tggaggaaaa gaactttggg 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACLSV-CPf <400> 3 gagagtttca gtttgctaga ca 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACLSV-CPr <400> 4 gcaaattcag tctgtaaaag 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLV-CPf <400> 5 cccgctgttg gatttgatac acct 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLV-CPr <400> 6 tgcggaattt cacacgactc ctaa 24 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTV-CPf <400> 7 acgggtataa cggacact 18 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTV-CPr <400> 8 tcaacgtgtg ttgaatttcc caag 24 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a-Pf <400> 9 accaaccttg actggtacaa gg 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a-Pr <400> 10 tggtgcatct caacggactt 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 ASGV-Pf 프라이머, 서열번호 2의 ASGV-Pr 프라이머, 서열번호 3의 ACLSV-CPf 프라이머, 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머, 서열번호 5의 CTLV-CPf 프라이머, 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머, 서열번호 7의 CTV-CPf 프라이머 및 서열번호 8의 CTV-CPr 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 과수 바이러스 검정용 프라이머.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 ASGV-Pf 프라이머 및 ASGV-Pr 프라이머는 ASGV(apple stem grooving virus) 검정용 프라이머인 것인 프라이머.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 ACLSV-CPf 프라이머 및 ACLSV-CPr 프라이머는 ACLSV(apple chlorotic leaf spot virus) 검정용 프라이머인 것인 프라이머.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 CTLV-CPf 프라이머 및 CTLV-CPr 프라이머는 CTLV(citrus tatter leaf virus) 검정용 프라이머인 것인 프라이머.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 CTV-CPf 프라이머 및 CTV-CPr 프라이머는 CTV (citrus tristeza virus) 검정용 프라이머인 것인 프라이머.
  6. 서열번호 9의 EF1a-Pf 프라이머 또는 서열번호 10의 EF1a-Pr 프라이머를 포함하는 과수 바이러스 검정용 대조군 프라이머.
  7. (a) 시료로부터 추출한 RNA를 주형으로 서열번호 1의 ASGV-Pf 프라이머, 서열번호 2의 ASGV-Pr 프라이머, 서열번호 3의 ACLSV-CPf 프라이머, 서열번호 4의 ACLSV-CPr 프라이머, 서열번호 5의 CTLV-CPf 프라이머, 서열번호 6의 CTLV-CPr 프라이머, 서열번호 7의 CTV-CPf 프라이머 및 서열번호 8의 CTV-CPr 프라이머로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 과수 바이러스 검정용 프라이머로 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 실시하는 단계; 및
    (b) 증폭된 PCR 산물의 크기를 확인하여 과수 바이러스의 감염여부를 판단하는 단계를 포함하는 과수 바이러스 검출방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 역전사 중합효소 연쇄반응은 대조군 프라이머인 EF1a-Pf 프라이머 또는 EF1a-Pr 프라이머를 더욱 포함하여 실시하는 것인 검출방법.
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