KR101651814B1 - 체리라스프리프바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

체리라스프리프바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 2 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 CRLV 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 CRLV를 진단하는 방법에 관한 것으로, CRLV에 대한 감염 여부를 기존 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1,000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

체리라스프리프바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for diagnosing Cherry rasp leaf virus and uses thereof}
본 발명은 체리라스프리프바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 2 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 CRLV 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 CRLV를 진단하는 방법에 관한 것이다.
농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 비로이드(viroid) 감염에 의해 수확량 감소 및 품질 저하가 나타나고, 이로 인해 심각한 경제적 손실이 발생하게 된다. 식물 바이러스에 의한 병은 곰팡이 또는 세균에 의한 병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하다. 따라서, 식물체나 종자의 바이러스 감염 여부에 대한 정밀하고 신속한 진단은 재배 작물의 바이러스 감염에 의한 피해를 사전에 방지하고, 바이러스 병 관리를 위한 선결요건이다.
체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus)는 그룹 IV (+) ssRNA 바이러스로서 세코바이러스과(Secoviridae) 체라바이러스속(Cheravirus)으로 분류되며, 약 28~30nm의 지름을 가진 정방형입자로, 약 10.4Kb의 핵산을 가지고 있다. CRLV의 주요기주는 사과(Malus domestica), 스위트체리(Prunus avium), 양벚(Prunus cerasus), 앵두(Prunus mahaleb), 복숭아(Prunus persica), 산딸기(Rubus idaeus) 및 민들레(Taraxacum spp.) 등이 있다. CRLV는 미국바늘선충(Xiphinema americanum)에 의해서 매개될 수 있고, 종자감염은 10-20% 정도이다. CRLV 감염증상은 잎이 접혀 매우 좁아지며, 잎의 표면에서는 아래로부터 울퉁불퉁한 증상들이 나타난다. CRLV는 나무에서 나무로의 감염은 느리지만 과실의 생산이 감소되고, 감염이 심할 경우, 나무의 고사를 초래하기도 한다. CRLV의 RNA는 10.35Kb이고, 7개의 유전자가 2개의 다단백질(polyprotein)을 암호화하며, G+C 함유량은 43.4%이다.
현재 RNA 바이러스의 진단에는 높은 검출 감도와 편리성을 갖는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. PCR 방법을 이용하여 바이러스를 진단하는 경우에는, 특이적 반응의 강도가 낮아 감염 여부의 판별이 곤란하거나, 다른 핵산과의 비특이적 반응이 일어나는 것을 대비한 검사 시스템이 필요하다. 또한, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.
따라서, 본 발명에서는 CRLV 진단용 최적 프라이머 및 이에 부합하는 검정용 프라이머(nested primer)와 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성 대조구를 제공하여, 식물체로부터 체리라스프리프바이러스를 신속하게 검출할 수 있는 PCR 시스템을 구축하고자 한다.
한편, 한국등록특허 제1024493호에는 '사과 바이로이드 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를 이용한 진단방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0067473호에는 '국내 분리주 사과모자이크바이러스 감염 진단을 위한 프라이머 및 이를 이용한 실시간 검정법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 체리라스프리프바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 체리라스프리프바이러스(CRLV)를 특이적으로 검출할 수 있는 최적의 PCR 프라이머 세트, 검정용 네스티드(nested) PCR 프라이머 세트 및 PCR 반응시 양성 대조구로 이용할 수 있는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 CRLV 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 CRLV를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 CRLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, CRLV 진단용 키트 및 RT-PCR을 이용한 CRLV 진단 방법을 이용하면, 장미과 작물을 비롯한 식물들로부터 CRLV에 대한 감염 여부를 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1,000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 체리라스프리프바이러스(CRLV) 감염 증상이 나타난 식물체의 사진이다.
도 2는 CRLV 진단용 프라이머 조합(표 3 참고)을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과로 CRLV에 대한 특이성 검사를 위한 1차 선발 결과를 나타낸다.
도 3은 CRLV 진단용 프라이머 조합 중 1차 선발을 통해 선별된 프라이머 세트들을 이용하여 양성 대조구와 참고 바이러스인 ArMV, AVB, CLRV, GFLV, PRMV, SLRSV, TRSV, TBRV, PNRSV, CRSV, LChV 및 PDV를 주형으로 하여 비특이성 검사를 수행한 2차 선발의 결과이다(각 프라이머 세트별 로딩 순서는 양성 대조구, ArMV, AVB, CLRV, GFLV, PRMV, SLRSV, TRSV, TBRV, PNRSV, CRSV, LChV 및 PDV의 순서).
도 4는 CRLV 진단용 프라이머 조합 중 2차 선발을 통해 선별된 두 개의 프라이머 세트를 이용하여 기주의 게노믹 DNA와의 비특이성 검사를 수행한 3차 선발의 결과이다.
도 5는 CRLV 진단용 프라이머 세트 5와 11의 민감성 실험 결과(A) 및 검정용 네스티드(nested) PCR 프라이머 선발 결과(B)를 나타낸다. (A)의 음수로 표시된 숫자들은 양성 대조구 플라스미드의 희석농도를 나타낸다.
도 6은 검정용 네스티드 프라이머 CRLV_F3 및 CRLV_R1 프라이머 위치를 포함하며, 비특이적 염기서열을 삽입한 돌연변이-양성 대조구의 염기서열(398bp)을 나타낸다. 검정용 프라이머인 CRLV_F3 및 CRLV_R1 프라이머의 결합 위치는 [_], 염기서열 삽입 위치는 검정색 박스로 표시하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 CRLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 2 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 5) 및 서열번호 3 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 11)를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 2 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 서열번호 3 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머(nested primer), 조합 9) 및 서열번호 3 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 10)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 서열번호 2 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 5) 및 서열번호 3 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 11)에 서열번호 3 및 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 9) 및 서열번호 3 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 10)를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 CRLV 진단용 프라이머 세트는 CRLV 진단용 프라이머 조합 5(CRLV_F2; 서열번호 2 및 CRLV_R1; 서열번호 5)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트(CRLV_F3; 서열번호 3 및 CRLV_R1; 서열번호 5) 및 CRLV 진단용 프라이머 조합 11(CRLV_F3; 서열번호 3 및 CRLV_R3; 서열번호 7)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트(CRLV_F3; 서열번호 3 및 CRLV_R2; 서열번호 6)를 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 CRLV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(네스티드 프라이머)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 CRLV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성 반응을 나타낼 것이다.
상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 2, 3, 5, 6 또는 7의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 3의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트(alkylphosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, CRLV 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 CRLV 진단용 키트에 있어서, 상기 키트는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 9의 염기서열을 갖는 DNA 단편은 CRLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성 대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다(도 6).
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, CRLV를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 가는오이풀, 가락지나물, 가시딸기, 가시복분자, 가침박달, 감복숭, 개버찌나무, 개살구, 개쇠스랑개비, 쉬땅나무, 제주아그배, 검은낭아초, 겹황매화, 구름오이풀, 구슬오이풀, 국경찔레, 귀룽나무, 금강인가목, 금앵자, 긴생열귀, 긴오이풀, 긴잎팥배, 꼭지돌배나무, 꼭지윤노리나무, 남해배, 눈개승마, 능금나무, 다마스크장미, 다정큼나무, 담자리꽃나무, 당옥매, 덩굴장미, 두메오이풀, 둥근인가목, 둥근잎개야광, 둥근잎다정큼, 듀베리, 라즈베리, 로건베리, 마르멜로, 만첩개벚, 만첩백도, 만첩홍도, 만첩흰매화, 매실나무, 명자나무, 모과나무, 목향화, 문배, 물싸리, 물싸리풀, 민둥인가목, 민생열귀, 민윤노리나무, 바래복숭, 배나무, 백도, 백운배나무, 뱀무, 버찌, 병아리꽃나무, 복딸나무, 복사앵두, 복숭아나무, 북개버찌나무, 블랙베리, 비파나무, 빈추나무, 사과나무, 산돌배, 산오이풀, 산짚신나물, 살구나무, 생열귀나무, 서양배, 서양자두, 서울귀룽, 섬개야광나무, 승도, 아그배나무, 앵도나무, 양모과, 양앵두, 오이티시카, 오이풀, 월계화, 윤노리나무, 이스라지, 자두나무, 장미, 점쉬땅나무, 진주매, 짚신나물, 찔레꽃, 참배, 채진목, 코토네아스테르, 콩배나무, 큰뱀무, 털쉬땅나무, 황매화, 팥배나무, 아몬드, 풀명자나무, 피라칸타, 한라개승마, 해당, 만첩홍매화, 아구장나무, 털개벚, 아광나무, 이노리나무, 좀낭아초, 설악아구장나무, 제주찔레, 좀찔레, 털찔레, 좀윤노리나무, 털윤노리나무, 긴잎다정큼나무, 떡윤노리나무, 끈끈이딱지, 용인복숭, 블랙손, 초크체리, 벌배나무, 털팥배나무, 왕잎팥배나무, 풀또기, 장미의 형태, 장미의 분류, 메도스위트, 레이디스맨틀, 아그리모니, 허브베니트, 붉은인가목, 흰귀룽나무, 우산오이풀, 흰털귀룽나무, 흰인가목, 큰오이풀, 쿠소, 비란수, 산복사를 포함한 장미과(Rosaceae) 식물일 수 있으며, 바람직하게는 사과 및 복숭아일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, CRLV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 CRLV를 진단하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 체리라스프리프바이러스 ( CRLV ) 진단용 프라이머의 설계 및 조합
PCR 검사법 개발 대상인 체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus)와 참고 바이러스 주(유사염기서열 및 동일 기주 감염 바이러스) 염기서열을 NCBI에서 확보한 뒤(표 1), BioEdit 버전 7.1.3을 사용하여 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다.
CRLV 프라이머 제작을 위한 CRLV와 참고 바이러스 주 NCBI 염기서열 정보
바이러스 종류 두문자어 GenBank 등록번호
Cherry rasp leaf virus CRLV NC_006271
Arabis mosaic virus ArMV NC_006057
Cherry leaf roll virus CLRV NC_015414
Grapevine fanleaf virus GFLV NC_003615
Strawberry latent ringspot virus SLRSV NC_006964
Tobacco ringspot virus TRSV NC_005097
Tomato black ring virus TBRV NC_004439
Prunus necrotic ringspot virus PNRSV NC_004362
Carnation ringspot virus CRSV NC_003530
NC_0035301
Prune dwarf virus PDV NC_008038
Arracacha virus B AVB NC_020898
NC_020897
Peach resette mosaic virus PRMV AF016626
Little cherry virus LChV NC_001836
NC_005065
프라이머 제작은 DNAMAN DNA analysis software package(DNAMAN version 6.0; Lynnon Biosoft, 캐나다)를 사용하였으며, 프라이머 Tm 값은 51-59℃(프라이머 별, 최고 5℃ 차이)를 조건으로 종 특이적인 염기서열을 탐색하였다(표 2).
CRLV 프라이머 정보
프라이머 명칭 서열(5'→3') 서열번호 길이(bp) 위치
정방향


 CRLV_F1 GATCATTAGTCCAGCAGAGC 1 20 2,539~2,558
CRLV_F2 GCTAAGAAGGTTGAGCGATA 2 20 2,495~2,514
CRLV_F3 GAGGGATGCTCATAATGC 3 18 2,686~2,703
CRLV_F4 GAGTTCAATCTACTGGCG 4 18 3,182~3,200
역방향


 CRLV_R1 ATCTACGGTTAGCTGTGGAA 5 20 3,058~3,077
CRLV_R2 GGTGTGCTAATCTACGGTTA 6 20 3,067~3086
CRLV_R3 GTAAACCTTCTGCTCCGT 7 18 3,206~3,223
CRLV_R4 GAATAGAACTCTTGCGGC 8 18 3,268~3,285
탐색된 프라이머들은 정방향과 역방향으로 설계하였고, 이것을 기초로 예상 증폭 산물이 80-1,300bp 사이에서 PCR 증폭이 가능한 프라이머 세트를 구성하였다(표 3).
CRLV 진단용 프라이머 조합 및 RT-PCR 산물의 예상 크기
조합 정방향 역방향 RT-PCR 산물 크기(bp)
1 CRLV_F1 CRLV_R1 539
2 CRLV_F1 CRLV_R2 548
3 CRLV_F1 CRLV_R3 685
4 CRLV_F1 CRLV_R4 747
5 CRLV_F2 CRLV_R1 583
6 CRLV_F2 CRLV_R2 592
7 CRLV_F2 CRLV_R3 729
8 CRLV_F2 CRLV_R4 791
9 CRLV_F3 CRLV_R1 392
10 CRLV_F3 CRLV_R2 401
11 CRLV_F3 CRLV_R3 538
12 CRLV_F3 CRLV_R4 600
13 CRLV_F4 CRLV_R1 104
상보적 DNA(cDNA)의 합성은 CRLV 감염시료의 잎에서 추출한 총 RNA 2㎕를 주형으로, 반응 버퍼(Roche, 스위스) 4㎕, N25-프라이머(50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N; 서열번호 10)(N25-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법; 한국공개특허 10-2006-0121442) 3㎕, 2mM dNTP(Enzynomics, 한국) 2㎕, RNasin(Promega, 미국) 0.7㎕, M-MuLV 역전사효소(Roche, 스위스) 1.6㎕ 및 탈이온 증류수 6.7㎕를 넣어 총 볼륨을 20㎕로 하여 수행하였다. 그 후, 합성된 cDNA 1㎕를 주형으로, Fast PCR PreMixture(Plutos, 한국) 10㎕에 25 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 포함하여, 총 볼륨 20㎕에 맞추어 PCR 반응을 진행하였다. 원 스텝(One step) RT-PCR을 수행하는 경우에는, RT-PCR PreMixture(Plutos, 한국)를 사용하였으며, 42℃에서 60분의 역전사반응 이후 PCR과 동일한 조건으로 수행하였다. PCR 조건은 최초 95℃에서 10분의 변성 후, 95℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분 과정을 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응하였다. 모든 PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔 150㎖에 TopRed nucleic acid gel stain(Biopure, 영국) 4㎕를 넣어 80분간 전기영동 하였으며, UV 하에서 형성된 특이밴드를 확인하였다.
실시예 2. CRLV 진단용 최적 프라이머 세트 선발 및 진단용 프라이머 은행 구축
CRLV의 진단용 최적 프라이머 세트의 선발을 위해 설계한 13가지 프라이머 조합으로 1~3차까지의 선발 과정을 진행하였다.
진단용 프라이머의 1차 선발은 표 3의 프라이머 세트 조합들을 사용하여 PCR 또는 RT-PCR로 CRLV에 특이적인지를 확인하여 선발하였고, 2차 선발은 1차 선발 과정을 통해 선별된 프라이머 세트들을 사용하여 참고 바이러스 주(염기서열 유사바이러스 및 공통 감염 기주에 감염될 수 있는 바이러스, 표 1 참고)를 PCR 또는 RT-PCR 수행하여 비특이적인 결과를 확인하는 방법으로 선발하였다. 선발된 프라이머는 기주에서 총 RNA를 추출하여 검사에 사용하였으므로, 기주의 게노믹 DNA에도 비특이적이어야 한다. 따라서 3차 선발은 2차 선발에서 선택되어진 프라이머 세트를 사용하여 기주의 게노믹 DNA에 비특이적인 것을 PCR로 확인하였다. 또한 검정용 네스티드(nested) PCR의 혼합물은 Fast PCR PreMixture 10㎕, PCR 산물인 주형 DNA 1㎕, 정방향 및 역방향 프라이머 각 1㎕를 넣어주었으며, 탈이온 증류수를 이용하여 총 볼륨이 20㎕가 되도록 하였다. 이때, RT-PCR 산물의 밴드가 강하게 형성된 경우에는 1/100로, 약하게 형성된 경우는 1/10로 희석하였으며, 밴드를 형성하지 않은 경우에는 RT-PCR 산물의 원액을 주형으로 사용하여 반응을 수행하였다. 검정용 PCR 조건은 전술한 RT-PCR 수행 조건에서 역전사반응 단계인 42℃, 60분의 과정을 제외하고 동일하게 수행하였다.
체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus)의 분석을 위하여 선정된 13개 PCR 프라이머 세트를 이용하여 제작된 플라스미를 대상으로 검출결과를 비교하였다. 특정밴드 형성을 확인하기 위한 분석결과, 적용된 13개의 프라이머 세트 모두에서 104~791bp 크기의 밴드가 형성되었다(도 2). 13개 조합의 결과에서 증폭위치를 고려하여 특정밴드를 형성한 4개 조합(3, 5, 8 및 11)을 1차 선발대상으로 선정한 후, 2차 선발과정을 수행하였다.
CRLV의 양성 대조구와 특이성을 확인하기 위한 ArMV, AVB, CLRV, GFLV, PRMV, SLRSV, TRSV, TBRV, PNRSV, CRSV, LChV 및 PDV의 참고 바이러스들을 대상으로 1차 선정된 4개 조합의 프라이머 세트를 적용한 결과, 프라이머 세트 3에서는 비특이적 밴드를 형성한 반면, 프라이머 세트 5, 8 및 11에서는 참고 바이러스에 대하여 밴드를 형성하지 않아, CRLV에 대한 프라이머의 특이성을 확인할 수 있었으며, 이중 프라이머 세트 5와 11을 CRLV를 분석하기 위해 적합한 프라이머로 선발하였다(도 3).
한편, CRLV의 검출에 대해서는 사과와 복숭아에서 CRLV의 발생가능성이 제기됨에 따라 각 식물체의 게노믹 DNA를 주형으로 특이성을 재분석하였다. 프라이머 세트 5와 11을 적용하여 재분석을 수행한 결과, 모두 비특이적 밴드가 형성되지 않음에 따라, 프라이머 세트 5와 11을 최종 적합 프라이머로 선정하고 민감도 분석을 수행하였다(도 4).
실시예 3. CRLV 진단용 프라이머 세트 민감도 측정 및 검정용 네스티드 프라이머 제작
제작된 1ng/㎕의 플라스미드는 10-10까지 10단계 희석하여 특이도 분석에서 선정된 프라이머 세트 5와 11을 적용하고 분석한 결과, 프라이머 세트 5는 10-8까지 특정밴드를 형성하였으며, 프라이머 세트 11은 10-7까지 특정밴드가 형성되는 것을 확인하였다(도 5A).
최종 선정된 RT-PCR 프라이머 세트로부터 검정용 네스티드(nested) PCR 분석을 위한 네스티드 PCR 프라이머를 다시 선발하여 최종 분석용 프라이머를 선정하고자 하였다. 프라이머 세트 5를 위한 네스티드 PCR 프라이머는 총 2 세트(CRLV_F1/R1; F3/R1)가 선정되었으며, 프라이머 세트 11을 위한 네스티드 PCR 프라이머 역시 총 2 세트(CRLV_F3/R1; F3/R2)를 선정하여 평가를 수행하였다. 프라이머 세트 5에 대해서는 2 세트의 네스티드 프라이머 모두 특정 밴드가 형성되었으나, RT-PCR 산물과 증폭 크기를 고려하고, 염기서열 분석을 하였을 때 문제가 없으며 가장 뚜렷하고 밝은 밴드를 형성하는 392bp의 산물이 증폭된 CRLV_F3/R1이 가장 적합한 것으로 판단되었다. 프라이머 세트 11에 대해서도 검정용 PCR에서 모두 특정밴드가 형성되었으나 401bp를 증폭하는 CRLV_F3/R2 네스티드 프라이머 세트가 가장 적합한 것으로 판단되었다(도 5B).
이상의 결과들로부터 CRLV를 분석하기 위한 RT-PCR 프라이머 조합은 프라이머 세트 5(PCR 산물 크기 583 bp)와 11(PCR 산물 크기 538 bp)으로 최종 선정되었으며, 각각의 검정용 네스티드(nested) PCR의 증폭 산물들은 각각 392bp와 401bp로 나타났다(표 4).
CRLV의 최종 RT-PCR과 네스티드 PCR 진단용 프라이머 조합 및 산물의 크기
프라이머 염기서열 서열번호 프라이머
길이(bp)		 증폭 산물
길이(bp)
세트 PCR 종류 이름

5

 RT CRLV_F2 GCTAAGAAGGTTGAGCGATA 2 20 583
CRLV_R1 ATCTACGGTTAGCTGTGGAA 5 20
Nested CRLV_F3 GAGGGATGCTCATAATGC 3 18 392
CRLV_R1 ATCTACGGTTAGCTGTGGAA 5 20

11

 RT CRLV_F3 GAGGGATGCTCATAATGC 3 18 538
CRLV_R3 GTAAACCTTCTGCTCCGT 7 18
Nested CRLV_F3 GAGGGATGCTCATAATGC 3 18 401
CRLV_R2 GGTGTGCTAATCTACGGTTA 6 20
실시예 4. CRLV 진단용 유전자변형 양성대조구 제작
선발된 프라이머 세트 구간을 포함하는 PCR 산물을 증폭하였으며, 삽입 DNA로 pGEM-T easy 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다. 5개 클론을 염기서열 분석하였고, 프라이머 세트 부착부위가 일치하는 하나의 클론을 선정하였다. 선발된 클론을 대상으로, 네스티드(nested) 프라이머 세트 증폭부위 안쪽으로 제한효소가 반응할 수 있는 염기서열인 6개의 뉴클레오티드를 위치지정돌연변이(site-directed mutagenesis) 키트(Enzynomics, 한국)를 이용하여 삽입하였다. 국내에 시판되는 EZchangeTM 위치지정돌연변이 키트는 돌연변이를 가진 프라이머로, 플라스미드 DNA를 주형으로 새로운 돌연변이를 가진 선형 플라스미드를 PCR 방법으로 증폭한 다음 원래의 플라스미드를 제거하고 말단 키네이션(kination)과 라이게이션(ligation)을 동시에 수행하고, 형질전환을 수행하는 3단계의 반응을 사용하는 방법으로, Xho I (CTCGAG)의 제한효소 자리를 삽입하였다.
검정용 네스티드(nested) PCR 이후 염기서열을 분석한 결과, 6개의 염기서열이 삽입된 것을 모두 확인할 수 있었으며(그림 6), 이에 따라 CRLV 검사에 양성대조구로 상기 제작된 플라스미드를 사용할 경우, 시료분석에서 나타날 수 있는 교차오염의 가능성을 염기서열 분석에 의해 감지하고 판단할 수 있기 때문에, 종자시료 분석에 적용이 가능할 것으로 판단되었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primer set for diagnosing Cherry rasp leaf virus and uses thereof <130> PN13419 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gatcattagt ccagcagagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctaagaagg ttgagcgata 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gagggatgct cataatgc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gagttcaatc tactggcg 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atctacggtt agctgtggaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggtgtgctaa tctacggtta 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtaaaccttc tgctccgt 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaatagaact cttgcggc 18 <210> 9 <211> 398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRLV positive control <400> 9 gagggatgct cataatgctt tatctagagc atctcttttt gaccgacaac gaactccacc 60 tttctgggtg catttgtact cagaaaatgg aggaactggt aagtccatgg ctatgatgcc 120 tttaggaaat cacatgttag atgctattgg ggaacctaaa acctgcaggt ttgttactag 180 gaatgtagcc tccaaatttt ctcgagtgaa tggctaccaa caccaacctt gttttttgat 240 ggacgagttt ggtgctgccc caaagcagga ctatagcgat gaagtgacta tgcttgattt 300 agtttcccca aatgctctga cattaaatat ggcggccatt ggggagaaga atactatgtt 360 cacttcaaag cttattattt ccacagctaa ccgtagat 398 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25

Claims (9)

  1. 서열번호 2 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 체리라스프리프바이러스(CRLV, Cherry rasp leaf virus) 특이적 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 CRLV 특이적 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CRLV 특이적 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, CRLV 특이적 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 DNA 단편을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 CRLV 특이적 진단용 키트.
  6. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 CRLV 특이적 진단용 키트.
  7. 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, CRLV를 특이적으로 진단하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물은 장미과(Rosaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 CRLV를 특이적으로 진단하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 CRLV를 특이적으로 진단하는 방법.
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