KR101651811B1

KR101651811B1 - 시금치잠복바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101651811B1
Application number: KR1020140005634A
Authority: KR
Inventors: 신용길; 이시원; 허노열; 김상목
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-01-16
Filing date: 2014-01-16
Publication date: 2016-08-29
Also published as: KR20150085681A

Abstract

본 발명은 서열번호 5 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 SpLV 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 SpLV를 진단하는 방법에 관한 것으로, SpLV에 대한 감염 여부를 기존 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1,000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

시금치잠복바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for diagnosing Spinach latent virus and uses thereof}

본 발명은 시금치잠복바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 5 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 SpLV 진단용 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 SpLV를 진단하는 방법에 관한 것이다.

농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 비로이드(viroid) 감염에 의해 수확량 감소 및 품질 저하가 나타나고, 이로 인해 심각한 경제적 손실이 발생하게 된다. 식물 바이러스에 의한 병은 곰팡이 또는 세균에 의한 병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하다. 따라서, 식물체나 종자의 바이러스 감염 여부에 대한 정밀하고 신속한 진단은 재배 작물의 바이러스 감염에 의한 피해를 사전에 방지하고, 바이러스 병 관리를 위한 선결요건이다.

시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus)는 group IV (+) ssRNA 바이러스로서 브로모바이러스과(Bromoviridae) 일라바이러스속(Ilarvirus)으로 분류되는, 약 27nm 지름의 식물병원성 바이러스이다. SpLV는 높은 종자전염을 보이며, 시금치, 맨드라미, 명아주 및 담배에도 감염된 사례가 보고되어 있다. SpLV의 RNA는 총 8.69Kb이며, 5개의 유전자가 5 종류의 단백질(replicase, movement protein, coat protein, polymerase 및 2b protein)을 암호화하며, G+C 함유량은 42.9%이다.

현재 RNA 바이러스의 진단에는 높은 검출 감도와 편리성을 갖는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. PCR 방법을 이용하여 바이러스를 진단하는 경우에는, 특이적 반응의 강도가 낮아 감염 여부의 판별이 곤란하거나, 다른 핵산과의 비특이적 반응이 일어나는 것을 대비한 검사 시스템이 필요하다. 또한, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이 프라이머의 개발이 요구된다.

따라서, 본 발명에서는 SpLV 진단용 최적 프라이머 및 이에 부합하는 검정용 프라이머(nested primer)와 이를 뒷받침할 수 있는 종 특이 프라이머 은행 및 양성 대조구를 제공하여, 식물체로부터 시금치잠복바이러스를 신속하게 검출할 수 있는 PCR 시스템을 구축하고자 한다.

한편, 한국등록특허 제1093235호에는 '마늘잠재바이러스의 진단용 특이 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0552633호에는 '고추마일드모틀바이러스 진단용 특이 프라이머'가 개시되어 있으나, 본 발명의 시금치잠복바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 시금치잠복바이러스(SpLV)를 특이적으로 검출할 수 있는 최적의 PCR 프라이머 세트, 검정용 네스티드(nested) PCR 프라이머 세트 및 PCR 반응시 양성 대조구로 이용할 수 있는 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 5 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 SpLV 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 SpLV를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 SpLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, SpLV 진단용 키트 및 RT-PCR을 이용한 SpLV 진단 방법을 이용하면, 명아주과 작물을 비롯한 식물들로부터 SpLV에 대한 감염 여부를 항혈청을 이용한 진단법에 비해 1,000배 이상 정확하고, 빠르게 확인할 수 있으므로, 검역 현장에서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 시금치잠복바이러스(SpLV) 감염 증상이 나타난 식물체의 사진이다.
도 2는 SpLV 진단용 프라이머 조합(표 3 참고)을 이용하여 RT-PCR을 수행한 결과로 SpLV에 대한 특이성 검사를 위한 1차 선발 결과를 나타낸다.
도 3은 SpLV 진단용 프라이머 조합 중 1차 선발을 통해 선별된 프라이머 세트들을 이용하여 양성 대조구와 참고 바이러스인 PDV, PNRSV, TSV 및 BBWV를 주형으로 하여 비특이성 검사를 수행한 2차 선발의 결과(A)와(각 프라이머 세트별 로딩 순서는 양성 대조구, PDV, PNRSV, TSV 및 BBWV의 순서) 2차 선발을 통해 선별된 두 개의 프라이머 세트를 이용하여 기주의 게노믹 DNA와의 비특이성 검사를 수행한 3차 선발의 결과(B)이다.
도 4는 SpLV 진단용 프라이머 세트 35와 52의 민감성 실험 결과(A) 및 검정용 네스티드(nested) PCR 프라이머 선발 결과(B)를 나타낸다. (A)의 음수로 표시된 숫자들은 양성 대조구 플라스미드의 희석농도를 나타낸다.
도 5는 검정용 네스티드 프라이머 SpLV_F6 및 SpLV_R5 프라이머 위치를 포함하며, 비특이적 염기서열을 삽입한 돌연변이-양성 대조구의 염기서열(410bp)을 나타낸다. 검정용 프라이머인 SpLV_F6 및 SpLV_R5 프라이머의 결합 위치는 [_], 염기서열 삽입 위치는 검정색 박스로 표시하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 SpLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 5 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 35) 및 서열번호 9 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 52)를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 5 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 서열번호 6 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머(nested primer), 조합 39) 및 서열번호 9 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 51)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 서열번호 5 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 35) 및 서열번호 9 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(조합 52)에 서열번호 6 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 39) 및 서열번호 9 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(네스티드 프라이머, 조합 51)를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 SpLV 진단용 프라이머 세트는 SpLV 진단용 프라이머 조합 35(SpLV_F5; 서열번호 5 및 SpLV_R7; 서열번호 16)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트(SpLV_F6; 서열번호 6 및 SpLV_R5; 서열번호 14) 및 SpLV 진단용 프라이머 조합 52(SpLV_F9; 서열번호 9 및 SpLV_R7; 서열번호 16)의 RT-PCR 산물에 대한 검정 기능을 가진 네스티드 프라이머 세트(SpLV_F9; 서열번호 9 및 SpLV_R6; 서열번호 15)를 추가로 포함할 수 있다. 1차 RT-PCR 검사 결과의 검정이 필요할 경우, 즉 RT-PCR 산물이 SpLV로부터 유래된 결과인지 확인하기 위하여 이 프라이머 조합에 대한 검정용 프라이머(네스티드 프라이머)를 이용하여 PCR 검사를 실시한다. 이때 RT-PCR 반응 결과가 SpLV 유래에서 비롯되었다면 검정용 PCR에서 양성 반응을 나타낼 것이다.

상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 5, 6, 9, 14, 15 또는 16의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 6의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 서열번호 9의 프라이머(18개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 9의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트(alkylphosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, SpLV 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 SpLV 진단용 키트에 있어서, 상기 키트는 서열번호 17의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 17의 염기서열을 갖는 DNA 단편은 SpLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 또는 PCR 반응에 대한 양성 대조구의 기능을 가진 플라스미드로서 이용될 수 있다(도 5).

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SpLV를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 시금치, 가는갯는쟁이, 창명아주, 근대, 사탕무, 나문재, 방석나물, 칠면초, 해홍나물, 냄새명아주, 양명아주, 좀명아주, 참명아주, 취명아주, 퉁퉁마디, 호모초를 포함한 명아주과(Chenopodiaceae) 식물일 수 있고, 바람직하게는 시금치일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, SpLV에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 SpLV를 진단하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 시금치잠복바이러스( SpLV ) 진단용 프라이머의 설계 및 조합

PCR 검사법 개발 대상인 시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus)와 참고 바이러스 주(유사염기서열 및 동일 기주 감염 바이러스) 염기서열을 NCBI에서 확보한 뒤(표 1), BioEdit 버전 7.1.3을 사용하여 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다.

SpLV 프라이머 제작을 위한 SpLV와 참고 바이러스 주 NCBI 염기서열 정보

바이러스 종류	두문자어	GenBank 등록번호
Spinach latent virus	SpLV	NC_003808
Prune dwarf virus	PDV	NC_008038
Prunus necrotic ringspot virus	PNRSV	NC_004362
Tobacco streak virus	TSV	NC_003844
Broad bean wilt virus	BBWV	NC_005289 NC_005290

프라이머 제작은 DNAMAN DNA analysis software package(DNAMAN version 6.0; Lynnon Biosoft, 캐나다)를 사용하였으며, 프라이머 Tm 값은 51-59℃(프라이머 별, 최고 5℃ 차이)를 조건으로 종 특이적인 염기서열을 탐색하였다(표 2).

SpLV 프라이머 정보

프라이머 명칭		서열(5'→3')	서열번호	길이(bp)	위치
정방향	SpLV_F1	TACCCGAGTATGAGCGAGGT	1	20	2,187~2,206
	SpLV_F2	ATGAGCGAGGTATGACGGT	2	19	2,196~2,214
	SpLV_F3	GGTATGACGGTTGATGGTTT	3	20	2,204~2,223
	SpLV_F4	GGTTGATGGTTTCGTCTC	4	18	2,212~2,229
	SpLV_F5	GGTGGACGGAAACATTACT	5	19	2,239~2,257
	SpLV_F6	GACTCTTCTTGCGTGTTTGA	6	20	2,303~2,322
	SpLV_F7	CAACATCTCTCCTCAAGCA	7	19	2,421~2,439
	SpLV_F8	GCGGCGTTATTCCTAAAG	8	18	2,505~2,522
	SpLV_F9	GATTCCATTCGTGTCTCG	9	18	2,692~2,709
역방향	SpLV_R1	AACACGCAAGAAGAGTCG	10	18	2,302~2,319
	SpLV_R2	CTTGCTTGAGGAGAGATGT	11	19	2,423~2,441
	SpLV_R3	TCACTCGGTATTCAAGCG	12	18	2,523~2,540
	SpLV_R4	TACTTCCTTCACTCGTGC	13	18	2,651~2,668
	SpLV_R5	GACACGAATGGAATCTGCT	14	19	2,688~2,706
	SpLV_R6	TCTCACTAAGGACTGCCGT	15	19	2,795~2,813
	SpLV_R7	CCATTCATCCCAGGTAAAC	16	19	2,958~2,976

탐색된 프라이머들은 정방향과 역방향으로 설계하였고, 이것을 기초로 예상 증폭 산물이 80-1,300bp 사이에서 PCR 증폭이 가능한 프라이머 세트를 구성하였다(표 3).

SpLV 진단용 프라이머 조합 및 RT-PCR 산물의 예상 크기

조합	정방향	역방향	RT-PCR 산물 크기(bp)	조합	정방향	역방향	RT-PCR 산물 크기(bp)
1	SpLV_F1	SpLV_R1	133	31	SpLV_F5	SpLV_R3	302
2	SpLV_F1	SpLV_R2	255	32	SpLV_F5	SpLV_R4	430
3	SpLV_F1	SpLV_R3	354	33	SpLV_F5	SpLV_R5	468
4	SpLV_F1	SpLV_R4	482	34	SpLV_F5	SpLV_R6	575
5	SpLV_F1	SpLV_R5	520	35	SpLV_F5	SpLV_R7	738
6	SpLV_F1	SpLV_R6	627	36	SpLV_F6	SpLV_R2	139
7	SpLV_F1	SpLV_R7	790	37	SpLV_F6	SpLV_R3	238
8	SpLV_F2	SpLV_R1	124	38	SpLV_F6	SpLV_R4	366
9	SpLV_F2	SpLV_R2	246	39	SpLV_F6	SpLV_R5	404
10	SpLV_F2	SpLV_R3	345	40	SpLV_F6	SpLV_R6	511
11	SpLV_F2	SpLV_R4	473	41	SpLV_F6	SpLV_R7	674
12	SpLV_F2	SpLV_R5	511	42	SpLV_F7	SpLV_R3	120
13	SpLV_F2	SpLV_R6	618	43	SpLV_F7	SpLV_R4	248
14	SpLV_F2	SpLV_R7	781	44	SpLV_F7	SpLV_R5	286
15	SpLV_F3	SpLV_R1	116	45	SpLV_F7	SpLV_R6	393
16	SpLV_F3	SpLV_R2	238	46	SpLV_F7	SpLV_R7	556
17	SpLV_F3	SpLV_R3	337	47	SpLV_F8	SpLV_R4	164
18	SpLV_F3	SpLV_R4	465	48	SpLV_F8	SpLV_R5	202
19	SpLV_F3	SpLV_R5	503	49	SpLV_F8	SpLV_R6	309
20	SpLV_F3	SpLV_R6	610	50	SpLV_F8	SpLV_R7	472
21	SpLV_F3	SpLV_R7	773	51	SpLV_F9	SpLV_R6	122
22	SpLV_F4	SpLV_R1	108	52	SpLV_F9	SpLV_R7	285
23	SpLV_F4	SpLV_R2	230
24	SpLV_F4	SpLV_R3	329
25	SpLV_F4	SpLV_R4	457
26	SpLV_F4	SpLV_R5	495
27	SpLV_F4	SpLV_R6	602
28	SpLV_F4	SpLV_R7	765
29	SpLV_F5	SpLV_R1	81
30	SpLV_F5	SpLV_R2	203

상보적 DNA(cDNA)의 합성은 APLV 감염시료의 잎에서 추출한 총 RNA 2㎕를 주형으로, 반응 버퍼(Roche, 스위스) 4㎕, N25-프라이머(50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N; 서열번호 18)(N25-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법; 한국공개특허 10-2006-0121442) 3㎕, 2mM dNTP(Enzynomics, 한국) 2㎕, RNasin(Promega, 미국) 0.7㎕, M-MuLV 역전사효소(Roche, 스위스) 1.6㎕ 및 탈이온 증류수 6.7㎕를 넣어 총 볼륨을 20㎕로 하여 수행하였다. 그 후, 합성된 cDNA 1㎕를 주형으로, Fast PCR PreMixture(Plutos, 한국) 10㎕에 25 pmol의 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 1㎕씩 포함하여, 총 볼륨 20㎕에 맞추어 PCR 반응을 진행하였다. 원 스텝(One step) RT-PCR을 수행하는 경우에는, RT-PCR PreMixture(Plutos, 한국)를 사용하였으며, 42℃에서 60분의 역전사반응 이후 PCR과 동일한 조건으로 수행하였다. PCR 조건은 최초 95℃에서 10분의 변성 후, 95℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분 과정을 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응하였다. 모든 PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔 150㎖에 TopRed nucleic acid gel stain(Biopure, 영국) 4㎕를 넣어 80분간 전기영동 하였으며, UV 하에서 형성된 특이밴드를 확인하였다.

실시예 2. SpLV 진단용 최적 프라이머 세트 선발 및 진단용 프라이머 은행 구축

SpLV의 진단용 최적 프라이머 세트의 선발을 위해 설계한 52가지 프라이머 조합으로 1~3차까지의 선발 과정을 진행하였다.

진단용 프라이머의 1차 선발은 표 3의 프라이머 세트 조합들을 사용하여 PCR 또는 RT-PCR로 SpLV에 특이적인지를 확인하여 선발하였고, 2차 선발은 1차 선발 과정을 통해 선별된 프라이머 세트들을 사용하여 참고 바이러스 주(염기서열 유사바이러스 및 공통 감염 기주에 감염될 수 있는 바이러스, 표 1 참고)를 PCR 또는 RT-PCR 수행하여 비특이적인 결과를 확인하는 방법으로 선발하였다. 선발된 프라이머는 기주에서 총 RNA를 추출하여 검사에 사용하였으므로, 기주의 게노믹 DNA에도 비특이적이어야 한다. 따라서 3차 선발은 2차 선발에서 선택되어진 프라이머 세트를 사용하여 기주의 게노믹 DNA에 비특이적인 것을 PCR로 확인하였다. 또한 검정용 네스티드(nested) PCR의 혼합물은 Fast PCR PreMixture 10㎕, PCR 산물인 주형 DNA 1㎕, 정방향 및 역방향 프라이머 각 1㎕를 넣어주었으며, 탈이온 증류수를 이용하여 총 볼륨이 20㎕가 되도록 하였다. 이때, RT-PCR 산물의 밴드가 강하게 형성된 경우에는 1/100로, 약하게 형성된 경우는 1/10로 희석하였으며, 밴드를 형성하지 않은 경우에는 RT-PCR 산물의 원액을 주형으로 사용하여 반응을 수행하였다. 검정용 PCR 조건은 전술한 RT-PCR 수행 조건에서 역전사반응 단계인 42℃, 60분의 과정을 제외하고 동일하게 수행하였다.

시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus)의 분석을 위하여 선정된 52개 PCR 프라이머 세트를 이용하여 제작된 플라스미를 대상으로 검출결과를 비교하였다. 특정밴드 형성을 확인하기 위한 분석결과, 적용된 52개의 프라이머 세트 모두에서 81~790bp 크기의 밴드가 형성되었다(도 2). 52개 조합의 결과에서 증폭위치를 고려하여 특정밴드를 형성한 4개 조합(11, 35, 46 및 52)을 1차 선발대상으로 선정한 후, 2차 선발과정을 수행하였다.

SpLV의 양성 대조구와 특이성을 확인하기 위한 PDV, PNRSV, TSV 및 BBWV의 참고 바이러스들을 대상으로 1차 선정된 4개 조합의 프라이머 세트를 적용한 결과, 프라이머 세트 11과 46에서는 비특이적 밴드를 형성한 반면, 프라이머 세트 35와 52에서는 참고 바이러스에 대하여 밴드를 형성하지 않아, SpLV에 대한 프라이머의 특이성을 확인할 수 있었으며, 이중 프라이머 세트 35와 52를 SpLV를 분석하기 위해 적합한 프라이머로 선발하였다(도 3A).

한편, SpLV의 검출에 대해서는 시금치에서 SpLV의 발생가능성이 제기됨에 따라 식물체의 게노믹 DNA를 주형으로 특이성을 재분석하였다. 프라이머 세트 35와 52를 적용하여 재분석을 수행한 결과, 모두 비특이적 밴드가 형성되지 않음에 따라, 프라이머 세트 35와 52를 최종 적합 프라이머로 선정하고 민감도 분석을 수행하였다(도 3B).

실시예 3. SpLV 진단용 프라이머 세트 민감도 측정 및 검정용 네스티드 프라이머 제작

제작된 1ng/㎕의 플라스미드는 10^-10까지 10단계 희석하여 특이도 분석에서 선정된 프라이머 세트 35와 52를 적용하고 분석한 결과, 프라이머 세트 35와 52 모두 10^-8까지 특정밴드가 형성되는 것을 확인하였다(도 4A).

최종 선정된 RT-PCR 프라이머 세트로부터 검정용 네스티드(nested) PCR 분석을 위한 네스티드 PCR 프라이머를 다시 선발하여 최종 분석용 프라이머를 선정하고자 하였다. 프라이머 세트 35를 위한 네스티드 PCR 프라이머는 총 4 세트(SpLV_F5/R3; F6/R5; F7/R6; F8/R6)가 선정되었으며, 프라이머 세트 52를 위한 네스티드 PCR 프라이머는 1 세트(SpLV_F9/R6)를 선정하여 평가를 수행하였다. 프라이머 세트 35에 대해서는 4 세트의 네스티드 프라이머 모두 특정 밴드가 형성되었으나, RT-PCR 산물과 증폭 크기를 고려하고, 염기서열 분석을 하였을 때 문제가 없으며 가장 뚜렷하고 밝은 밴드를 형성하는 404bp의 산물이 증폭된 SpLV_F6/R5가 가장 적합한 것으로 판단되었다. 프라이머 세트 52는 122bp를 증폭하는 SpLV_F9/R6가 특정밴드를 형성하여 적합성이 확인되었다(도 4B).

이상의 결과들로부터 SpLV를 분석하기 위한 RT-PCR 프라이머 조합은 프라이머 세트 35(PCR 산물 크기 738 bp)와 52(PCR 산물 크기 285 bp)으로 최종 선정되었으며, 각각의 검정용 네스티드(nested) PCR의 증폭 산물들은 각각 404bp와 122bp로 나타났다(표 4).

SpLV의 최종 RT-PCR과 네스티드 PCR 진단용 프라이머 조합 및 산물의 크기

프라이머			염기서열	서열번호	프라이머 길이(bp)	증폭 산물 길이(bp)
세트	PCR 종류	이름
35	RT	SpLV_F5	GGTGGACGGAAACATTACT	5	19	738
		SpLV_R7	CCATTCATCCCAGGTAAAC	16	19
	Nested	SpLV_F6	GACTCTTCTTGCGTGTTTGA	6	20	404
		SpLV_R5	GACACGAATGGAATCTGCT	14	19
52	RT	SpLV_F9	GATTCCATTCGTGTCTCG	9	18	285
		SpLV_R7	CCATTCATCCCAGGTAAAC	16	19
	Nested	SpLV_F9	GATTCCATTCGTGTCTCG	9	18	122
		SpLV_R6	TCTCACTAAGGACTGCCGT	15	19

실시예 4. SpLV 진단용 유전자변형 양성대조구 제작

선발된 프라이머 세트 구간을 포함하는 PCR 산물을 증폭하였으며, 삽입 DNA로 pGEM-T easy 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다. 5개 클론을 염기서열 분석하였고, 프라이머 세트 부착부위가 일치하는 하나의 클론을 선정하였다. 선발된 클론을 대상으로, 네스티드(nested) 프라이머 세트 증폭부위 안쪽으로 제한효소가 반응할 수 있는 염기서열인 6개의 뉴클레오티드를 위치지정돌연변이(site-directed mutagenesis) 키트(Enzynomics, 한국)를 이용하여 삽입하였다. 국내에 시판되는 EZchange^TM 위치지정돌연변이 키트는 돌연변이를 가진 프라이머로, 플라스미드 DNA를 주형으로 새로운 돌연변이를 가진 선형 플라스미드를 PCR 방법으로 증폭한 다음 원래의 플라스미드를 제거하고 말단 키네이션(kination)과 라이게이션(ligation)을 동시에 수행하고, 형질전환을 수행하는 3단계의 반응을 사용하는 방법으로, Xho I (CTCGAG)의 제한효소 자리를 삽입하였다.

검정용 네스티드(nested) PCR 이후 염기서열을 분석한 결과, 6개의 염기서열이 삽입된 것을 모두 확인할 수 있었으며(그림 5), 이에 따라 SpLV 검사에 양성대조구로 상기 제작된 플라스미드를 사용할 경우, 시료분석에서 나타날 수 있는 교차오염의 가능성을 염기서열 분석에 의해 감지하고 판단할 수 있기 때문에, 종자시료 분석에 적용이 가능할 것으로 판단되었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primer set for diagnosing Spinach latent virus and uses thereof <130> PN13421 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tacccgagta tgagcgaggt 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atgagcgagg tatgacggt 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggtatgacgg ttgatggttt 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ggttgatggt ttcgtctc 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggtggacgga aacattact 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gactcttctt gcgtgtttga 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caacatctct cctcaagca 19 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcggcgttat tcctaaag 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gattccattc gtgtctcg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aacacgcaag aagagtcg 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cttgcttgag gagagatgt 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcactcggta ttcaagcg 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tacttccttc actcgtgc 18 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gacacgaatg gaatctgct 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tctcactaag gactgccgt 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccattcatcc caggtaaac 19 <210> 17 <211> 410 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpLV positive control <400> 17 gactcttctt gcgtgtttga tgccggttca cgtattatgc caggtctgaa aaaggcattg 60 gtaatggatg caaatttcaa aatcgtgatc gaggatggtg tggcaggatg tgggaaaaca 120 acatctctcc tcaagcaagc taagccggat tcggatttgt tgttagctgc caaccgtgag 180 actgcaaatg acgcaaaagc ctcgagcagc ggcgttattc ctaaagcgct tgaataccga 240 gtgagaactg tggattctta cttgatgttg agaacgtggt tcacagccga gagattgctc 300 gttgatgaat gtttcttggt ccatgctggc ttggtctatg cagctgccac cttggcacga 360 gtgaaggaag taatagcttt tggtgataca aagcagattc cattcgtgtc 410 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnn 25

Claims

서열번호 5 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 시금치잠복바이러스(SpLV, Spinach latent virus) 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 서열번호 5 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 SpLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
제1항에 있어서, 서열번호 6 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 SpLV 진단용 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, SpLV 진단용 키트.
제4항에 있어서, 서열번호 17의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 SpLV 진단용 키트.
제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 SpLV 진단용 키트.
명아주과(Chenopodiaceae) 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, SpLV를 진단하는 방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.