KR102096635B1 - 검역 식물바이러스인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 검역 식물바이러스인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus, BCRV)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 4개의 프라이머 세트는 BCRV를 특이적으로 검출할 수 있으므로, BCRV의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.

Description

검역 식물바이러스인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Specific primer set for detecting blackberry chlorotic ringspot virus, quarantine plant virus and uses thereof}

본 발명은 검역 식물바이러스인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

기후 온난화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화 및 변이, 그리고 농산물 교역 확대에 따라 돌발 바이러스 및 새로운 바이러스 병의 출현 및 위험도는 점차 높아지고 있다. 또한, 평균 기온의 지속적 증가에 따라 바이러스를 매개하는 곤충이 늘어나고, 식물바이러스 병이 확산되고 있는 추세이다. 특히, 자유무역의 영향으로 다양한 종류의 식물들이 국내로 수입되고 있으며, 그에 따라 잠재적인 또는 동정되지 않은 병원성 식물바이러스들이 농작물, 사료, 견목, 종자, 야채, 과일 및 한약재를 통해서 함께 수입될 가능성이 높아지고 있다. 검역병원체의 지정은 식물을 자연 기주로 하는 병원체로, 국내에 분포하지 않는 병원체 중 검역적 위험도가 높은 병원체를 매년 위험도평가를 거쳐 정도에 따라 '금지급, '관리급' 및 '규제비검역'으로 구분하여 총 100종으로 관리하고 있다(Animal, Plant and Fisheries Quarantine and Inspection Agency, 2013).

이에 새로운 병해충이 유입되었을 때 일어날 수 있는 국가적인 재앙을 사전에 방지하여 농림업 생산의 안정화를 이룩하고 생태계를 보호하고, 인간생활을 쾌적하게 하기 위해, 세계 각국이 정부 차원에서 정책적으로 식물검역을 점차 강화하고 있는 추세이다. 또한, 식물검역의 근본적인 이유는 새로운 병해충의 침입을 막는 데 소요되는 경비와 불편이, 침입된 병해충을 방제(防除)하는 데 소비되는 비용이나 피해액에 비하면 매우 경제적이기 때문이다.

현재, RNA 바이러스의 검출에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있고, 병원체의 PCR 검출을 위해서는 종 특이적인 프라이머의 개발이 가장 중요하다. 또한, PCR 검사법으로 검출할 때, 특이적 반응의 강도가 낮아 판별이 곤란할 경우, 또는 다른 핵산과의 비특이적 반응을 일으킬 경우를 대비한 검사시스템이 필요한 실정이다. 더욱이, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 검출에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머의 개발이 요구된다.

블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(B lackberry chlorotic ringspot virus)는 일라바이러스 속(Ilarvirus)의 하위그룹 I에 속하는 바이러스로, 메틸전달효소(methyltransferase) 및 헬리카제(helicase) 효소 모티프를 가진 하나의 단백질을 코딩하는 3.4kb RNA 1과, RNA-의존성 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase)와 RNA 간섭의 억제에 관여하는 것으로 여겨지는 단백질을 코딩하는 ORF(open reading frame)를 코딩하는 2.8kb RNA 2와, 바이러스의 이동 및 외막 단백질을 코딩하는 2.3kb RNA 3으로 이루어진 게놈을 가지고 있다. 기주(숙주) 간 이동을 위해 벡터에 의존하는 대다수의 다른 식물 바이러스와 달리, 일라바이러스 속은 종자 또는 화분(pollen)에 의해 효율적으로 전달될 수 있어, 수평적 전이 뿐만 아니라 수직적 전이에도 강점이 있다.

한편, 한국등록특허 제1493910호에는 '딸기잠재원형반점 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1509653호에는 '토마토원형반점 바이러스 특이적 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 검역 식물바이러스인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스의 이동 단백질(movement protein, MP)의 염기서열을 이용하여 프라이머를 제작하였고, 제작된 프라이머 세트 중, 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스의 RNA에는 특이적으로 결합하며, 유연관계의 바이러스 및 기주 유사관계 바이러스에는 결합하지 않으며, 기주 식물의 게노믹 DNA에도 결합하지 않는 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 최종선발된 총 4개의 프라이머 세트는 검역 식물바이러스인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출할 수 있으므로, 검역 대상인 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스에 대한 검출이 쉽고 빠르게 수행될 수 있으므로, 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스의 국내로의 도입을 효과적으로 방지할 수 있을 것으로 사료된다.

도 1은 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus, BCRV) 검출용 프라이머 세트의 1차 선발 결과를 나타낸 것이다. M: DNA 크기 마커, N: 음성 대조군.
도 2는 BCRV 검출용 프라이머의 2차 선발 결과를 나타낸 것으로, 유연관계 및 기주 유사관계의 바이러스에 대한 결과이다. RpRSV: Raspberry ringspot virus, SLRSV: Strawberry latent ringspot virus, ArMV: Arabis mosaic virus, PDV; Prune dwarf virus.
도 3은 BCRV 검출용 프라이머의 3차 선발 결과를 나타낸 것으로, 기주식물의 게노믹 DNA를 대상으로 검출을 수행한 결과이다.
도 4는 선발된 BCRV 검출용 프라이머의 end-point PCR 결과를 나타낸 것이다. 10^-1: BCRV 게노믹 RNA 원액 10^-1 희석, 10^-2: BCRV 게노믹 RNA 원액 10^-2 희석, 10^-3: BCRV 게노믹 RNA 원액 10^-3 희석, 10^-4: BCRV 게노믹 RNA 원액 10^-4 희석, 10^-5: BCRV 게노믹 RNA 원액 10^-5 희석, 10^-6: BCRV 게노믹 RNA 원액 10^-6 희석.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 4개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 바람직하게는 4개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1, 2, 4, 8, 9 및 10의 서열 내의 16개 이상, 17개이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1, 2, 4, 8, 9 및 10의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명의 서열번호 1, 2 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향(forward) 프라이머이며, 서열번호 8, 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향(reverse) 프라이머이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물은 블랙베리, 라스베리에 제한되지 않고, 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스에 감염될 수 있는 식물이면 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스를 검출하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. BCRV 특이 프라이머의 설계 및 조합

블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus, 이하 BCRV) 검출용 프라이머의 설계를 위하여, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)에 등록되어 있는 BCRV의 이동단백질(movement protein, MP) 염기서열들(JX429864~JX429895, NC_011555, DQ091195, GQ325716 및 DQ329378)을 다운 받았다. 다운로드한 염기서열은 Multalign 프로그램을 이용하여 다중정렬하였고, BCRV의 공통적인 서열을 탐색하였다. BCRV 검출용 프라이머의 설계는 Primer 3과 NCBI primer-Blast 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 1).

BCRV 검출용 프라이머 서열 정보

정방향 프라이머 (5'→3')	역방향 프라이머 (5'→3')
BCRV_F1 : AAGATGACTGCGCTTACATT (서열번호 1)	BCRV_R1 : GCAATCAGCAAGTTCCTACT (서열번호 7)
BCRV_F2 : GATGGAGCTCAATATGGGTA (서열번호 2)	BCRV_R2 : CTTTGCTGGTTTAATTTGCT (서열번호 8)
BCRV_F3 : AACAACCAAAGAAACGAAAA (서열번호 3)	BCRV_R3 : TCTATTGAGGCACGACTTCT (서열번호 9)
BCRV_F4 : TTAGCTACCGGTGATGAACT (서열번호 4)	BCRV_R4 : CTCCAATGCCCTAGTATTTG (서열번호 10)
BCRV_F5 : CAAATACTAGGGCATTGGAG (서열번호 5)	BCRV_R5 : TTAATATGAACGCCTCGTTT (서열번호 11)
BCRV_F6 : AGCGATAAAGAAATGCGTAG (서열번호 6)	BCRV_R6 : TTCATCACCGGTAGCTAAAT (서열번호 12)
	BCRV_R7 : TTTTCGTTTCTTTGGTTGTT (서열번호 13)

이후, 이들 정방향 및 역방향 프라이머를 조합하여 PCR 증폭이 가능한 42가지 세트를 조합하였다(표 2).

실시예 2. BCRV 검출을 위한 최적의 프라이머 세트 선발

실시예 1에서 제작한 프라이머 세트 42개의 조합으로 BCRV 검출을 위한 최적의 프라이머를 선발하기 위해 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. PCR 조건은 하기 표 3과 같다.

PCR 반응 조건

단계	온도(℃)	시간
역전사	42	60분
전-변성	95	10분
변성	95	45초
결합	55	1분
신장	72	1분
변성 단계로 돌아가 34회 추가 반복
최종 신장	72	5분
보관	4	∞

먼저, 프라이머 개발대상인 BCRV 유전자를 이용한 1차 선발을 수행하였고(도 1), 이 중 PCR 산물의 크기가 각각 563bp, 557bp, 486bp, 411bp, 446bp, 336bp로 확인되는 4, 10, 11, 18, 23, 29 조합의 6개의 프라이머 세트를 선발하였다.

1차 선발에서 선택된 6개의 프라이머 세트을 이용하여 BCRV와 유연관계 및 기주 유사관계에 있는 RpRSV (Raspberry ringspot virus), SLRSV (Strawberry latent ringspot virus), ArMV (Arabis mosaic virus) 및 PDV (Prune dwarf virus) 바이러스와의 교차반응성 유무를 확인하기 위한 2차 선발을 실시하였다(도 2). 또한, 상기 6개의 프라이머 세트가 기주식물의 게노믹 DNA에 반응하는지 알아보기 위해 PCR을 수행하였다(도 3).

상기 결과를 통해, 유연관계 및 기주 유사관계에 있는 바이러스, 그리고 기주식물의 게노믹 DNA에는 반응하지 않으면서, BCRV를 효과적으로 검출할 수 있는, 밴드의 끌림이 없으며 깔끔한 결과를 보인 4가지 프라이머 세트(조합 4, 10, 11 및 23)를 선발하였고, 선발된 프라이머 세트를 이용하여 end-point PCR(희석한계 실험)을 실시한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 10^-4까지의 민감도를 보인 조합 11의 프라이머 세트를 제외한, 조합 4, 10 및 23의 프라이머 세트는 BCRV의 게노믹 RNA에 대해 10^-5까지 검출 가능함을 보여주어, 본 발명의 상기 4개의 프라이머 세트는 검출 대상 바이러스인 BCRV에 대해 높은 민감도를 가진 프라이머임을 확인할 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Specific primer set for detecting blackberry chlorotic ringspot virus, quarantine plant virus and uses thereof <130> PN17277 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aagatgactg cgcttacatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gatggagctc aatatgggta 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aacaaccaaa gaaacgaaaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ttagctaccg gtgatgaact 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 caaatactag ggcattggag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agcgataaag aaatgcgtag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcaatcagca agttcctact 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctttgctggt ttaatttgct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tctattgagg cacgacttct 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctccaatgcc ctagtatttg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttaatatgaa cgcctcgttt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttcatcaccg gtagctaaat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttttcgtttc tttggttgtt 20

Claims (6)

1. 서열번호 1 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 2 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 4 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 세트.
2. 삭제
3. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출하기 위한 키트.
4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
5. 식물 시료에서 총 RNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 블랙베리 황백화 원형반점 바이러스(Blackberry chlorotic ringspot virus)를 특이적으로 검출하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

Images