KR101481246B1 - 수박모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수박모자이크바이러스를 검출하기 위한 4개의 등온증폭반응용 프라이머로 구성된 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 수박모자이크바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 등온증폭법을 이용하여 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 수박모자이크바이러스의 7종의 변이주를 모두 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 호박, 멜론, 수박 등의 작물의 재배농가에 막대한 피해를 주고 있는 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 수박모자이크바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

수박모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용{Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Watermelon Mosaic Virus, and use thereof}

본 발명은 수박 모자이크바이러스를 검출하기 위한 4개의 등온증폭반응용 프라이머로 구성된 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 수박모자이크바이러스의 검출방법에 관한 것이다.

수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV)는 박과 식물에 감염하는 RNA를 함유한 바이러스이다. 수박모자이크바이러스에 감염된 식물은 잎에서 모자이크 병징이 나타나고 과피가 그을음이 묻은 것처럼 되어 상품성이 현저히 떨어진다. 종래 미국, 유럽 등에서 문제가 되는 바이러스였으나, 국가간 식물체 이동이 빈번해지면서 최근 국내에서도 발병하여 생산량 감소와 품질 하락 등 피해를 일으키고 있다. 오이모자이크바이러스 등 기타 바이러스와 복합 감염되어 피해가 커지는 사례도 발생하고 있다. 주로 진딧물에 의해 전염되는데, 국내에서는 묘판과 시설하우스의 출입구 및 측창에 한냉사를 설치해 진딧물의 유입을 방지하고 약제를 살포하여 예방하고 있다. 그러나 발병 후에는 이병주를 뽑아 격리 소각하는 것 외에 방제 대책이 없는 실정이다. 기주식물 중 수박만 해도 국내 재배 면적이 25000 ha에 이르는 주요 작물인데, 수차례 감염 주의보가 내려지는 상황에서도 바이러스 자체가 박멸되지 않고 발생 빈도가 오히려 높아지고 있다.

한편, 종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다. 최근에는 바이러스를 진단하기 위하여 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 일반적으로 많이 사용하고 있으나, PCR을 이용한 진단 방법은 특이적인 프라이머(primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동(electrophoresis)으로 확인하고, 최종적으로는 염기서열 분석(DNA sequencing)을 해야 하는 일련의 과정을 거쳐야한다. 더불어 이러한 방법은 중합효소연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문 인력이 요구되며, 최종 확인을 위한 증폭산물의 염기서열 분석은 고비용 및 고기술력을 요구하는 과정이다. 또한 이러한 일련의 과정들은 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며 육안으로 식별 가능한 검출법이 아니기 때문에 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다. 이와 같이 바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해서는, 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다(한국특허등록 제0496014호).

등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소(Bst DNA polymerase)를 사용함으로써 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.

본 발명자들은 농가에서 크게 문제가 되고 있는 수박모자이크바이러스를 용이하게 검출하기 위해 연구한 결과, 현장에서 전문장비 없이 수박모자이크바이러스의 다양한 종들을 모두 검출할 수 있도록 하는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 수박모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 8 내지 11로 구성되는, 수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 수박모자이크바이러스는 GenBank accession number GQ421161.1, GQ421159.1, GQ421157.1, GQ421160.1, GQ421158.1, GQ421156.1, 및 GQ259958.1 변이주(Strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 프라이머는 변이가 극히 적은 부분을 대상으로 디자인되었으므로 이론적으로 거의 모든 변이주들을 검출 가능하다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 그러나 이 외에도 본 발명의 프라이머를 검출에 이용할 때 필요한 구성을 더 포함할 수 있다.

본 발명은

식물에서 전체 RNA(total RNA)를 추출하는 단계;

상기 전체 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계;

상기 전체 cDNA를 주형으로 상기 프라이머를 포함하는 조성물을 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및

상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV) 검출방법을 제공한다.

본 발명의 등온증폭반응을 수행하는 온도는 가장 바람직하게는 62℃가 된다.

수박모자이크바이러스가 감염할 수 있는 식물의 예로는 색동호박, 참외, 오이, 수박, 몇몇 콩류 등이 현재까지 밝혀져 있으나, 이에 제한되지 않고 감염이 의심되는 식물에는 모두 적용 가능하다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 수박모자이크바이러스는 GenBank accession number GQ421161.1, GQ421159.1, GQ421157.1, GQ421160.1, GQ421158.1, GQ421156.1, 및 GQ259958.1 변이주(Strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 수박모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물 및 이를 이용한 검출방법을 이용하면, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 수박모자이크바이러스를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 수박, 오이, 멜론 등의 작물 재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 수박모자이크바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 프라이머 제작에 사용된 WMV의 coat protein의 서열을 의미한다.
도 2 는 7종류의 WMV 유전자 서열간의 공통부분을 검색하고 검색 부위를 위주로 PrimerExplorer V4를 이용하여 프라이머 세트를 작성한 것을 나타낸 도이다.
도 3 은 본 발명의 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 4 는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 SYBR Green I을 이용하여 자연광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6 은 상기 도 4에서와 동일한 증폭산물을 UV 광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

본 발명자들은 수박모자이크바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 프라이머 세트는 전체 바이러스 서열이 아닌 coat protein(virion protein)의 서열을 주형으로 하여 제작하였다. coat protein은 바이러스가 하나의 개체로 만들어지기 위해 반드시 필요한 단백질로 바이러스 종에 따라서는 식물체 내에서 바이러스가 세포간의 이동을 할 때에도 관여한다고 알려져 있다. 즉 coat protein 은 바이러스가 감염되었다면 무조건 생성되는 단백질이기 때문에 주형으로 사용한 것이다. 본 발명이 검출할 수 있는 변이주들의 Genbank number는 그 바이러스 변이주의 full sequence를 나타낸다. 한편 본 발명의 프라이머 제작에 실제로 이용한 각 변이주들의 coat protein coding region의 sequence에 대해서는 서열목록에 첨부하였다.

본 발명은 서열번호 8 내지 11로 구성되는 수박모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명자들은 단시간 내에 전문장비 없이 수박모자이크바이러스를 검출하기 위하여 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하였다. 등온증폭법은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP는 3 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.

또한 본 발명은 식물에서 전체 RNA를 추출하는 단계; 상기 전체 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로 본 발명의 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 포함하는 조성물을 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 수박모자이크바이러스의 검출방법을 제공한다. 감염이 의심되는 수박 등으로부터 직접 RNA를 추출할 수도 있지만, 연구목적으로 인위적으로 감염시킨 검체 및 배양 세포 등에도 적용가능하다. 수박모자이크바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에, 식물에서 total RNA를 추출한 후 역전사반응(Reverse transcription)으로 cDNA를 합성한 후 프라이머를 이용하여 이를 증폭하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 universal 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭법을 수행하여 수박모자이크바이러스를 검출 가능하다는 것을 확인하였으며, 또한 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하면 전기영동 등의 과정을 거치지 않고 자연광하에서 육안으로 검출 가능하다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 수박모자이크바이러스 유전자 수집

농촌진흥청으로부터 수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV)에 자연적으로 감염된 수박(Citrullus vulgaris Schard)을 채취한 것을 받아와 시료로 하여서 실험을 진행하였다.

본 발명에서 이용된 등온증폭용 프라이머는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)로부터 기존에 보고된 WMV의 7가지 주(strain)와 각각의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호 (GenBank accession number): GQ421161.1, GQ421159.1, GQ421157.1, GQ421160.1, GQ421158.1, GQ421156.1, GQ259958.1)의 분석을 통해 유사염기서열을 포함하는 부분을 중심으로 작성하였다.

실시예 2. 프라이머 작성

WMV를 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 통하여 검출하기 위하여 프라이머(primer)를 PrimerExplorer V4를 이용하여 작성하였다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 알려진 모든 종류의 WMV를 검출하기 위하여 7종류의 유전자 서열간의 공통부분을 검색하고 검색 부위를 위주로 PrimerExplorer V4를 이용하여 프라이머를 작성하였다(도 2). 도 3에 나타난 바와 같이, WMV의 모든 주의 바이러스에 모두 적용될 것으로 예상되는 프라이머 세트(universal primer set)를 제작하였다.

실시예 3. 식물 검체의 채집

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 WMV를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 식물 검체를 채집하였다. 본 발명에서는 바이러스에 감염된 식물시료로부터 total RNA를 분리한 후 역전사반응(Reverse transcription)을 통해 total cDNA를 합성하였다.

total RNA 분리에 사용할 추출 버퍼(extraction buffer)는 MRC사의 TRI REAGENT(카탈로그 번호 : TR 118)을 이용하였다. 식물조직을 막자사발에 담고 액체질소를 넣은 후, 질소가 증발하면 즉시 조직을 고운 가루가 될 정도로 갈고 미리 액체질소에서 냉각시킨 약수저(spatula)를 사용하여 상기 조직을 추출 버퍼가 1 ml 들어있는 튜브에 옮겨 담았다. 가루로 된 조직을 넣은 후 튜브 뚜껑을 닫고 4 ℃에 5분간 반응시킨 후 200 ul의 클로로포름(chloroform)을 넣고 15초 동안 심하게 흔들어 준 다음 실온에서 10분 이상 반응시켰다. 반응시킨 후 4 ℃, 8,000 × g의 조건에서 10분간 원심분리 한 후에 피펫(pipette)을 사용하여 상층액 500 ul만 수거하여 조심스럽게 새 튜브에 옮긴 다음 상층액과 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣어 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 반응시킨 튜브를 4 ℃, 8,000 × g의 조건에서 10분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전물(pellet)을 에탄올(ethanol)과 DEPC treated water(0.1% diethyl pyrocarbonate 수용액)이 7.5:2.5 비율로 혼합된 용액으로 세척하고 다시 4 ℃, 8,000 × g의 조건에서 10분간 원심분리 한 후에 상층액을 제거하여 튜브를 시험관 거치대에 거꾸로 방치하여 건조시킨 후 RNA pellet을 DEPC treated water 30 ul에 녹였다. 분광 광도계(spectrophotometer)를 통해 추출한 RNA의 농도를 측정하였다.

위 실험을 통해 얻은 total RNA를 토대로 cDNA를 합성하기 위해 역전사반응을 수행하였다. 역전사반응은 M-MLV Reverse Transcriptase (BIONEER)와 random 프라이머로 제조사의 지시사항에 따라 증폭하였다. 역전사반응은 3 단계 방법(3-step method)로 수행하였으며, total RNA와 random 프라이머를 넣은 튜브를 70 ℃에서 10분 반응시킨 후, 온도를 4 ℃로 낮춰 dNTP와 buffer를 넣은 후 37 ℃에서 10분간 반응시킨후, 온도를 4 ℃로 낮춰 M-MLV Reverse Transcriptase를 넣어준 후, 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 마지막으로 70 ℃에서 10 분간 효소 억제 과정을 시켜 주었다.

실시예 4. 등온증폭법의 시행 및 유용성 확인

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 WMV를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 증폭반응용 프라이머 조성물을 제조하였다.

상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 2 uL의 10배(10X) Bst 중합효소(polymerase) 반응버퍼(20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 2 mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100), 1.6 ul의 10 mM dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, dCTP 각각 10 mM씩 섞인 혼합물), 0.4 ul의 10 uM F3와 B3 프라이머, 1.6 ul의 10 uM FIP와 BIP 프라이머, 1 ul의 20 mM MgSO₄, 1 ul(8 Unit) Bst 중합효소, 1/10 희석한 주형 cDNA 1 ul, 및 증류수 11.5 ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 40 ℃에서 30초 동안 반응 시킨후 62 ℃ 반응 용기에서 1시간 30분 동안 반응시켜 등온증폭하였다. 반응이 완료된 후에 80 ℃에서 5분간 효소활성을 억제시켜주었다. 총 20 ul의 반응물 중 5 ul를 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, universal primer set를 사용한 경우에 주형으로 WMV와 함께 다른 3가지 식물 바이러스(순무황화모자이크바이러스(Turnip yellow mosaic virus; TYMV), 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2), 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus ; SqMV))와 함께 등온증폭법을 시행하여 특이적으로 WMV만 검출해 내는지 실험하였다. 바이러스 유전자를 넣지 않은 (lane 5) 경우 유전자가 증폭되지 않았다. WMV(lane 4)를 주형으로 이용한 경우에는 WMV 유전자가 증폭었으나 다른 종류의 바이러스(lane 1 ~ lane 3)에서는 유전자가 증폭되지 않았다.

이후 동일한 반응물로 1,000배로 농축된 SYBR Green I을 반응물 20 ul 당 1 ul씩 첨가하여 자연광에서 발색 반응을 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었고, 자외선 상에서 발색반응을 확인한 결과는 도 6에 나타내었다. 상기 바이러스 유전자의 증폭된 양상을 관찰한 전기영동 결과와 SYBR Green I을 이용하여 확인한 결과를 비교하여 유의성을 검증하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, SYBR Green I을 고농도로 농축하여 증폭된 유전자(universal primer set sample)를 염색한 경우에도 WMV에 감염된 감염주에서 유전자가 증폭되어 자연광하에서 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있었으며, 다른 바이러스에 감염된 샘플에서는 녹색을 띠지 않은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 도 6에 나타낸 것과 같이 자외선 상에서 녹색 형광으로 발색 결과를 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여 본 실험에 사용된 프라이머 세트는 WMV에만 특이적으로 검출하는데 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 SYBR GreenI을 10,000배로 농축하여 사용할 경우 자연광하에서 육안으로 감염여부를 확인할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Watermelon Mosaic Virus, and use thereof <130> PB12-11095 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 831 <212> RNA <213> coat protein coding region of WMV GQ421161.1 strain <400> 1 gtggaaaatt tggatgcagg aaaggactcg aagaaagaca ccagtggcaa aggtgacaag 60 ccgcaaaact cacaaaccgg gcagggtagc aaggaaccaa caaaaactgg cacagtcagc 120 aaagatgtga acgttgggtc gaaaggaaaa gtagtcccac gattgcaaaa gataacaaag 180 aaaatgaacc ttccaacagt tgatgggaaa atcatactta gcttagacca tttgcttgag 240 tacaaaccta atcaagtsga tttgtttaac actcgagcaa caaagacaca gtttgaatca 300 tggtatagcg cggttaaagc tgaatatgat ctcaatgatg agcaaatggg tgtgattatg 360 aatggtttta tggtttggtg tatcgacaat ggtacatctc cagatgttaa tggagtttgg 420 gtgatgatgg atggggaaga gcaagttgag tacccattaa agccaattgt cgaaaatgca 480 aagccaactt taaggcaaat catgcaccat ttttcagacg cagcagaagc atatattgaa 540 atgagaaact ctgaaagtcc 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tatcgataac ggtacatctc cagatgtcaa tggagtttgg 420 gtgatgatgg atggggaaga gcaagttgag tatccattaa agccaattgt tgaaaatgca 480 aaaccaactt taagacaaat catgcaccat ttctcagacg cagcagaagc atatattgaa 540 atgagaaact ctgaaagtcc gtatatgcct agatacggat tactaagaaa tttgagagac 600 agggaattag cacgctatgc ttttgacttt tatgaggtta cttccaaaac acctaatagg 660 gcaagagaag caatagcaca aatgaaggcc gcagctctcg cgggaattaa cagcaggtta 720 tttgggcttg atggtaatat ctcgaccaat tccgaaaata ctgagaggca cactgcaagg 780 gacgtgaatc agaatatgca tactttgttg ggtatgggtc caccgcagta a 831 <210> 5 <211> 831 <212> RNA <213> coat protein coding region of WMV GQ421158.1 strain <400> 5 gtagaaaatt tggatgcagg gaaggacttg aagaaggaca ccagtggcaa aggggataag 60 tcacaaaact cacaagctgg ccaaggtagc aaagaacaga caaaaactgg cacagtcagc 120 aaagatgtga atgttggatc gaaaggaaaa gaagtcccac gactacaaaa gataacaaag 180 aaaatgaacc ttccaacagt tggtggaaaa atcattctta gcttagacca tttactcgag 240 tacaaaccta atcaagttga tttgtttaat actcgagcaa caaaaacaca gtttgaatca 300 tggtatagcg cagttaaagt 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tctgtttaac actcgagcaa caaaaacaca gtttgaatca 300 tggtacagcg cagttaaagt tgaatatgat cttaacgatg agcaaatggg tgtgattatg 360 aatggtttta tggtttggtg tatcgataac ggtacatctc cagatgtcaa tggagtttgg 420 gtgatgatgg atggggaaga gcaagttgag tatccattaa agccaattgt tgaaaatgca 480 aaaccaactt taagacaaat catgcaccat ttctcagacg cagcagaagc atatattgaa 540 atgagaaact ctgaaagtcc gtatatgcct agatacggat tactaagaaa tttgagagac 600 agggaattag cacgctatgc ttttgacttt tatgaggtta cttccaaaac acctaatagg 660 gcaagagaag caatagcaca aatgaaggcc gcagctctcg cgggaattaa cagcaggtta 720 tttgggcttg atggtaatat ctcgaccaat tccgaaaata ctgagaggca cactgcaagg 780 gacgtgaatc agaatatgca tactttgttg ggtatgggtc caccgcagta a 831 <210> 7 <211> 753 <212> RNA <213> coat protein coding region of WMV GQ259958.1 strain <400> 7 ggtcaaggta gcaaagaaca gacaaaaact ggcacagtca gcaaagatgt gaatgttgga 60 tcgaaaggaa aagaagtccc acgactacaa aagataacaa agaaaatgaa ccttccaaca 120 gttggtggga aaatcattct tagcttagac catttgctcg agtacaaacc taatcaagtt 180 gatctgttta acactcgagc aacaaaaaca cagtttgaat catggtacag cgcagttaaa 240 gttgaatatg atcttaacga tgagcaaatg ggtgtgatta tgaatggttt tatggtttgg 300 tgtatcgata acggtacatc tccagatgtc aatggagttt gggtgatgat ggatggggaa 360 gagcaagttg agtatccatt aaagccaatt gttgaaaatg caaaaccaac tttaagacaa 420 atcatgcacc atttctcaga cgcagcagaa gcatatattg aaatgagaaa ttctgaaagt 480 ccgtatatgc ctagatacgg attactaaga aatttgagag acagggaatt agcacgctat 540 gcttttgatt tttatgaggt tacttccaaa acacctaata gggcaagaga agcaatagca 600 caaatgaagg ccgcagctct cgcgggaatt aacagcaggt tatttgggct tgatggtaat 660 atctcgacca attccgaaaa tactgagagg cacactgcaa gggacgtgaa tcagaatatg 720 catactttgt tgggtatggg tccaccgcag taa 753 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer F3 <400> 8 tgggtgtgat tatgaatggt t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer B3 <400> 9 cggactttca gagtttctca t 21 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer FIP <400> 10 tccatcatca cccaaactcc atggtttggt gtatcgataa cg 42 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer BIP <400> 11 taaagccaat tgttgaaaat gcgatatgct tctgctgcgt ct 42

Claims (8)

1. 수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트로서,
   상기 프라이머 세트는 서열번호 8 내지 11로 구성되고,
   상기 수박모자이크바이러스는 GenBank accession number GQ421161.1 또는 GQ421158.1 변이주인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
   
2. 삭제
3. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서,
   상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 하기의 단계를 포함하는, 수박모자이크바이러스(Watermelon Mosaic Virus, WMV) 변이주 GenBank accession number GQ421161.1 또는 GQ421158.1의 검출방법:
   식물에서 전체 RNA(total RNA)를 추출하는 단계,
   상기 전체 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계,
   상기 cDNA를 주형으로 제 3 항에 따른 조성물을 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계, 및
   상기 증폭된 산물을 검출하는 단계.
   
6. 삭제
7. 제 5항에 있어서,
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
   

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