KR101481245B1 - 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 4개의 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 스쿼시모자이크바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트를 사용하면 등온증폭법을 이용하여 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 스쿼시모자이크바이러스의 5종의 변이주를 모두 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 호박, 멜론, 수박 등의 작물의 재배농가에 막대한 피해를 주고 있는 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 스쿼시모자이크바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물, 및 이의 이용{Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Squash Mosaic Virus, and use thereof}

본 발명은 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 4개의 등온증폭반응용 프라이머로 구성된 세트, 이를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 이용한 스쿼시모자이크바이러스의 검출방법에 관한 것이다.

스쿼시모자이크바이러스는 오이, 호박, 멜론 등에 감염하는 RNA를 함유한 바이러스이다. 기주 범위는 박과 식물과 명아주과 식물(Chenopodiaceae) 일부로 한정되어 있다.

스쿼시모자이크바이러스에 감염된 식물은 잎이 축엽되며 발육 장애를 보이고 과실이 기형이 된다. 변이주(Strain)가 다양한데, 변이주별로 가장 심한 증상을 보이는 식물이 다르다. 예를 들어 Strain 1은 감염된 멜론에서 심한 증상을 일으키나, 호박(Squash)에서는 좀 더 약한 증상을 일으킨다. 오이 딱정벌레(Cucumber Beetles) 또는 감염된 종자에 의해 전파된다. 오이 딱정벌레는 감염 식물을 5분간 섭취한 경우에도 바이러스를 체내에 20일간 지닐 수 있어 강력한 전염원으로 작용한다. 종래 미국, 유럽 등에서 문제가 되는 바이러스였으나, 국가간 식물체 이동이 빈번해지면서 최근 국내에서도 발명하여 생산량 감소와 품질 하락 등 피해를 일으키고 있다. 그러나 피해 증상이 양분결핍이나 과실이 어릴 때 벌레가 파먹은 흔적(식흔)과 유사하여 농가에서 병징을 잘못 판단하여 잘못된 약제를 뿌려 경제적 손실이 이중으로 발생하는 경우가 종종 발생하고 있으며, 오이모자이크바이러스 등 기타 바이러스와 복합 감염되어 피해가 커지는 사례도 발생하고 있다.

한편, 종래의 바이러스 진단법으로는 전자현미경 또는 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태학적 특징으로 종을 진단하는 것은 거의 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 방법은 가장 일반적으로 사용되는 진단 방법이나 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 정확한 진단이 실패하는 경우가 자주 발생한다. 최근에는 바이러스를 진단하기 위하여 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 PCR 방법을 일반적으로 많이 사용하고 있으나, PCR을 이용한 진단 방법은 특이적인 프라이머(primer)의 개발이 매우 중요하며, 증폭된 반응산물을 전기영동(electrophoresis)으로 확인하고, 최종적으로는 염기서열 분석(DNA sequencing)을 해야 하는 일련의 과정을 거쳐야한다. 더불어 이러한 방법은 중합효소연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문 인력이 요구되며, 최종 확인을 위한 증폭산물의 염기서열 분석은 고비용 및 고기술력을 요구하는 과정이다. 또한 이러한 일련의 과정들은 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되며 육안으로 식별 가능한 검출법이 아니기 때문에 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다. 이와 같이 바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해서는, 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다(한국특허공개번호 제10-2010-0125766호).

등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하나 기존 PCR 방법은 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭법은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소(Bst DNA polymerase)를 사용함으로서 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭법은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.

본 발명자들은 농가에서 크게 문제가 되고 있는 스쿼시모자이크바이러스를 용이하게 검출하기 위해 연구한 결과, 현장에서 전문장비 없이 스쿼시모자이크바이러스의 다양한 종들을 모두 검출할 수 있도록 하는 등온증폭반응용 프라이머 세트를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 6 내지 9로 구성되는, 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus, SqMV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 스쿼시모자이크바이러스는 GenBank accession number AF059532.1, AF059533.1, EU421060.1, NC_003800, 및 AB054689.1 변이주(Strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 프라이머는 변이가 극히 적은 부분을 대상으로 디자인되었으므로 이론적으로 거의 모든 변이주들을 검출 가능하다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus, SqMV) 를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 그러나 이 외에도 본 발명의 프라이머를 검출에 이용할 때 필요한 구성을 더 포함할 수 있다.

본 발명은

식물에서 전체 RNA(total RNA)를 추출하는 단계;

상기 전체 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계;

상기 전체 cDNA를 주형으로 상기 프라이머를 포함하는 조성물을 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및

상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus, SqMV) 검출방법을 제공한다.

본 발명의 등온증폭반응을 수행하는 온도는 가장 바람직하게는 62℃가 된다.

스쿼시모자이크바이러스가 감염할 수 있는 식물의 예로는 참외, 사프란, 색동호박, 호박, 유자, 명아주, 수박, 백합 등이 현재까지 밝혀져 있으나, 이에 제한되지 않고 감염이 의심되는 식물에는 모두 적용 가능하다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 스쿼시모자이크바이러스는 GenBank accession number AF059532.1, AF059533.1, EU421060.1, NC_003800, 및 AB054689.1 변이주 변이주(Strain)로 이루어진 군로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물 및 이를 이용한 검출방법을 이용하면, 식물 검체로부터 단시간 내에 전문장비 없이 효과적으로 오이모자이크바이러스를 검출할 수 있다. 또한 고농도의 SYBR Green I을 이용하여 자연광하에서 육안으로 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 수박, 호박, 오이, 멜론 등의 작물 재배농가에 막대한 피해를 줄 수 있는 바이러스를 조기에 검출 가능하게 하여 보다 신속하고 효율적인 스쿼시모자이크바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 바이러스 감염으로 인한 경제적 손실을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 프라이머 제작에 사용된 SqMV의 polyprotein의 서열을 의미한다.
도 2 는 5종류의 SqMV 유전자 서열간의 공통부분을 검색하고 검색 부위를 위주로 PrimerExplorer V4를 이용하여 프라이머 세트를 작성한 것을 나타낸 도이다.
도 3 은 본 발명의 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 도이다.
도 4 는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 전기영동으로 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5 는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 유전자를 SYBR Green I을 이용하여 자연광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 6 은 상기 도 4에서와 동일한 증폭산물을 UV 광원 하에서 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

본 발명자들은 스쿼시모자이크바이러스를 단시간 내에 효과적으로 검출하기 위해 전문장비 없이 현장에서 실시간으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 서열번호 6 내지 9로 구성되는 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트는 전체 바이러스 서열이 아닌 polyprotein의 서열을 주형으로 하여 제작하였다. 스쿼시모자이크바이러스는 전체 genome 길이와 거의 유사할 정도로 거대한 polyprotein 이라는 단백질을 만들어내는데, 만들어진 polyprotein이 조각조각 잘리면서 여러 역할을 하는 다양한 단백질이 생성되게 된다. 즉 polyprotein 은 바이러스가 감염되었다면 무조건 생성되는 단백질이기 때문에 주형으로 사용한 것이다. 본 발명이 검출할 수 있는 변이주들의 Genbank number는 그 바이러스 변이주의 full sequence를 나타낸다. 한편 본 발명의 프라이머 제작에 실제로 이용한 각 변이주들의 polyprotein coding region의 sequence에 대해서는 서열목록에 첨부하였다.

본 발명자들은 단시간 내에 전문장비 없이 스쿼시모자이크바이러스를 검출하기 위하여 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하였다. 등온증폭법은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 이중 F3와 FIP는 유전자의 5 방향에 결합하는 프라이머이며, B3와 BIP는 3 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한 FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.

또한 본 발명은 식물에서 전체 RNA를 추출하는 단계; 상기 전체 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로 본 발명의 프라이머 세트, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 포함하는 조성물을 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 스쿼시모자이크바이러스의 검출방법을 제공한다. 감염이 의심되는 호박 등으로부터 직접 RNA를 추출할 수도 있지만, 연구목적으로 인위적으로 감염시킨 검체 및 배양 세포 등에도 적용가능하다. 스쿼시모자이크바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에, 식물에서 total RNA를 추출한 후 역전사반응(Reverse transcription)으로 cDNA를 합성한 후 프라이머를 이용하여 이를 증폭하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 universal 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭법을 수행하여 스쿼시모자이크바이러스를 검출 가능하다는 것을 확인하였으며, 또한 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하면 전기영동 등의 과정을 거치지 않고 자연광하에서 육안으로 검출 가능하다는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 스쿼시모자이크바이러스 유전자 수집

농촌진흥청으로부터 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus, SqMV)가 감염된 것으로 확인된 멜론(Cucumis melo)을 채취한 것을 받아와 시료로 하여서 실험을 진행하였다.

본 발명에서 이용된 등온증폭용 프라이머는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)로부터 기존에 보고된 SqMV의 5가지 주(strain)와 각각의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호 (GenBank accession number): AF059532.1, AF059533.1, EU421060.1, NC_003800, 및 AB054689.1)의 분석을 통해 유사염기서열을 포함하는 부분을 중심으로 작성하였다.

실시예 2. 프라이머 작성

SqMV를 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)을 통하여 검출하기 위하여 프라이머(primer)를 PrimerExplorer V4를 이용하여 작성하였다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 하는데, 알려진 모든 종류의 SqMV를 검출하기 위하여 5종류의 SqMV 유전자 서열간의 공통부분을 검색하고 검색 부위를 위주로 PrimerExplorer V4를 이용하여 프라이머를 작성하였다(도 2). 도 3에 나타난 바와 같이, SqMV의 모든 주의 바이러스에 모두 적용될 것으로 예상되는 프라이머 세트(universal primer set)를 제작하였다.

실시예 3. 식물 검체의 채집

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 SqMV를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 식물 검체를 채집하였다. 본 발명에서는 바이러스에 감염된 식물시료로부터 total RNA를 분리한 후 역전사반응(Reverse transcription)을 통해 total cDNA를 합성하였다.

total RNA 분리에 사용할 추출 버퍼(extraction buffer)는 MRC사의 TRI REAGENT(카탈로그 번호 : TR 118)을 이용하였다. 식물조직을 막자사발에 담고 액체질소를 넣은 후, 질소가 증발하면 즉시 조직을 고운 가루가 될 정도로 갈고 미리 액체질소에서 냉각시킨 약수저(spatula)를 사용하여 상기 조직을 추출 버퍼가 1 ml 들어있는 튜브에 옮겨 담았다. 가루로 된 조직을 넣은 후 튜브 뚜껑을 닫고 4 ℃에 5분간 반응시킨 후 200 ul의 클로로포름(chloroform)을 넣고 15초 동안 심하게 흔들어 준 다음 실온에서 10분 이상 반응시켰다. 반응시킨 후 4 ℃, 8,000 × g의 조건에서 10분간 원심분리한 후에 피펫(pipette)을 사용하여 상층액 500 ul만 수거하여 조심스럽게 새 튜브에 옮긴 다음 상층액과 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣어 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 반응시킨 튜브를 4 ℃, 8,000 × g의 조건에서 10분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전물(pellet)을 에탄올(ethanol)과 DEPC treated water(0.1% diethyl pyrocarbonate 수용액)이 7.5:2.5 비율로 혼합된 용액으로 세척하고 다시 4 ℃, 8,000 × g의 조건에서 10분간 원심분리 한 후에 상층액을 제거하여 튜브를 시험관 거치대에 거꾸로 방치하여 건조시킨 후 RNA pellet을 DEPC treated water 30 ul에 녹였다. 분광 광도계(spectrophotometer)를 통해 추출한 RNA의 농도를 측정하였다.

위 실험을 통해 얻은 total RNA를 토대로 cDNA를 합성하기 위해 역전사반응을 수행하였다. 역전사반응은 M-MLV Reverse Transcriptase (BIONEER)와 random 프라이머로 제조사의 지시사항에 따라 증폭하였다. RT-PCR은 3 단계 방법(3-step method)로 수행하였으며, total RNA와 random 프라이머를 넣은 튜브를 70 ℃에서 10분 반응시킨 후, 온도를 4 ℃로 낮춰 dNTP와 buffer를 넣은 후 37 ℃에서 10분간 반응시킨후, 온도를 4 ℃로 낮춰 M-MLV Reverse Transcriptase를 넣어준 후, 37 ℃에서 1시간동안 반응시킨 후, 마지막으로 70 ℃에서 10 분간 효소 억제 과정을 시켜 주었다.

실시예 4. 등온증폭법의 시행 및 유용성 확인

실시예 2에서 제작된 프라이머 세트를 SqMV를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, 증폭반응용 프라이머 조성물을 제조하였다.

상기 프라이머 조성물의 제조를 위하여 2 uL의 10배(10X) Bst 중합효소(polymerase) 반응버퍼(20 mM Tris-HCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 2mM MgSO₄, 0.1% Triton X-100), 1.6 ul의 10 mM dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, dCTP 각각 10 mM씩 섞인 혼합물), 0.4 ul의 10 uM F3와 B3 프라이머, 1.6 ul의 10 uM FIP와 BIP 프라이머, 1 ul의 20 mM MgSO₄, 1 ul(8 Unit) Bst 중합효소, 1/10 희석한 주형 cDNA 1 ul, 및 증류수 11.5 ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 40 ℃에서 30초 동안 반응 시킨 후 62 ℃ 반응 용기에서 1시간 30분 동안 반응시켜 등온증폭하였다. 반응이 완료된 후에 80 ℃에서 5분간 효소활성을 억제 시켜주었다. 총 20 ul의 반응물 중 5 ul를 전기영동(electrophoresis)하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, universal primer set를 사용한 경우에 주형으로 SqMV와 함께 다른 4가지 식물 바이러스(순무황화모자이크바이러스(Turnip yellow mosaic virus; TYMV), 잠두위조바이러스2(Broad bean wilt virus 2; BBWV2), 사탕무황화바이러스(Beet western yellows virus; BWYV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus , CMV))와 함께 등온증폭법을 시행하여 특이적으로 SqMV만 검출해 내는지 실험하였다. 바이러스 유전자를 넣지 않은 (lane 6) 경우 유전자가 증폭되지 않았다. SqMV(lane 5)를 주형으로 이용한 경우에는 SqMV 유전자가 증폭되었으나 다른 종류의 바이러스(lane 1 ~ lane 4)에서는 유전자가 증폭되지 않았다.

이후 동일한 반응물로 1,000배로 농축된 SYBR Green I을 반응물 20 ul 당 1 ul씩 첨가하여 자연광에서 발색 반응을 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었고, 자외선 상에서 발색반응을 확인한 결과는 도 6에 나타내었다. 상기 바이러스 유전자의 증폭된 양상을 관찰한 전기영동 결과와 SYBR Green I을 이용하여 확인한 결과를 비교하여 유의성을 검증하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, SYBR Green I을 고농도로 농축하여 증폭된 유전자(universal primer set sample)를 염색한 경우에도 SqMV에 감염된 감염주에서 유전자가 증폭되어 자연광하에서 녹색을 띠는 것을 확인할 수 있었으며, 다른 바이러스에 감염된 샘플에서는 녹색을 띠지 않은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 도 6에 나타낸 것과 같이 자외선 상에서 녹색 형광으로 발색 결과를 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여 본 실험에 사용된 프라이머 세트는 SqMV에만 특이적으로 검출하는데 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 SYBR GreenI을 10,000배로 농축하여 사용할 경우 자연광하에서 육안으로 감염여부를 확인할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Primer composition for loop-mediated isothermal amplification reaction for detecting Squash Mosaic Virus, and use thereof <130> PB12-11094 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2763 <212> RNA <213> polyprotein coding region of SqMV AF059532.1 strain <400> 1 atggaagtga ttcagaagga aggtttggct gcttcagcac ttaaggataa ggagcgactg 60 gccgaaaaag ctgtggtcaa tcagcccctg agtaacttga ttcctcattc aaataaaatg 120 tatgagcgaa gtaagagtct tctatctggt ctcaagcgtg gtttgataaa gcaaaaagag 180 gtagcttttg ataagctcat ggggggttcg acaatagact tccagcatat tccaaccgga 240 actctcacac ctggtgagaa taaggtgcta gatataccaa ttgtcccgca acatttattg 300 accagtacga atataacgga ttaccatcag gccaataata agagtgctaa tggtgctact 360 gcacttcatg ttggagctat agaagtcatc ttagattgct ttacctctcc tgatagtaac 420 atttgtggtg gtatgttgct ggttgataca gcacatttaa acccggataa tgctataaga 480 agtgtttttg tcgcgccatt tattggtggt cgccctattc gagttttgtt gtttccagac 540 actttggtgg aaattgcccc aaacatgaat 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cgcccttaga aagtacagcc 2280 ccacaaaatt ttgcgagttt tactgctgat ttaatggaat ccacagtgag tggggattct 2340 actggaaatt ggagtattac agcttatccg agtcctatat ccaatttgtt gaaagtggct 2400 gcttggaaga aggggacaat aagattccaa ctcatttgcc ggggtgctgc cgttaagcaa 2460 tccgattggg ctgcgtcagc cagaatagac ttggtcaata acctctcaaa taaagcttta 2520 cctgcgcgct cttggtatat tactaagcca cgaggaggtg atatcgagtt tgacttggaa 2580 atagcggggc caaataatgg ttttgaaatg gccaattcca gttgggcttt ccagactaca 2640 tggtatttgg aaattgccat agacaaccct aagcaattca ctcttttcga gttaaatgct 2700 tgtcttatgg aagactttga agtggctgga aacaccttaa acccacctat tttactttct 2760 tag 2763 <210> 2 <211> 3030 <212> RNA <213> polyprotein coding region of SqMV AF059533.1 strain <400> 2 atgtggcatt tctgcgaaca agtttacgag tgttttgagg gttaccatag agactactct 60 gttcaaacgg tccccgtgga atacttagcc tcacactata ttgtcaacaa gtttagaccc 120 gaccctctag ctgttttgtg gcttttctgt ttggggattt ggtgggagat tattcagata 180 ctccatcatc tatttcagta taaggaacca gcactttttg ttggcagttg tcaaaatctt 240 gctgcttttt tagaggaaaa gtactccatg gaagtgattc aaaaggaagg cttggctgct 300 tcggcactca aggacaagga gcgattgacc gaaaaagctg tggtcaatca acccctgagt 360 aatttaattc cccattcgaa taaaatgtat gagcgaagta agagtctcct atctggtctt 420 aagcgtggtt tgataaagca aaaagagata gcttttgaca agctcatggg aggttcaaca 480 attgatttcc agcatatccc aacaggaact ctcacacctg gtgagaacaa agtgctagac 540 ataccaattg ttccacagca tttgttgact agtacaaata taacagatta ccaccaggct 600 aacaagaaaa atgctaatgg tgctactgca ctccatgttg gggctataga ggtcattatg 660 gattgcttca cctctcctga tagtaatatt tgtggtggca tgctgttggt tgatacagca 720 catctaaatc cggataatgc cataagaagc gtgttcgttg cgccatttat aggtggtcgt 780 cctattcgag ttttgctatt tccagacacc ttggtggaga ttgccccgaa catgaactcc 840 cgattcaaat tgctatgtac tacgagtaac ggcgatgttg caccagattt taatttggcg 900 atggtcaaag tcaacgttgc aggttgtgct gttagtttga ctaagacata cactcctaca 960 gcttatctcg agcaagagtt aatcaaagaa aagggggcca ttgtccaata tttgaacagg 1020 cacaccttct ctatgcatcg gaacaatcag atgacaaagg aagagatgca aaagcagcgc 1080 ctatctttta gattggaaag tgctctcact ttgcaggaaa agcatccttt gcacgccact 1140 ttctgcaaat caactaactt tgtttacaag attggtgggg atgcaaaaga gggcagcaat 1200 ggcaatctaa ctgttaatga aagccaattg tcctcacact ctccttctgc acatgttttg 1260 cacaagcaca acaacagtgg tgacaatgaa gtagagttct cagaaattgg tgtagttgta 1320 ccaggtgctg gcagaaccaa ggcttatggc caaaatgagc tagatcttgc gcaactttct 1380 ctggacgaca ccagttctct tcgtggaact gcgttgcaga ccaaactggc cacgtcccgt 1440 atcattttga gtaagacaat ggttggaaat actgtgctca gggaggattt gcttgccacc 1500 tttttgcaag atagcaatga gagggccgct atagatttga ttcgcaccca tgtcattaga 1560 ggcaaaatac gctgtgttgc ttctatcaat gttccagaaa atacaggttg tgcattagct 1620 atctgtttca acagtggcat aacaggagct gcagatacag acatttatac cacaagttct 1680 caggatgcca ttgtgtggaa tcctgcttgc gagaaagctg ttgagttgac attcaacccc 1740 aatccttgtg gtgatgcttg gaattttgtg tttctgcaac aaacaaaggc acattttgcc 1800 gttcagtgtg tgaccgggtg gactacaacg ccacttacag atttagcgtt ggtgcttaca 1860 tggcacattg atagaagctt gtgtgtgccc aaaactttga caattagctc tgcacatgct 1920 tcttttccaa taaatcgttg gatgggaaag ttgtcctttc cgcaagggcc tgcgcgtgtt 1980 cttaagagga tgcccttggc cattggtggc ggggctggta ccaaagatgc tatcttgatg 2040 aatatgccaa acgctgttat ttcacttcat cgatatttta gaggggattt tgtctttgaa 2100 ataacaaaga tgagttctcc ttatatcaag gcaaccattg ctttctttat agcgtttggt 2160 gatattacgg aggaaatgac taacttggag agttttcccc acaagcttgt gcagtttgct 2220 gaaattcagg ggcgcactac cataacgttc acgcaaagcg aatttttgac ggcatggtct 2280 acacaagtat taagcactgt tgatcctcag aaagatgggt gtccccactt gtatgcactc 2340 ttgcacgatt ctgctacgtc aaccattgaa ggaaattttg tcattggtgt taaattgctg 2400 gatattagga actatcgtgc ttacggccat aaccctggtt ttgagggagc tcgcttacta 2460 ggaatttctg ggcagagtac catggtacag cagcttggaa cttataatcc aatctggatg 2520 gttcgtacgc ccttagaaag tacagcccaa cagaattttg cgagtttcac tgctgatttg 2580 atggaatcca cgataagtgg ggactctacc ggaaattgga atattacagt ttacccgagt 2640 cctatagcta atttattgaa agtggctgct tggaagaaag ggactataag atttcaactt 2700 atttgtcggg gtgctgctgt taagcagtct gactgggctg cgtcagctag aatagacttg 2760 attaacaacc tctcgaacaa agctttaccc gcacgttcct ggtacattac taagccacga 2820 ggaggcgaca tcgagtttga cttagagata gcgggaccaa acaatggttt cgaaatggcg 2880 aactccagtt gggctttcca gaccacatgg tatttggaaa ttgccataga caatcctaag 2940 caattcactc tttttgagtt aaatgcttgt cttatggaag actttgaagt ggctggaaat 3000 actttaaatc cacctatttt gctttcatag 3030 <210> 3 <211> 2763 <212> RNA <213> polyprotein coding region of SqMV EU421060.1 strain <400> 3 atggaagtga ttcagaagga aggtttggct gcttcagcac tcaaggataa ggagcgactg 60 gccgaaaaag ctgtggtcaa tcagcccctg agtaacttga ttcctcattc aaataaaatg 120 tatgagcgaa gtaagagtct tctatctggt cttaagcgtg gtttgataaa gcaaaaagag 180 gtagcttttg ataagctcat ggggggttcg acaatagact tccagcatat tccaaccgga 240 actctcacac ctggtgagaa taaggtgcta gacataccaa ttgtcccgca acatttattg 300 accagtacga atataacgga ttaccatcag gccaataata agagtgctaa tggtgctact 360 gcacttcatg ttggagctat agaagtcatc ttagattgct ttacctctcc tgatagtaac 420 atttgtggtg gtatgttgct ggttgataca gcacatttaa acccggataa tgctataaga 480 agtgtttttg tcgcgccatt tattggtggt cgccctattc gagttttgtt gtttccagac 540 actttggtgg aaattgcccc aaacatgaat tctcgattta aattgctatg tactactagc 600 aatggcgacg ttgcaccaga ttttaattta gcgatggtca aagtcaatgt tgcaggttgt 660 gctgttagtt tgaccaagac atacactcct acagcctacc ttgagcaaga gctaattaaa 720 gaaaaggggg ccattgttca atatttgaac aggcacactt tttctatgca tcggaataat 780 cagatgacaa aggaagagat gcaaaagcag tgcctttctt ttaggctgga aagtgctctc 840 actttgcagg aaaaacatcc tttgcacgcc accttttgta agtcaaccaa ttttgtttac 900 aagattggtg gagatgccaa agaaggtagt aatggtagtt tgactgttaa tgagagtcag 960 ttgtcctcac attcttcttc cacacatgtt ttgcataagc ataacaacag tggcgataat 1020 gaagtagaat tctcggagat tggtgtggtc gtaccaggtg ctggtagaac caaggcttat 1080 ggtcaaaatg aactagatct tgcgcaactt tccttggatg atactagttc tcttcgtgga 1140 tctgtgttgc aaaccaaatt agccacatcc cgtgtcattt taagtaaaac aatggtcggg 1200 aatactatcc ttagggaaga tttgctcgcc accttcttgc aggatagcaa tgagagggcc 1260 gcgatagatt taatccgcac ccatgttata agaggcaaaa tacgctgtgt tgcttctatc 1320 aatgttccag agaatacagg ttgtgctttg gctatttgct tcaatagtgg cataacagga 1380 gctgctgaca cggacatata caccacgagt tctcaggacg ctatagtgtg gaatcctgct 1440 tgtgagaagg ctgttgagtt gtcatttaac cccaatccct gcagtgatgc ctggaacttt 1500 gtgtttttgc agcagacaaa ggcacatttc gcagttcagt gcgtgactgg atggactaca 1560 acaccactta cagacttggc tctagtgctt acatggcata tcgatagaaa cttgtgcgtg 1620 cctgaaactt tgacgattag ttctgcacac gcttctttcc caatcaatcg ctggatggga 1680 aagttatctt tcccacaagg gcctgcacgt gttctaaaaa ggatgccctt ggccatcggt 1740 ggtggagccg gcaccaaaga tgctattcta atgaatatgc cagatgctgt tatttcacta 1800 catcgttatt ttagagggga tttcgtcttt gaaataacaa agatgagttc tccttacata 1860 aaggcaacca tcgctttctt tatagcattt ggtgatatca cagaggaaat gaccaatttg 1920 gagggttttc cccacaagct tgtgcagttt gctgaaattc aggggcgcac caccataaca 1980 tttacgcaag gcgaattttt gacggcatgg tcaacacaag ttctaagcac cgttaatcct 2040 cagaaagatg gatgtcccca tttgtatgca ctcttgcatg actctgctac gtcaaccatt 2100 gaaggaaatt tcattattgg tgttaaactg ctggacatta ggaactatgg tgcttatggc 2160 cataaccccg gttttgaggg agcccgcctg ttaggaattt ctgggcagag tactatggtg 2220 cagcagcttg gaacttataa tccaatttgg atggttcgta cgcccttaga aagtacggcc 2280 ccacaaaatt ttgcgagttt tactgctgat ttgatggaat ccacagtgag tggggattct 2340 actggaaatt ggaatattac agcttatccg agtcctatat ccaatttgtt gaaagtggct 2400 gcttggaaga aggggacaat aagattccaa ctcatttgcc ggggtgctgc cgttaagcaa 2460 tccgattggg ctgcgtcagc cagaatagac ttggtcaata acctctcaaa taaagcttta 2520 cctgcgcgct cttggtacat tactaagcca cgaggaggtg atatcgagtt tgacttggaa 2580 atagcggggc caaataatgg ttttgaaatg gccaattcca gttgggcttt ccagactaca 2640 tggtatttgg aaattgccat agacaaccct aagcaattca ctcttttcga gttaaatgct 2700 tgtcttatgg aagacattga agtggctgga aacaccttaa acccacctat tttactttct 2760 tag 2763 <210> 4 <211> 3030 <212> RNA <213> polyprotein coding region of SqMV NC_003800 strain <400> 4 atgtggcatt tctgtgaaca agtttatgag tgttttgagg gttaccataa agactactct 60 gttcaaacag tccctgtgga atatttggcc tcacattaca ttgtcaacaa gtttagaccc 120 gaccctttag ctgttttgtg gcttttctgt ttgggaattt ggtgggagat tattcaaata 180 ctccactatc tatttcagta taaagaacca gcacttttta ttagcagctg tcagaacctt 240 gctgcttttt tagagagaaa gtattccatg gaagtgattc aaaaggaagg tttggctgct 300 tcggcactca aagacaagga gcgattggcc gaaaaagctg tggtcaatca acccctgagt 360 aatttaattc ccaactcaaa taaaatgtat gagcgaagta agagtctcct atctggtctt 420 aagcgtggtt tgataaagca aaaagagata gcttttgaca agcttatggg aggctcaaca 480 atagatttcc aacatattcc aacaggaact ctcacacctg gtgagaacaa agtgctagac 540 ataccaattg ttccgcaaca tttattgacc agtacaaata taacagatta ccatcaagct 600 aacaagaaaa atgctaatgg tgctactgca cttcatgttg gggctataga ggtcattatg 660 gattgcttca cctctcctga tagcaatatt tgtggtggta tgttgctggt tgatacagca 720 catttaaatc cagataatgc tataagaagt gtgtttgttg caccatttat aggtggtcgt 780 cctattcgag ttttgttatt tccagatacc ttggtggaaa ttgccccgaa catgaattct 840 cgattcaaat tgctatgtac tacgagcaat ggcgatgttg caccagattt caatttagcg 900 atggttaaag tcaatgttgc aggttgcgct gttagtttga ctaagacata tactcctaca 960 gcttacctcg agcaagaatt gatcaaagaa aagggggcca ttgtccaata cttaaacagg 1020 cacaccttct ctatgcatcg gaacaaccag atgacaaagg aagagatgca aaagcagcgc 1080 ctctctttta gattggaaag tgctctcact ttgcaggaaa agcatccttt gcatgccact 1140 ttttgcaagt caactaattt tgtttacaag attggtggag atgcaaaaga aggcagcaat 1200 ggcaatttga ctgtcaatga gagccagttg tcctcacatt ctccttctgc acatgtcttg 1260 cacaagcaca ataacagtgg tgataatgaa gtagagtttt cggaaattgg tgtagttgtg 1320 ccaggtgctg gcagaactaa ggcttatggc caaaatgagc tagatcttgc gcaactttct 1380 ttggatgata ctagttccct tcgtggatct gcgttgcaaa ctaaattggc cacttcccgt 1440 gtcattctga gcaagacaat ggttggaaat actgtgctca gggaggattt gctcgccacc 1500 tttttgcaag atagcaatga gagggccgct atagatttga ttcgcaccca tgtcatcaga 1560 ggcaaaatac gctgtgttgc ttctataaat gttccagaga atacaggttg tgcattagct 1620 atctgtttca acagtggcat aacaggagca gcagacacag atatttatac cacaagttct 1680 caggatgcca ttgtgtggaa tcctgcttgt gagaaagctg ttgagttgtc attcaacccc 1740 aatccttgtg gtgatgcttg gaattttgtc tttctgcaac aaacgaaggc acattttgcc 1800 attcagtgcg tgaccgggtg gactacaaca ccgcttacag atttagcgct ggtgcttaca 1860 tggcacattg atagaagctt gtgtgtgcct aaaattctga cgattagttc tgcacatgct 1920 tcttttccaa ttaatcgctg gatgggaaag ttatcttttc cgcaagggcc tgcgcgtgtt 1980 cttaagagga tgcctttggc tattggtgga ggggctggta ccaaagacgc tattctgatg 2040 aatatgccaa acgctgttat ctcacttcac cgatatttta ggggagattt cgtctttgag 2100 ataacaaaga tgagttctcc ttatataaag gcaaccattg ctttctttat agcgtttggt 2160 gatattacag aggaaatgac taatctggag agtttccccc acaagctcgt gcagtttgct 2220 gaaattcagg ggcgtaccac tataacgttc acgcaaagcg aatttttgac ggcatggtct 2280 acacaggtat taagtactgt caatcctcag aaggatgggt gtccccactt gtacgcactt 2340 ttgcatgact ctgctacttc aactattgaa ggaaattttg tcattggtgt taaattgctg 2400 gacatcagaa actatcgtgc ttacggtcac aaccccggtt ttgagggggc tcgtttgcta 2460 ggaatttctg ggcagagtac catggtacag cagcttggaa cttataatcc aatttggatg 2520 gttcgcacgc ccttagaaag tacagcccaa caaaattttg cgagtttcac tgctgatttg 2580 atggaatcca cgataagtgg ggactctact ggaaactgga atatcacagt ttatcctagt 2640 cctatagcta atttgctgaa agtggctgct tggaagaaag gaactataag atttcaactt 2700 atttgtcggg gtgccgctgt caagcagtct gactgggctg cgtcagctag aatagacttg 2760 attaacaacc tctcgaacaa ggctctaccc gcgcgttcct ggtacattac aaagccacga 2820 ggaggcgaca tcgagtttga cttagagata gcgggaccaa ataatggttt tgaaatggcg 2880 aattccagtt gggctttcca gaccacatgg tacttggaaa ttgccataga taatcccaag 2940 caatttactc cttttgaatt aaatgcctgt cttatggaag attttgaagt ggctggaaat 3000 actttaaatc cacctatttt gctttcctag 3030 <210> 5 <211> 3030 <212> RNA <213> polyprotein coding region of SqMV AB054689.1 strain <400> 5 atgtggcatt tctgtgaaca agtttatgag tgttttgagg gttaccataa agactactct 60 gttcaaacag tccctgtgga atatttggcc tcacattaca ttgtcaacaa gtttagaccc 120 gaccctttag ctgttttgtg gcttttctgt ttgggaattt ggtgggagat tattcaaata 180 ctccactatc tatttcagta taaagaacca gcacttttta ttagcagctg tcagaacctt 240 gctgcttttt tagagagaaa gtattccatg gaagtgattc aaaaggaagg tttggctgct 300 tcggcactca aagacaagga gcgattggcc gaaaaagctg tggtcaatca acccctgagt 360 aatttaattc ccaactcaaa taaaatgtat gagcgaagta agagtctcct atctggtctt 420 aagcgtggtt tgataaagca aaaagagata gcttttgaca agcttatggg aggctcaaca 480 atagatttcc aacatattcc aacaggaact ctcacacctg gtgagaacaa agtgctagac 540 ataccaattg ttccgcaaca tttattgacc agtacaaata taacagatta ccatcaagct 600 aacaagaaaa atgctaatgg tgctactgca cttcatgttg gggctataga ggtcattatg 660 gattgcttca cctctcctga tagcaatatt tgtggtggta tgttgctggt tgatacagca 720 catttaaatc cagataatgc tataagaagt gtgtttgttg caccatttat aggtggtcgt 780 cctattcgag ttttgttatt tccagatacc ttggtggaaa ttgccccgaa catgaattct 840 cgattcaaat tgctatgtac tacgagcaat ggcgatgttg caccagattt caatttagcg 900 atggttaaag tcaatgttgc aggttgcgct gttagtttga ctaagacata tactcctaca 960 gcttacctcg agcaagaatt gatcaaagaa aagggggcca ttgtccaata cttaaacagg 1020 cacaccttct ctatgcatcg gaacaaccag atgacaaagg aagagatgca aaagcagcgc 1080 ctctctttta gattggaaag tgctctcact ttgcaggaaa agcatccttt gcatgccact 1140 ttttgcaagt caactaattt tgtttacaag attggtggag atgcaaaaga aggcagcaat 1200 ggcaatttga ctgtcaatga gagccagttg tcctcacatt ctccttctgc acatgtcttg 1260 cacaagcaca ataacagtgg tgataatgaa gtagagtttt cggaaattgg tgtagttgtg 1320 ccaggtgctg gcagaactaa ggcttatggc caaaatgagc tagatcttgc gcaactttct 1380 ttggatgata ctagttccct tcgtggatct gcgttgcaaa ctaaattggc cacttcccgt 1440 gtcattctga gcaagacaat ggttggaaat actgtgctca gggaggattt gctcgccacc 1500 tttttgcaag atagcaatga gagggccgct atagatttga ttcgcaccca tgtcatcaga 1560 ggcaaaatac gctgtgttgc ttctataaat gttccagaga atacaggttg tgcattagct 1620 atctgtttca acagtggcat aacaggagca gcagacacag atatttatac cacaagttct 1680 caggatgcca ttgtgtggaa tcctgcttgt gagaaagctg ttgagttgtc attcaacccc 1740 aatccttgtg gtgatgcttg gaattttgtc tttctgcaac aaacgaaggc acattttgcc 1800 attcagtgcg tgaccgggtg gactacaaca ccgcttacag atttagcgct ggtgcttaca 1860 tggcacattg atagaagctt gtgtgtgcct aaaattctga cgattagttc tgcacatgct 1920 tcttttccaa ttaatcgctg gatgggaaag ttatcttttc cgcaagggcc tgcgcgtgtt 1980 cttaagagga tgcctttggc tattggtgga ggggctggta ccaaagacgc tattctgatg 2040 aatatgccaa acgctgttat ctcacttcac cgatatttta ggggagattt cgtctttgag 2100 ataacaaaga tgagttctcc ttatataaag gcaaccattg ctttctttat agcgtttggt 2160 gatattacag aggaaatgac taatctggag agtttccccc acaagctcgt gcagtttgct 2220 gaaattcagg ggcgtaccac tataacgttc acgcaaagcg aatttttgac ggcatggtct 2280 acacaggtat taagtactgt caatcctcag aaggatgggt gtccccactt gtacgcactt 2340 ttgcatgact ctgctacttc aactattgaa ggaaattttg tcattggtgt taaattgctg 2400 gacatcagaa actatcgtgc ttacggtcac aaccccggtt ttgagggggc tcgtttgcta 2460 ggaatttctg ggcagagtac catggtacag cagcttggaa cttataatcc aatttggatg 2520 gttcgcacgc ccttagaaag tacagcccaa caaaattttg cgagtttcac tgctgatttg 2580 atggaatcca cgataagtgg ggactctact ggaaactgga atatcacagt ttatcctagt 2640 cctatagcta atttgctgaa agtggctgct tggaagaaag gaactataag atttcaactt 2700 atttgtcggg gtgccgctgt caagcagtct gactgggctg cgtcagctag aatagacttg 2760 attaacaacc tctcgaacaa ggctctaccc gcgcgttcct ggtacattac aaagccacga 2820 ggaggcgaca tcgagtttga cttagagata gcgggaccaa ataatggttt tgaaatggcg 2880 aattccagtt gggctttcca gaccacatgg tacttggaaa ttgccataga taatcccaag 2940 caatttactc cttttgaatt aaatgcctgt cttatggaag attttgaagt ggctggaaat 3000 actttaaatc cacctatttt gctttcctag 3030 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 6 rctagatctt gcgcaactt 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 7 atracatggg tgcgraty 18 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer <400> 8 cgggahgtgg cyartttrgt ycyytggayg ayacyagttc yctt 44 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer <400> 9 ggtyggraat actrtsctya ggaatctatm gcggccctct 40

Claims (8)

1. 서열번호 6 내지 9로 구성되는 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus, SqMV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트로서, 상기 스쿼시모자이크바이러스는 AF059532.1, AF059533.1, 및 AB054689.1 변이주(Strain)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
   
2. 삭제
3. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는, 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus, SqMV)를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서,
   상기 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 식물에서 전체 RNA(total RNA)를 추출하는 단계;
   상기 전체 RNA를 주형으로 역전사반응을 수행하여 전체 cDNA(total cDNA)를 합성하는 단계;
   상기 cDNA를 주형으로 제 3 항에 따른 조성물을 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 30분 내지 2시간 동안 등온증폭반응법을 수행하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
   상기 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 스쿼시모자이크바이러스(Squash mosaic virus, SqMV) 검출방법.
   
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7. 제 5항에 있어서,
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 전기영동(electrophoresis) 또는 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
   
8. 제 7항에 있어서,
   상기 SYBR Green I을 이용하여 증폭된 DNA를 확인하는 방법은 SYBR Green I을 1,000배 내지 10,000배 농도로 사용하여 자연광하에서 육안으로 관찰하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
   

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