KR101995575B1 - 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 병원체변종(pathovars)을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 슈도모나스 시린개개의 병원체변종을 특이적으로 구별하는데 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for discriminating Pseudomonas syringae pathovars and uses thereof}
본 발명은 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
현대 농업의 특징인 단일 작물의 대규모 재배 형태는 다양한 병원균, 해충 및 바이러스 등의 생물학적 스트레스에 재배 작물이 민감하게 노출되어 그 수확량에 큰 영향을 미치는 단점을 가지고 있다. 최근 국제 무역의 자유화와 더불어 행해지는 농작물의 대량 수입은 기존의 생태 환경에 노출되지 않았던 새로운 병원균의 유입을 초래하여 국내에 급속히 확산 전파될 위험성을 내재하고 있다.
식물 병원균의 유전자 동정 방법으로는 점적검사(dot blot test), 중합효소연쇄반응(PCR) 등의 방법이 이용된다. 특히 PCR은 점적검사보다 시간, 노력, 인력 등이 경제적이기 때문에 널리 사용되고 있는 방법이다. PCR은 특정 DNA 단편(프라이머)을 병원균의 게놈 유전자(genomic DNA)에 결합(annealing)한 후 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하여 증폭시키고 전기영동하여 DNA 밴드의 유무, 크기 또는 형태의 차이를 통해 병원균 유전자의 다형성을 동정할 수 있다.
이러한 PCR에 의한 병원균의 동정법은 동물의 세균성 질병을 동정하는데 주로 이용되었으나, 최근에는 식물 병원균을 동정할 수 있도록 PCR 동정법이 개발되어 수출입 농산물의 검역에도 이용되고 있다. PCR 동정법은 다른 방법에 비해 소요되는 시간이 짧고, 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이다.
슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)는 극성 편모(polar flagellum)를 가진 간상형(rod-shape) 그람음성세균으로, 50개 이상의 병원체변종(pathovars; pv.)이 존재하는 식물 병원균이다. 그 중 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(P. syringae pv. atrofaciens) 및 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa)는 밀(wheat), 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica)는 보리(barley), 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata)는 사탕무우(beets), 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici)는 수수속(Panicum sp.) 식물체에 식물병을 유발시킬 수 있다. 특히 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스는 맥류의 낟알 기저부분을 흑갈색으로 썩게 만들어 곡물의 품질을 현저하게 감소시키는 밑껍질마름병(Basal Glume Rot)을 유발시키며, 이 병은 북미, 유럽, 중동, 오스트레일리아 등 전세계적으로 밀과 보리와 같은 맥류 재배지역에서 흔히 발생하는 것으로 알려져 있다.
한편, 한국등록특허 제1482376호에는 '사과에서 blister spot병을 일으키는 슈도모나스 시린개 피브이 파퓰란스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 슈도모나스 시린개 피브이 파퓰란스 검출 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1759334호에는 '핵과류에서 세균성 잎마름병을 일으키는 슈도모나스 시린개 피브이 퍼시카에 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 슈도모나스 시린개 피브이 퍼시카에 검출 방법'이 개시되어 있으나 본 발명의 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 식물병을 유발하는 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae)의 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트를 개발하였고, 1차 PCR에서 2개(PSA-a 및 PSA-b)의 프라이머 세트를, 2차 PCR에서 4개(PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 증폭된 산물의 밴드 패턴에 따라 슈도모나스 시린개의 병원체변종(P. syringae pv. atrofaciens, P. syringae pv. lapsa, P. syringae pv. japonica, P. syringae pv. aptata 및 P. syringae pv. panici)을 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 병원체변종(pathovars; pv.) 구별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 슈도모나스 시린개 병원체변종 구별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트는 식물병을 유발하는 슈도모나스 시린개의 병원체변종에 대한 구별이 쉽고 빠르게 수행될 수 있으므로, 농산물 수출입 현장 및 농업 현장에서의 정확한 식물병 진단 및 병원균 동정에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위해 6개의 프라이머 세트(PSA-a, PSA-b, PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f)를 이용하여 2번의 PCR을 수행하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 15개의 슈도모나스 시린개 병원체변종 균주에 대해 PSA-a 및 PSA-b 프라이머 세트를 이용하여 1차 PCR을 수행한 결과이다. 레인 1: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens) LMG 5000, 레인 2: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 LMG 5001, 레인 3: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 LMG 5095, 레인 4: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 LMG 5533, 레인 5: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 LMG 5534, 레인 6: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 LMG 5535, 레인 7: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 ICMP 9389, 레인 8: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 ICMP 9394, 레인 9: 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa) ATCC 10859, 레인 10: 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica) ICMP 6305, 레인 11: 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici) ATCC 19875, 레인 12: 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) KACC 12132, 레인 13: 슈도모나스 시린개 pv. 피시(P. syringae pv. pisi) LMG 5679, 레인 14: 슈도모나스 시린개 pv. 파풀란스(P. syringae pv. papulans) LMG 5076, 레인 15: 슈도모나스 시린개 pv. 코로나파시엔스(P. syringae pv. coronafaciens) LMG 5060, N: 음성 대조군(증류수 첨가).
도 3은 다양한 슈도모나스 시린개 병원체변종 균주에 대해 PSA-a 및 PSA-b 프라이머 세트를 이용하여 1차 PCR을 수행한 결과이다. 레인 1: 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스 LMG 5095, 레인 2~31: 순서대로 표 2의 7번 균주~33번 균주 및 35번~37번 균주, N: 음성 대조군(증류수 첨가).
도 4는 1차 PCR에서 단일 밴드로 확인된 슈도모나스 시린개 병원체변종 균주에 대해 PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f 프라이머 세트를 이용하여 2차 PCR을 수행한 결과이다. 레인 1: 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카 ICMP 6305, 레인 2: 슈도모나스 시린개 pv. 파니시 ATCC 19875, 레인 3: 슈도모나스 시린개 pv. 압타타 KACC 12132, N: 음성 대조군(증류수 첨가).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 병원체변종(pathovars; pv.) 구별용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 슈도모나스 시린개 병원체변종은 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens), 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa), 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica), 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici)일 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 1차 PCR 과정에 이용되고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트는 2차 PCR 과정에 이용되는 프라이머 세트로서,
서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 이용하면 슈도모나스 시린개 병원체변종 중 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스를 구별할 수 있고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트 모두를 이용하면 슈도모나스 시린개 병원체변종 중 슈도모나스 시린개 pv. 랍사, 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카, 슈도모나스 시린개 pv. 압타타 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시를 구별할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 및 서열번호 11 및 12 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개의 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 냉의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 및 서열번호 11 및 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 명세서에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 슈도모나스 시린개(P. syringae) 병원체변종(pathovars) 구별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
슈도모나스 시린개 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하고 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 슈도모나스 시린개(Pseudomonas syringae) 병원체변종(pathovars)을 구별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 슈도모나스 시린개 병원체변종은 전술한 것과 같이 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens), 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa), 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica), 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici)일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 슈도모나스 시린개 병원체변종의 구별 방법은, 2단계의 PCR을 수행하는 것으로, 1차 및 2차 PCR을 통해 증폭된 PCR 산물의 결과 패턴을 비교함으로써 슈도모나스 시린개 병원체변종을 각각 구별할 수 있다. 구체적으로, 1차 PCR 과정에서 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(이하, PSA-a)와 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(이하, PSA-b)를 사용하여 PSA-a 및 PSA-b에 의해 밴드가 모두 나타날 경우에는 해당 시료내 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(P. syringae pv. atrofaciens)의 존재를 확인할 수 있고, PSA-b에 의해 단일 밴드가 나타날 경우 시료내 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa)의 존재를 확인할 수 있으며, PSA-a에 의해 단일 밴드가 나타날 경우, 해당 시료를 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(이하, PSA-c), 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(이하, PSA-d), 서열번호 9 및 10(이하, PSA-e) 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(이하, PSA-f)를 사용하여 2차 PCR 과정을 수행하여, PSA-c 및 PSA-e에 의해 밴드가 나타날 경우 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica)를, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f에 의해 밴드가 나타날 경우 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata)를, 그리고 PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f에 의해 밴드가 모두 나타날 경우 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici)를 확인할 수 있다.
상기 6개의 프라이머 세트는 각 프라이머들의 증폭 효율이 다르므로 각각의 프라이머 세트로 PCR을 수행한 후 전기영동하는 것이 바람직하다. 또한, 2차 PCR에서 사용된 PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f 프라이머 세트는 PSA-a에 의해 증폭 반응이 일어난 3개의 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구분하기 위한 프라이머 세트로, 다른 목적으로 사용할 경우 특이성의 보장이 어렵다. 즉, 슈도모나스 시린개 병원체변종인 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스, 슈도모나스 시린개 pv. 랍사, 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카, 슈도모나스 시린개 pv. 압타타 및 슈도모나스 시린개 pv. 파니시를 특이적으로 구별하기 위해 상기 6개의 프라이머 세트를 사용하여 2단계의 PCR을 수행하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 슈도모나스 시린개 감염 의심 시료는 감염 의심 식물체의 잎, 묘목, 줄기, 과수, 또는 종자 등일 수 있고, 상기 식물체는 밀(wheat, Triticum aestivum), 보리(barly, Hordeum vulgare), 사탕무우(beets, Beta vulgaris), 기장속 풀(Panicum grass species) 등일 수 있으나, 슈도모나스 시린개 병원체변종인 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스, 슈도모나스 시린개 pv. 랍사, 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카, 슈도모나스 시린개 pv. 압타타 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시에 감염될 수 있는 식물이면 그 종류에 제한이 없다.
본 발명의 방법은 슈도모나스 시린개 감염 의심 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 슈도모나스 시린개 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구분하는 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 균주 DNA 준비
슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens; 이하 PSA) 균주 8개(표 1)와 다른 종류의 슈도모나스 시린개 병원체변종 균주 37개(표 2)를 각 균주은행으로부터 분양받아 영양배지(nutrient agar, NA; Becton, 미국), 27 ℃에서 배양하고 GeneALL Exgene™ Cell SV mini 키트를 사용하여 균주의 전체 DNA를 분리한 후 10 ng/㎕로 정량하여 PCR 주형으로 사용하였다.
Figure 112018057920118-pat00001
Figure 112018057920118-pat00002
2. PCR 프라이머 제작
PSA의 특이적 염기서열 확보를 위하여 PacBio와 Hiseq 시퀀싱을 통해 완전한 형태의 세균 유전체 염기서열을 얻었고, 유전체 염기서열으로부터 Glimmer3, RNAmmer-1.2, tRNAscan-SE 프로그램을 사용하여 ORF(open reading frame) 서열을 예측하였다. 상기 ORF 서열은 BLAST를 통해 NCBI GenBank에 등록된 유전자의 염기서열과 비교하였고, 다른 슈도모나스 시린개 병원체변종 균주들과 유전체 비교 맵핑(comparative genome mapping)을 통해 특이적인 유전자 서열을 얻었다. 추가적으로 Uniprot 단백질 데이터베이스에서 PSA에 특이적인 단백질 서열과 슈도모나스의 다양한 이펙터(effector) 염기서열에서 PSA에 특이적인 이펙터 유전자를 찾았다. 상기에서 찾은 유전자 서열은 web기반 PCR 프라이머 제작 프로그램인 Primer3Plus(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)를 이용하여 프라이머를 제작한 후 PCR에 사용하였다.
Figure 112018057920118-pat00003
실시예 1. PCR 프라이머 세트의 슈도모나스 시린개 병원체변종의 구별
1-1. PSA-a 및 PSA-b를 이용한 1차 PCR
PSA-a 프라이머 세트(F, R 각각 10 mM mixture) 2 ㎕, Qiagen HotStarTaq DNA polymerase(5 U/μl) 0.125 ㎕, dNTP Mixture(10 mM) 2 ㎕, 10X PCR buffer 2.5 ㎕, 5X Q-solution 5 ㎕ 및 주형 DNA 10 ng를 혼합하고 멸균수로 최종 반응액 부피를 25 ㎕에 맞춘 후 표 4의 조건으로 PCR을 수행하였다. PSA-b, PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f 프라이머 세트를 사용할 경우 TaKaRa ExTaq polymerase를 사용하였다.
PCR 반응 조건
단계 온도(℃) 시간
전-변성 95 15분
변성 94 30초
결합 60 30초
신장 72 1분
변성 단계로 돌아가 35회 추가 반복
최종 신장 72 10분
보관 4 ∞
PSA-a와 PSA-b 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭 산물을 1:3 비율로 섞어 전기영동한 결과, PSA-a와 PSA-b 세트에 의해 두 개의 밴드가 나타나는 8개 균주가 확인되었고, 확인결과 모두 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(P. syringae pv. atrofaciens) 균주임을 알 수 있었다. 또한, PSA-b 세트에 의해 단일 밴드가 나타나는 1개의 균주는 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa) ATCC 10859로 확인되었으며, PSA-a에 의해 단일 밴드가 나타나는 3개의 균주는 각각 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica) ICMP 6305, 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) KACC 12132 및 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici) ATCC 19875인 것으로 확인되었다. 상기 슈도모나스 시린개 병원체변종 외에 다른 33개의 병원체변종 균주에서는 PSA-a와 PSA-b 프라이머 세트에 의한 증폭 반응이 일어나지 않음을 알 수 있었다(도 2 및 도 3).
1-2. PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f를 이용한 2차 PCR
1차 PCR에서 PSA-a 프라이머 세트에 의해 증폭된 슈도모나스 시린개 병원체변종 3개에 대해서, PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f 프라이머 세트를 이용하여 2차 PCR을 수행하였다.
그 결과, PSA-c 및 PSA-e 프라이머 세트에 의해 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica) ICMP 6305가 구별되는 것을 알 수 있었고, PSA-c, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f 프라이머 세트에 의해 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici) ATCC 19875가 구별되는 것을 알 수 있었으며, PSA-d, PSA-e 및 PSA-f 프라이머 세트에 의해 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) KACC 12132가 구별되는 것을 확인하였다(도 4).
이상의 결과를 통해, 본 발명의 6개의 프라이머 세트를 이용하면, 슈도모나스 시린개 병원체변종 중 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens), 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa), 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P. syringae pv. japonica), 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici)를 구별할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer set for discriminating Pseudomonas syringae pathovars and uses thereof <130> PN18158 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aggccttaac cttgaccgtg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgagcctcta accgtctcga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaatccgcag gattacgaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tggagagagc tgggatagga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agtaattggc ggcagtgtca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 attgttcagc gaaggcagga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatggaggag tggttcctga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaagctcaag gtctcggttg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcgtttcaac gctatcaaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cagcacgtag cctttttcaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gaactgaagc tggaaccgga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggcgaagaag tagaagcggt 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens), 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa), 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P.syringae pv. japonica), 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici) 구별용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens), 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa), 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P.syringae pv. japonica), 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici) 구별용 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 슈도모나스 시린개 감염 의심 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하고 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 슈도모나스 시린개 pv. 아트로파시엔스(Pseudomonas syringae pv. atrofaciens), 슈도모나스 시린개 pv. 랍사(P. syringae pv. lapsa), 슈도모나스 시린개 pv. 자포니카(P.syringae pv. japonica), 슈도모나스 시린개 pv. 압타타(P. syringae pv. aptata) 또는 슈도모나스 시린개 pv. 파니시(P. syringae pv. panici)를 구별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
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