KR101961763B1

KR101961763B1 - 버섯의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물 및 이를 이용한 푸른곰팡이 병원균 검출 방법

Info

Publication number: KR101961763B1
Application number: KR1020180103635A
Authority: KR
Inventors: 류재산; 이송희; 정화진
Original assignee: 한국농수산대학 산학협력단
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2019-03-25

Abstract

본 발명은 버섯 내 심각한 생산 손실을 유발하는 푸른 곰팡이 병원균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 버섯 내 또는 액체종균에서 푸른곰팡이 병원균을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

버섯의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물 및 이를 이용한 푸른곰팡이 병원균 검출 방법{Composition for detecting of the green mold in mushroom and detecting method using the same}

본 발명은 버섯의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물 및 이를 이용한 푸른곰팡이 병원균 검출 방법에 관한 것이다.

큰느타리버섯(King oyster mushroom)은 새송이버섯(Pleurotus eryngii)의 학술적 명칭이며, 분류학적으로 담자균아문(Basidiomycotina), 주름버섯목(Agaricales), 느타리버섯과(Pleurotaceae), 느타리버섯속(Pleurotus)에 속하고 육질이 치밀하고 느타리버섯에 비해 대가 굵고 길며 저장성이 좋다는 장점이 있다(Rajarathnam and Bano, 1987). 또한, 맛과 향이 뛰어나고 대가 단단하여 저장기간이 긴 특징을 가지고 있다. 전체 농산버섯 생산량 182,561톤의 26.2%를 차지하고, 수출량도 4,755톤, 15,588천불(2015년 기준)에 달한다.

그러나 버섯 재배시 푸른색의 곰팡이병의 발생으로 심각한 생산손실이 발생하는 것으로 보고되고 있는데, 주원인균은 버섯 균사를 포식하는 트리코더마(Trichoderma)으로 알려져 있고 색깔에서 유래한 푸른곰팡이균(green mold, 트리코더마병)으로 불린다. 이 균으로 인해 유럽, 북미, 아시아에서 버섯에 피해가 발생하는 것으로 보도되어 있는데, 일부에서는 30% 이상의 생산량 감소를 일으킨다고 한다. 이 균은 일반적으로 토양이나 목재에서도 분리되며 보통 이 균의 포자가 공기 중에 비산되어 기류를 타고 기회적으로 버섯재배사에 침입하여 버섯배지나 종균에 혼입되어 병을 일으키는 것으로 사료된다. 트리코더마의 생장속도는 다른 버섯균보다 엄청나게 빠르며, 특히 버섯배지나 종균은 멸균처리를 거치므로, 다른 길항력을 가진 미생물이 전혀 없어 확산속도가 빠르다. 또한, 버섯균이 있더라도 트리코더마가 기생성이기 때문에 느타버섯속의 균사생장 및 버섯발생기를 막론하고 발생하여 버섯생산량 및 품질에 막대한 피해를 주는 병원균이다.

따라서, 버섯에 발생하는 병원성 곰팡이에 의한 오염 여부를 신속하고 정확하게 판단할 수 있는 기술에 대한 요구가 있어 왔다.

본 발명에 대한 배경기술로는 대한민국 등록특허 제10-1137803호(2012.04.12)(특허문헌 1) 및 Kredics L, Kocsub

S, Nagy L, Komo

-Zelazowska M, Manczinger L, Sajben E, Nagy A, V

gv

lgyi C, Kubicek CP, Druzhinina IS and Hatvani L. 2009. Molecular identification of Trichoderma species associated with Pleurotus ostreatus and natural substrates of the oyster mushroom. FEMS Microbiol Lett, 300(1):58-67.(비특허문헌 1)가 있다.

그러나, 종래 기술들은 푸른곰팡이 병원균 중 일부의 병원균에서만 약하게 특이적인 밴드가 검출되거나, 같은 종에서도 다중 밴드가 검출되는 문제점이 있었다. 또한, 종래 기술들은 다수의 푸른곰팡이 병원균을 한 번에 검출하는 데에는 한계가 있고, 검출된 다중 밴드로 인해 결과해석에 어려움이 있는 단점이 있다.

본 발명은 버섯 또는 버섯 액체종균에서 심각한 생산 손실을 유발하는 푸른곰팡이 병원균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 다수의 푸른곰팡이 병원균을 한 번에 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 세트를 설계하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다수의 푸른곰팡이 병원균을 한 번에 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하여, 버섯에 기생하는 푸른곰팡이 병원균을 편리하고 신속하게 검출할 수 있는 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여, 검출 장소 및 시기에 상관없이, 1회 반응으로도 다수 푸른곰팡이 병원균의 검출이 가능한 검출 키트 및 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

일 측면에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하며, 버섯 또는 버섯 액체종균 내의 푸른곰팡이 병원균을 검출하는, 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물에서 상기 버섯은 느타리버섯, 큰느타리버섯, 및 잎새버섯 중 1종 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물에서 상기 푸른곰팡이 병원균은 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코더마 코닌지(Trichoderma koningii), 트리코더마 비렌스(Trichoderma virens), 트리코더마 플레우로티콜라(Trichoderma pleuroticola), 트리코더마 플레우로툼(Trichoderma pleurotum), 및 트리코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) 중 1종 이상일 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본원의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물을 포함하는, 푸른곰팡이 병원균 진단용 키트가 제공된다.

또 다른 측면에 따르면, (i) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (ii) 상기 (i) 단계에서 분리한 DNA를 본원의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물을 이용하여 증폭하는 단계; 및 (iii) 상기 (ii) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 푸른곰팡이 병원균 검출 방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 푸른곰팡이 병원균 검출 방법에서 상기 버섯은 느타리버섯, 큰느타리버섯, 및 잎새버섯 중 1종 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 푸른곰팡이 병원균 검출 방법에서 상기 푸른곰팡이 병원균은 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코더마 코닌지(Trichoderma koningii), 트리코더마 비렌스(Trichoderma virens), 트리코더마 플레우로티콜라(Trichoderma pleuroticola), 트리코더마 플레우로툼(Trichoderma pleurotum), 및 트리코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride) 중 1종 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 버섯 유전자에는 증폭되지 않고, 다수의 푸른곰팡이 병원균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법을 제공할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 버섯재배 과정별로 시료를 채취하여, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면, 다수의 푸른곰팡이 병원균의 오염 여부를 조기에 확인할 수 있어 버섯의 안정적인 생산이 가능한 이점이 있다.

일 실시예에 따르면, 최근에 많이 사용하는 액체종균의 오염은 전체 배지의 오염을 야기하므로, 본 발명의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물을 사용하면, 빠른 대응이 가능한 이점이 있다.

일 실시예에 따르면, 야적장, 작업실, 살균실, 냉각실, 접종실, 배양실 및 생육실 등 각 장소의 병원균 농도를 정기적으로 검사할 수 있어, 고품질의 버섯의 생산이 가능한 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여, PCR 반응을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 종래의 T. pleurotum 및 T. pleuroticola 검출용 프라이머 세트를 이용하여, PCR 반응을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 종래의 T. pleurotum 검출용 프라이머 세트를 이용하여, PCR 반응을 진행한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본원에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그널을 직, 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머 세트는 분광학, 생화학, 광화학, 면역화학 또는 이외 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 증폭반응의 수행시 표적서열의 유전자를 증폭시킬 수 있으며, 표적 염기서열의 증폭방법은, 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification), 전자 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), SDA(strand displacement amplification) 또는 리플리카아제(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 적당한 방법을 적용할 수 있다.

상기 느타리버섯은 여러 대륙에 걸쳐 자생하는 균류로, 주로 가을철에 포플러나무, 미루나무 등의 활엽수 고사목에 발생하고 다른 버섯에 비해 넓은 재배 기후대와 영양기질의 다양성으로 많은 국가에서 식용하고 있다. 세계적으로 가장 많이 생산되며, 우리나라에서도 생산량 76,389톤(2014년)으로 1위를 기록하였다.

큰느타리버섯 또한, 유럽대륙 지중해에서부터 북부 체코, 독일에 이르는 지역에 자생하는 균류로서, 1997년 경남농업기술원과 농촌진흥청에서 공동으로 재배법을 개발하여 보급한 이래 2002 ~ 2006년에 걸쳐 평균 100%가 넘는 생산증가율을 보여서 2006년 43,230톤이 생산되어 느타리버섯 다음으로 많이 재배하는 품목이다.

잎새버섯은 우리나라와 일본을 비롯한 동아시아, 유럽, 북미 등에 분포되어 있으며, 일본에서는 고급 버섯으로 불린다. 희소성이 높아, 상기 버섯에서 푸른곰팡이 병원균의 검출 및 푸른곰팡이병에 대한 진단은 매우 높은 경제적 가치를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 이용하면, 상기 버섯에서 푸른곰팡이 병원균의 여러 속의 균주들을 특이적으로 한 번에 검출할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 프라이머 세트 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

또한, 상기 키트는 이에 한정하는 것은 아니나, PCR 분석을 수행하기 위한 필수 요소를 포함하는 키트가 적합할 수 있다. 상기 키트에는 본 발명의 서열번호 1 내지 2의 프라이머 세트 이외에도 핵산추출, 증폭, 생성물 검출용 시약 및 이에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있고, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 완충액, DNA 중합효소, dNTPs, DNase, RNase 억제제, 버퍼 및 멸균증류수 등을 포함할 수 있다.

다른 예로서는, 본 발명의 키트는 DNA chip 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA chip 분석용 키트는 서열번호 1 및 2의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 부착되어 있는 기판과 형광표시된 프로브를 제작하기 위한, 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있고, 상기 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

상기 DNA를 분리하는 (i) 단계는 이 기술 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나, MCM 배지에 균사를 접종하여 균사 배양후 채취하거나, CTAB 방법을 이용할 수 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

상기 표적 서열의 증폭하는 (ii) 단계는 PCR을 통해 수행될 수 있다. 상기 PCR의 프라이머 어닐링 온도는 50℃~65℃일 수 있으며, 58℃~62℃이 더 적합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 PCR은 통상의 PCR용 기기를 사용하여 실시할 수 있으며, 상기 PCR용 기기는 예를들면, 실시간 PCR용 기기, 열 블록 PCR(Thermal Block PCR)용 기기, 디지털 PCR용 기기일 수 있으며, 일 예로, QX200(BioRad사, 미국)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 PCR용 기기는 동시에 1종 이상의 푸른곰팡이 병원균을 검출할 수 있으며, 추가로 표적 핵산의 양을 정량화 할 수 있다.

상기 증폭된 산물을 확인하는 (iii) 단계는 이에 한정하는 것은 아니나, PCR이 완료된 PCR 증폭산물을 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여, 형성된 DNA 밴드를 UV로 조사하여 검출하거나, 디지털 PCR의 드롭렛 리더에 장착하여 형광 표지된 값을 확인하고 계수하여 여러 푸른곰팡이병의 검출 유무를 동시에 확인할 수 있다.

상기 형광 표지는 FAM(5- 또는 6-카르복시플루오레세인), VIC, NED, 플루오레세인, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 야키마 옐로우(Yakima Yellow), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) PET, 바이오서치 블루(Biosearch Blue™), 마리나 블루(Marina Blue), 보텔 블루(Bothell Blue), 350 FAM™, SYBR green, 플루오레세인, EvaGreen™, 알렉사 플루오르 488 등에서 선택될 수 있으며, 형광 표지 물질은 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르고, 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 물질은 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 물질에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용한 예만을 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예

버섯 또는 버섯 액체종균 내의 푸른곰팡이 병원균 검출을 위한 프라이머 세트 제작

1. 곰팡이균에서 gDNA(genomic DNA) 추출

DNA를 분리하기 위하여, 상기 버섯의 단핵균사를 버섯완전배지 위에 살균된 셀로판지를 깔고, 그 위에 균주를 접종하여 약 5일간 배양한 후, 균사체를 회수하였다. 상기 회수된 균사체를 동결건조 또는 생체를 액체질소를 사용하여 분말로 만든 후, 100 ㎍를 1.5 ml의 시험관에 옮기고, DNA 추출 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0; 200 mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5 % SDS) 400 ㎕와 프로테아제 K (20mg/ml)를 첨가한 다음, vortex를 사용하여 균사체가루가 완충액과 완전히 혼합되도록 하였다. 상기 혼합물을 37 ℃ 항온기에서 1시간 반응시켜 균사체가루와 완충액을 혼합시킨 혼합액을 얻었다. 이때, 상기 혼합액에 2 X CTAB(sigma) 완충액을 동량 첨가하여 65℃에서 15분간 방치한 다음, 클로로포름 : 이소아밀알코올을 24:1의 비율로 넣고 2분 정도 vortexing을 하여 완전히 혼합되도록 하였다.

상기 혼성화된 액을 12,000 rpm에서 원심분리하여 분리되는 상등액을 새로운 튜브로 옮기고, 원액의 × 0.7 부피배의 이소프로판올을 첨가하여 실온에서 10분간 두어 DNA를 침전시킨 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다.

상기 침전된 DNA에 70%의 에탄올을 넣어 3-4번 상하로 조심스레 흔들어 세척하고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 에탄올을 제거하고 건조한 다음, TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 100 ㎕에 용해하였다.

여기서, 상기 DNA 용액을 RNase(10 mg/ml) 2㎕를 넣어 37 ℃에서 30분 처리하여 RNA를 분해제거하고, 농도를 Nano DROP(Nano DROP Technologies, Thermo Scientific NanoDrop Lite Spectrophotometer)로 측정하였다.

2. 푸른곰팡이 병원균 검출을 위한 염기서열 분석 및 특이 프라이머 세트 제작

버섯(예를 들어, 큰느타리 버섯)에 피해를 주는 푸른곰팡이를 버섯농가에서 분리하여 ITS(inter transcribed space) 서열을 분석해 본 결과, 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum)으로 동정되었다. 이를 다른 푸른곰팡이균의 ITS 서열과 큰느타리버섯, 느타리버섯의 ITS 서열을 비교하였다.

또한, 버섯(예를 들어, 큰느타리버섯)에 대한 다른 푸른곰팡이 병원균의 병발생 능력을 검정하기 위하여 큰느타리버섯을 균긁기작업(노화균제거와 버섯발생을 위한 작업) 이후, 각 푸른곰팡이 균을 인위적으로 접종한 결과 하기 표의 푸른곰팡이는 모두 큰느타리버섯 균사에 크고 작은 피해를 야기하는 것을 확인하였다.

따라서, 이들 푸른곰팡이들은 잠재적인 큰느타리버섯의 푸른곰팡이 병원균으로 판단되어 검출이 필요한 것으로 판단하였다(하기 표 1 참조).

오로지 푸른곰팡이에서만 특이적으로 DNA 조각이 증폭되는 프라이머 서열을 디자인하기 위하여, 푸른곰팡이 병원균의 특이적인 밴드의 서열을 분석하였다.

상기 푸른곰팡이 병원균의 검출력이 확인된 특이적인 DNA 단편을 겔용출키트(Gel elution kit, GeneALL)을 이용하여 아가로스로부터 분리 정제하여, p-GEM-T Easy에 클로닝하고, 벡터의 일반적인 서열분석용 프라이머 M13을 이용하여, 양방향에서 염기서열을 분석하였다. 이때 분석에 사용한 시약은 PRISM Ready reaction dye termination/primer cycle sequencing kit(perkin-Elmer, USA)를 사용하였다.

총 10㎕ 반응액을 제품회사가 제공한 방법으로 열순환기(thermal cycler)로 반응시킨 다음, 반응산물을 4 %의 아크릴아마이드 젤에 전기영동 하여 ABI PRISMTM 377 DNA 서열분석기(Perkin Elmer, USA)로 염기서열을 결정하였다. 양방향으로 서열분석한 후, 가운데 겹치는 부분은 서열을 합쳐서 각 DNA 단편의 온전한 서열을 완성시켰다.

상기 염기서열을 근간으로, 버섯을 제외한 푸른곰팡이 병원균의 검출을 위한 프라이머를 설계하고, 안정된 밴드가 합성되도록 19bp의 정방향 프라이머(서열번호 1)과 19bp의 역방향 프라이머(서열번호 2)를 제작하였다. 이들 프라이머 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.

3. 시료의 제조

MCM(mushroom complete medium) 배지에 균사를 접종하여, 균사 배양 후 균사체를 이쑤시개를 이용하여 채취하였다. 상기 균사체를 TE buffer(pH 7.4) 100㎕에 넣고 전자레인지(700w)에서 1분 간격으로 2회 처리하였다. 상기 균사의 배양은 최소 10분간 -20℃에서 냉각하고, 5분간 10,000rpm에서 원심분리를 진행하였다. 이후, 농도를 측정하고, PCR(polymerase chain reaction)을 진행하였다.

PCR 반응 총량은 20㎕으로 하고, 각 균주의 균사체로부터 분리한 게놈 DNA 20 ng과 4종류의 dNTP(각 2.0 mM), 내열성 DNA 중합효소(e-taq polymerase, Solgent, Korea) 1.0 unit, 10 pmol 프라이머, 20 ng 버섯 게노믹 DNA 및 완충용액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01 % 젤라틴)을 완전히 혼합하였다.

4. 중합효소 연쇄반응(PCR)

본 발명에 따른 버섯 또는 버섯 액체종균 내에 푸른곰팡이 병원균주 검출용 프라이머의 푸른곰팡이 병원균주 특이성을 확인하기 위하여, 표 3에 기재된 균주를 대상으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 표 4는 본 실시예에 따른 중합효소연쇄반응(PCR)의 반응 조건을 나타낸 것이다.

PCR의 증폭산물을 1.2%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여 DNA 다형성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도 1에 나타내었다.

비교예

종래에 논문을 통해 곰팡이병 원인균을 검출하는 프라이머를 본 발명의 프라이머와 비교하기 위하여, 동일한 균주를 대상으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 조건은 각 개발자가 제시한 방법을 사용하였다.

비교예 1

참고문헌 1(FEMS Microbiol Lett, 300(1):58-67)에 게재된 T. pleurotum 및 T. pleuroticola 검출용 프라이머를 이용하여, 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.

다음은 상기 T. pleurotum 및 T. pleuroticola 검출 프라이머의 정보(표 5 참조), 중합효소 연쇄반응의 반응조건(표 6 참조) 및 중합효소 연쇄반응을 진행한 균주 정보(표 7 참조)를 나타낸 것이다.

비교예 2

참고문헌 2(FEMS Microbiol Lett, 300(1):58-67)에 게재된 T. pleurotum 검출용 프라이머를 이용하여, 중합효소 연쇄반응을 진행하였다.

다음은 상기 T. pleurotum 검출 프라이머의 정보(표 8 참조), 중합효소 연쇄반응의 반응조건(표 9 참조) 및 중합효소 연쇄반응을 진행한 균주 정보(표 10 참조)를 나타낸 것이다.

결과

중합효소 연쇄반응의 증폭 결과

본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 진행한 결과, 일부 균주가 아닌, 버섯에서 푸른곰팡이병을 일으키는 병원균주 모두에서, 뚜렷하게 증폭된 결과가 나타났다.

따라서, 이를 이용하면, 버섯(예를 들면, 큰느타리 버섯)에 푸른곰팡이병을 일으키는 병원균주의 정밀하고 빠른 결과를 얻을 수 있을 것으로 확인되었다(도 1 참조).

반면, 비교예 1의 T. pleurotum 및 T. pleuroticola 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 진행한 결과, 전체 푸른곰팡이균주 중 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum, 2), 트리코더마 아트로비리데(Trichoderma atroviride, 3), 트리코더마 비렌스(Trichoderma virens, 5) 및 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum, 6)에서만 특이적으로 밴드가 검출되어 전체 푸른곰팡이병원균의 검출에는 한계가 있었다. 또한, 증폭된 밴드에서도 일부 다중 밴드가 검출되어 결과 해석에 어려움이 있었다(도 2 참조).

나아가, 비교예 2의 트리코더마 플레우로툼(Trichoderma pleurotum) 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 진행한 결과, 전체 푸른곰팡이균주 중 트리코더마 플레우로툼(Trichoderma pleurotum, 9)에서 특이적으로 밴드만 약하게 검출되어, 이를 이용하여, 전체 푸른곰팡이 균주의 검출여부를 판단하는 데에는 한계가 있었다(도 3 참조)

이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량할 수 있음이 명백하다. 본 발명의 단순한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

<110> Korea National College of Agriculture and Fisheries <120> Composition for detecting of the green mold in mushroom and detecting method using the same <130> NPF32282 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cgagtttaca actcccaaa 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaaagttggg tgtttaacg 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cacattcaat tgtgcccgac ga 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acctgttagc accagctcgc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cacattcaat tgtgcccgac ga 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcgacacaga gcacgttgaa tc 22

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트를 포함하며, 버섯 또는 버섯 액체종균 내의 푸른곰팡이 병원균을 검출하고,
상기 푸른곰팡이 병원균은 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 아트로비리데(Trichoderma atroviride), 트리코더마 코닌지(Trichoderma koningii), 트리코더마비렌스(Trichoderma virens), 트리코더마 플레우로티콜라(Trichoderma pleuroticola), 트리코더마 플레우로툼(Trichoderma pleurotum), 및 트리코더마 시트리노비리데(Trichoderma citrinoviride)인, 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 버섯은 느타리버섯, 큰느타리버섯, 및 잎새버섯 중 1종 이상인, 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물.
삭제
제1항 또는 제2항에 따른 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물을 포함하는, 푸른곰팡이 병원균 진단용 키트.
(i) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(ii) 상기 (i) 단계에서 분리한 DNA를 제1항의 푸른곰팡이 병원균 검출용 조성물을 이용하여 증폭하는 단계; 및
(iii) 상기 (ii) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 푸른곰팡이 병원균 검출 방법.