KR102098310B1 - 느타리버섯 품종 판별용 조성물 및 이를 이용한 느타리버섯 품종 판별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 세트를 포함하는, 느타리버섯 품종 판별용 조성물 및 이를 이용하는 느타리버섯 품종 판별 방법에 관한 것이다. 상기 본원발명의 구성에 의하면, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호를 비롯한 기타 주요 느타리버섯 품종을 한 번의 반응으로 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.

Description

느타리버섯 품종 판별용 조성물 및 이를 이용한 느타리버섯 품종 판별방법{Composition for identification of Pleurotus ostreatus cultivar and discrimination method using the same}

본 발명은 느타리버섯 품종 판별용 조성물 및 이를 이용한 느타리버섯 품종 판별 방법에 관한 것이다.

느타리버섯은 여러 대륙에 걸쳐 자생하는 균류이며, 주로 가을철에 포플러나무 미루나무 등의 활엽수 고사목에 발생하고 다른 버섯에 비해 넓은 재배기후대와 영양기질의 다양성으로 많은 국가에서 식용하고 있다. 느타리버섯은 세계적으로 가장 많이 생산되며, 우리나라에서도 생산량 53,532톤(2017년)으로 1위를 기록하였다.

우리나라에서 주로 재배되고 있는 느타리버섯류는 크게 느타리버섯(P. ostreatus), 큰느타리버섯(P. sajor-caju), 산느타리버섯(P. pulmonarius)으로 나뉜다.

또한, 우리나라 느타리버섯 품종은 1974년 농기 2-1호를 시작으로 균상이나 병재용 등으로 다양한 품종이 개발되어 현재 52종이 등록되어 있어 국내 육성품종 점유율이 40-50%(2011년)를 기록하여 버섯류 중 1위를 차지하고 있다.

한편, 느타리버섯은 품종에 따라 재배환경과 배지 요구조건이 다르고 수량과 품질차이가 많으므로 정확한 품종명을 알아야 하는데, 균사나 종균상태에서는 품종특성이 거의 나타나지 않으므로 느타리버섯 직접 길러보지 않고서는 품종판별이 어렵다.

실제 버섯생산 현장에서는 느타리버섯 품종혼용 사고가 빈발하고 있어 문제가 되고 있다. 느타리버섯 품종별로 재배법과 최적 환경이 다르기 때문에, 농가에서 원했던 품종이 아니면 수량 및 품질이 저하되어 혼란이 야기된다.

품종판별을 위하여 흔히 대치배양이나 버섯자실체 비교방법을 사용하는데, 정확도와 재현성이 떨어지고 시간이 많이 걸리는 작업이라 한계가 있다. 또한, 느타리버섯 중 화성2호, 화성5호, 화성6호 및 화성7호는 느타리버섯 농가에서 많이 재배되는 품종으로 자실체 모양이 일부 유사한 계통은 판별에 많은 시간과 노력이 요구된다.

또한 느타리버섯 품종판별과 관련된 종래 기술들은 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호를 비롯한 기타 주요 버섯 품종을 한 번의 반응으로 단시간에 정확하게 판별할 수 없고, 특히, 검출된 다중 밴드로 인해 결과 해석에 어려움이 있었다.

본 발명에 대한 배경기술로는 대한민국 등록특허 제10-1166781호(2012.07.12.)특허가 있다. 상기 특허문헌에는 미토콘드리아 DNA 다형성 분석과 관련된 느타리버섯류의 품종 판별 특이 프라이머 및 이의 용도가 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 느타리버섯 품종마다 특이적인 밴드를 생성할 수 있어, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호를 비롯한 기타 주요 느타리버섯 품종을 한 번의 반응으로 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 프라이머 세트를 이용하여 유사한 계통의 판별되기 어려운 느타리버섯 품종을 편리하고 신속하게 판별할 수 있는 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 이용하여, 검출 장소 및 시기에 상관없이, 1회 반응으로도 느타리버섯의 품종 판별이 가능한 검출 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 이용하여, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호를 비롯한 기타 주요 버섯 품종을 한 번의 반응으로 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 느타리버섯 품종 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

일 측면에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 세트를 포함하는, 느타리버섯 품종 판별용 조성물이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 느타리버섯 품종은 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호 중 1종 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 느타리버섯 품종은 농민 59호, 수한 1호, 흑타리, 원형 1호, 곤지 1호, 곤지 7호, 춘추 2호, 김제 9호 및 치악 3호 중 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 느타리버섯은 버섯 균사체 또는 버섯 자실체일 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본원의 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 포함하는, 느타리버섯 품종 판별용 키트가 제공된다.

또 다른 측면에 따르면, (i) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계, (ii) 상기 (i) 단계에서 분리한 DNA를 본 발명에 따른 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 이용하여 증폭하는 단계 및 (iii) 상기 (ii) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 느타리버섯 품종을 판별하는, 방법이 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 느타리버섯 품종은 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호, 화성 7호, 농민 59호, 수한 1호, 흑타리, 원형 1호, 곤지 1호, 곤지 7호, 춘추 2호, 김제 9호 및 치악 3호 중 1종 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 느타리버섯 품종마다 특이적인 밴드를 생성할 수 있는 프라이머 세트를 제공하여 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호를 비롯한 기타 주요 느타리버섯 품종을 한 번의 반응으로 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 느타리버섯 판별용 조성물을 이용하면, 버섯을 키우기 전, 품종의 판별이 가능하여, 실제 키우지 않고도, 1일 이내에 품종을 확인할 수 있다. 따라서, 해당 느타리버섯의 재배법 및 최적환경을 조성할 수 있고, 농가에서 원하는 품종을 정확하게 공급할 수 있고 느타리버섯의 품질 관리 및 수량을 향상시킬 수 있는 이점이 있다.

특히 버섯종균 배양소에서도 본원발명의 느타리버섯 판별용 조성물을 자체품질 보증에 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호의 PCR 반응 후 증폭 밴드의 양상 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호, 화성 7호 및 이외 주요 느타리버섯 품종에서 PCR 반응 후 증폭 밴드의 양상 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 비교예에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호, 화성 7호 및 이외 주요 느타리버섯 품종에서 PCR 반응 후 증폭 밴드의 양상 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

일 측면에 따르면, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 세트를 포함하는, 느타리버섯 품종 판별용 조성물이 제공된다.

본원에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그널을 직, 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머 세트는 분광학, 생화학, 광화학, 면역화학 또는 이외 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여, 증폭반응의 수행 시 표적서열의 유전자를 증폭시킬 수 있으며, 표적 염기서열의 증폭방법은, 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification), 전자 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), SDA(strand displacement amplification) 또는 리플리카아제(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 적당한 방법을 적용할 수 있다.

본원의 상기 프라이머 세트는 느타리버섯 품종마다 특이적인 밴드를 생성할 수 있어 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호를 비롯한 기타 주요 느타리버섯 품종을 한 번의 반응으로 신속하고 정확하게 판별할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 느타리버섯 품종은 화성2호, 화성5호, 화성6호, 화성7호 중 1종일 수 있다.

상기 느타리버섯의 품종 중 화성 2호는 저온성으로 배지온도가 27℃를 넘어 고온으로 배양되면, 배지 표면에 두꺼운 균사층이 발생하여, 배지표면이 단단해져, 버섯 발아가 지연될 수 있고, 수량감소를 초래할 수 있다. 화성2호의 생육온도는 7~15℃이고, 10~13℃ 범위에서 버섯 발생 및 생육이 좋고, 실내온도를 13~15℃로 관리하면, 생육기간을 단축시킬 수 있다.

상기 느타리버섯의 품종 중 화성 5호는 중고온성으로, 배지온도가 27~28℃를 넘지 않도록 주의해야 하며, 30℃ 이상의 온도에서 균사 배양이 되는 경우, 균덩이가 심하게 발생할 수 있다. 생육온도는 14~21℃이며, 15~18℃의 범위에서 버섯발생 및 생육이 우수하다. 생육기간은 7~9일이며, 초발이가 시작될 때까지 충분히 관수를 하여, 배지 표면이 마르지 않도록 관리하여야 한다.

상기 느타리버섯의 품종 중 화성 6호는 중온성 품종으로, 버섯 육질이 질기지 않고 단단하며, 쫄깃한 식감이 있고, 저장성이 좋다. 봉지재배에서 특징을 발휘해 배양온도는 20~22℃이며, 배양기간은 22~28일이다. 생육적 온도는 13~15℃로 생육초기부터 환기량이 많을 시 다발의 개체수가 많고 대가 가늘어질 수 있다. 또한, 생육중반부터 실내온도를 낮추고, 환기량을 충분히 늘려주면, 우수한 품질의 버섯을 생산할 수 있으며, 생육 중반부터는 가습을 줄여주는 것이 좋다.

상기 느타리버섯의 품종 중 화성7호는 화성 7호는 느타리버섯 병재배 및 소포장에 적합한 품종으로, 저장성이 좋고, 기존 품종에 비해 수량성이 높은 장점이 있다.

이와 같이, 상기 화성2호, 화성5호, 화성6호, 화성7호는 생육온도가 상이할 수 있고, 품종에 따라 환기량, 가습 및 생육온도를 적절하게 맞춰주어야 보다 우수한 버섯을 재배할 수 있다. 이에, 실제로 버섯을 키우기 전 버섯의 품종을 판별하는 것은 중요하다.

일 실시예에 따르면, 상기 느타리버섯 품종은 농민59호, 수한1호, 흑타리, 원형1호, 곤지1호, 곤지7호, 춘추2호, 김제9호 및 치악3호 중 1종 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 느타리버섯의 품종 중 농민 59호는 대한민국 우수 품종상을 수상한 품종으로, 농민버섯연구소에서 묘균주에서 단핵균주를 선발 후 우수 단핵균주를 선발하여, 흑백느타리를 교배하여, 우수한 특성의 균주를 선발한 것이다. 상기 느타리버섯의 품종 중 수한 1호는 균상재배용으로 육성된 품종으로 도매시장 등에서의 농가 수취가격이 높은 편이며, 전체적인 외형이 우수한 품종이다. 경기도가 개발한 느타리버섯 흑타리는 씹는 맛이 좋고 유통 시 파손이 적고, 저온에서 저장 시 25일 이상 저장이 가능하다. 상기 느타리버섯의 품종 중 원형 1호는 전통적 육종방법이 아닌 원형질체 융합법에 의해 육성되었으며, 볏짚 배지에서 생산량이 가장 높고, 폐면에서도 생산량이 양호한 편이다. 불량률이 거의 없어, 상품화율은 높은 편이다. 상기 느타리버섯의 품종 중 곤지 1호는 병재배용으로 다수확품종이며, 곤지 7호는 '16 년 기준 시장 보급률 20%를 기록하며, 전국으로 보급이 확대되었다. 상기 느타리버섯의 품종 중 춘추 2호는 수집균주의 선발육정에 의해 육성된 품종으로 가을이 재배 적기이며, 병재배가 가능하다. 김제 9호는 4개절 내서성, 내한성 및 수량성이 뛰어나며, 치악3호는 내서성은 다소 떨어지나, 가을 - 겨울에 내한성 및 수량성이 뛰어나다. 이는 모두 현재 농가에서, 많이 사용하고 있는 품종 들이다.

상기 품종 중 일부 자실체 모양이 유사한 계통들은 판별에 많은 시간과 노력이 요구된다. 또한, 상기 품종은 각각 특성이 상이하여, 농가의 필요성 및 해당 느타리버섯의 재배배지의 적합한 조성을 위해서는 품종을 빠르게 판별할 필요가 있다. 이에, 본 발명의 조성물을 이용하면, 품종별로 특이한 패턴으로 DNA 단편이 증폭되어, 상기 다수의 느타리버섯 품종을 판별할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 한 번의 반응으로 상기 느타리버섯의 여러 품종을 단시간에 특이적으로 판별할 수 있고, 버섯을 키우기 전에 품종의 판별이 가능하다.

일 실시예에 따르면, 상기 느타리버섯은 버섯 균사체 또는 버섯 자실체일 수 있다. 본 발명에서 PCR에 사용하는 시료는 버섯 균사체 또는 자실체로부터 gDNA(게노믹 DNA, genome DNA)를 분리하여 사용할 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본원의 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 포함하는, 느타리버섯 품종 판별용 키트가 제공된다.

본 발명의 키트는 상기 프라이머 세트 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

또한, 상기 키트는 이에 한정하는 것은 아니나, PCR 분석을 수행하기 위한 필수 요소를 포함하는 키트가 적합할 수 있다. 상기 키트에는 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 4를 포함하는 프라이머 세트 이외에도 핵산추출, 증폭, 생성물 검출용 시약 및 이에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있고, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 완충액, DNA 중합효소, dNTPs, DNase 억제제, RNase, 버퍼 및 멸균증류수 등을 포함할 수 있다.

다른 예로서는, 본 발명의 키트는 DNA chip 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA chip 분석용 키트는 서열번호 1 내지 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편과 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 부착되어 있는 기판과 형광 표시된 프로브를 제작하기 위한, 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있고, 상기 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 측면에 따르면, (i) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계 (ii) 상기 (i) 단계에서 분리한 DNA를 본 발명에 따른 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 이용하여 증폭하는 단계 및 (iii) 상기 (ii) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 느타리버섯 품종을 판별하는, 방법이 제공된다.

상기 DNA를 분리하는 (i) 단계는 이 기술 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나, 버섯완전배지(MCM)에 균사를 접종하여 균사 배양 후 채취하여 균사체를 전자레인지에서 처리, 냉각처리 및 원심 분리하여, 이용할 수 있다. 상기 분리된 gDNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.

상기 표적 서열의 증폭하는 (ii) 단계는 PCR을 통해 수행될 수 있다. 상기 PCR의 프라이머 어닐링 온도는 50~65℃일 수 있으며, 58~62℃이 더 적합할 수 있고, 익스텐션 온도는 65~80℃ 일 수 있으며, 68~ 75℃이 더 적합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 PCR은 통상의 PCR용 기기를 사용하여 실시할 수 있으며, 상기 PCR용 기기는 예를 들면, 실시간 PCR용 기기, 열 블록 PCR(Thermal Block PCR)용 기기, 디지털 PCR용 기기일 수 있으며, 일예로, QX200(BioRad사, 미국)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 PCR용 기기는 동시에 1종 이상의 느타리버섯 품종을 판별할 수 있으며, 추가로 표적 핵산의 양을 정량화 할 수 있다.

상기 증폭된 산물을 확인하는 (iii) 단계는 이에 한정하는 것은 아니나, PCR이 완료된 PCR 증폭산물을 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여, 형성된 DNA 밴드를 UV로 조사하여 검출하거나, 디지털 PCR의 드롭렛 리더에 장착하여 형광 표지된 값을 확인하고 계수하여 다수의 느타리버섯 품종에서 나타나는 패턴 양상을 동시에 확인할 수 있다.

상기 형광 표지는 FAM(5- 또는 6-카르복시플루오레세인), VIC, NED, 플루오레세인, FITC, IRD-700/800, CY3, CY5, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, BODIPY TMR, 오레곤 그린(Oregon Green), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 텍사스 레드(Texas Red), 야키마 옐로우(Yakima Yellow), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) PET, 바이오서치 블루(Biosearch Blue™), 마리나 블루(Marina Blue), 보텔 블루(Bothell Blue), 350 FAM™, SYBR green, 플루오레세인, EvaGreen™, 알렉사 플루오르 488 등에서 선택될 수 있으며, 형광 표지 물질은 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르고, 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 물질은 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 물질에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.

일 실시예에 따르면, 상기 판별 가능한 느타리버섯 품종으로는 이에 한정하는 것은 아니나, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 화성 7호, 농민 59호, 수한 1호, 흑타리, 원형 1호, 곤지 1호, 곤지 7호, 춘추 2호, 김제 9호 및 치악 3호 중 1종 이상일 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용한 예만을 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예

느타리버섯 품종 판별을 위한 프라이머 세트 제작

1. 느타리버섯 단핵균사 유전체 서열 분석 및 SSR 분석

품종에 특이한 밴드를 탐색하기 위하여, 느타리버섯 흑타리, 곤지 7호의 모균주인 MT07156-97의 단핵균사의 유전체를 분석하였다. 상기 분석 방법으로는 차세대염기서열분석법(Next Generation DNA sequencer, NGS)인 MiSeq를 이용하여 유전체의 염기서열을 해독하였고, SSR(단순반복염기서열, simple sequence repeat)을 분리하였고, 상기 SSR서열을 PCR로 증폭할 수 있도록, 상기의 프라이머 GC % 합성기준에 맞추어 프라이머 271세트를 디자인하고, 합성하였다.

느타리버섯의 염색체는 반복서열(repeatitive sequence) 비중이 높아 분석을 용이성을 위하여 핵이 하나 있는 단핵균사인 MT07156-97를 분석하였다. MT07156-97를 버섯완전배지 아가배지에 키운 후 살균메스로 가로세로 1cm인 플러그로 잘라서 5조각을 버섯완전배지 액체배지 150ml에 접종하여 25℃, 120 rpm에서 10일 배양하고 균사체를 회수하여 gDNA추출에 사용하였다.

여기서, DNA를 분리하기 위하여 균사체를 동결건조 후, 또는 생체를 액체질소를 사용하여 분말로 만든 후, 100 ㎍를 1.5 ml의 시험관에 옮기고, DNA 추출 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0; 200 mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5 % SDS) 400 ㎕와 프로테아제 K (20mg/ml)를 첨가한 다음, vortex를 사용하여 균사체가루가 완충액과 완전히 혼합되도록 하고, 37 ℃ 항온기에서 1시간 반응시켜 균사체가루와 완충액을 혼합시킨 혼합액을 만들었다.

이때, 상기 혼합액에 2 ×CTAB(sigma) 완충액을 동량 첨가하여 65℃에서 15분간 방치한 다음, 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 넣고 vortex를 2분정도 사용하여 완전히 혼합하였다.

혼성화된 액을 12,000 rpm에서 원심분리하여 분리되는 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 원액의 ×0.7 부피배의 이소프로판올을 첨가하여 실온에서 10분간 두어 DNA를 침전시킨 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하였다.

그리고, 침전된 DNA에 70%의 에탄올을 넣어 3-4번 상하로 조심스레 흔들어 세척하고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 에탄올을 조심스레 기울여 버리고 건조한 다음, TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 100 ㎕에 용해하였다.

여기서, 상기 DNA 용액을 RNase(10 mg/ml) 2㎕를 넣어 37 ℃에서 30분 처리하여 RNA를 분해제거하고, 농도를 Nano DROP(Nano DROP Technologies)로 측정하였다. gDNA 10.3ug을 얻어서 MiSeq platform(Illumina 사)으로 서열 분석하고 어셈블리(assembly)하여 총 41.1Mb의 유전체서열을 얻었다.

여기서 유전체 정보에서부터 SSR을 분석하기 위하여 SSR locator(http://microsatellite.org/ssr.php)을 사용하여 271개의 SSR을 찾아내었고 이를 PCR로 증폭하기 위하여 Primer3(v. 0.4.0)을 이용하여 프라이머 세트를 디자인하였다.

2. 느타리버섯 균사에서 gDNA 추출

버섯완전배지에 느타리버섯 품종 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호의 균사를 접종하고, 균사 배양 후 균사체를 이쑤시개를 이용하여 채취하였다. 상기 균사체를 TE buffer(pH 7.4) 100㎕에 넣고 전자레인지(700w)에서 1분 간격으로 2회 처리하였다. 상기 균사의 배양은 최소 10분간 -20℃에서 냉각하고, 5분간 10,000rpm에서 원심분리를 진행하였다. 이후, 농도를 측정하고, PCR(polymerase chain reaction)을 진행하였다.

PCR 반응 총량은 20㎕으로 하고, 각 균주의 균사체로부터 분리한 게놈 DNA 20 ng과 4종류의 dNTP(각 2.0 mM), 내열성 DNA 중합효소(e-taq polymerase, Solgent, Korea) 1.0 unit, 10 pmol 프라이머, 20 ng 버섯 gDNA 및 완충용액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 0.01 % 젤라틴)을 완전히 혼합하였다.

상기 유전체 서열분석에서 얻는 SSR 프라이머를 이용하여, 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호의 균사체에서 유래한 gDNA를 사용하여 PCR반응을 진행하고, 품종별로 특이한 DNA 산물이 다형화 양상을 확인하였다.

PCR반응은 E02(Astec)를 사용하여 실시하였고, 반응조건은 95 ℃에서 3분간 유지하여 DNA를 변성시키고, 어닐링(annealing) 온도를 55℃로 40 sec, 증폭(extension)온도를 72℃로 30 sec로 35 사이클을 진행하였다. 이후 72 ℃로, 5분간 마지막 합성을 진행하였다.

PCR의 증폭산물을 3.0%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여 DNA 다형성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, 이를 도 1에 나타내었다.

3. 느타리버섯 품종 판별용 특이 프라이머 제작

상기 유전체 서열분석에서 얻는 271개의 SSR 프라이머 세트와 느타리버섯 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호 및 화성 7호 균사에서 추출한 gDNA와 PCR을 하여, 증폭되는 DNA의 다형화 현상을 확인하였다. 이 중, 증폭되는 DNA가 서로 다른 다형화 현상이 나타난 프라이머 세트를 선별하여, 추가로, 농가에서 많이 사용하고 있는 다른 여러 느타리버섯 품종에 적용하여, PCR을 진행 후 다형화 현상의 양상을 관찰하였다.

느타리버섯 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호, 화성 7호 및 농가에서 많이 사용하고 있는 품종의 학명, 일반명 및 품종명을 하기 표 1에 나타내었다.

상기 다형화 현상 양상을 바탕으로, SSR 서열을 증폭할 수 있도록 디자인 된 프라이머 세트와 다수의 품종에서도 서로 다른 다형화 현상이 나타나는 두 개의 프라이머 세트를 혼합하여, PCR을 진행 후 최적의 프라이머 세트 조합을 선별하였다. 이들 프라이머 염기서열은 하기 표 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 느타리버섯 판별용 프라이머의 다형화 양상을 확인하기 위하여, 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 표 3은 본 실시예에 따른 중합효소연쇄반응(PCR)의 반응 조건을 나타낸 것이다.

PCR의 증폭산물을 3.0%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여 DNA 다형성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도 2에 나타내었다.

비교예

종래에 논문을 통해 느타리버섯 품종을 판별하는 프라이머를 본 발명의 프라이머와 비교하기 위하여, 동일한 균주를 대상으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 조건은 각 개발자가 제시한 방법을 사용하였다.

본 발명과 비교하기 위해 사용한 프라이머는 느타리버섯 품종 수한 1호, 화성 2호 및 김제 9호의 판별을 위한 PCR 프라이머로 서열은 표 4에 나타나 있다. 상기 프라이머를 이용하여, 표 5에 따른 중합효소연쇄반응(PCR)의 반응 조건으로 PCR을 수행하였다.

결과

중합효소 연쇄반응의 증폭 결과

본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 다중중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 진행한 결과, 화성2호, 화성5호, 화성6호 및 화성7호를 명확히 판별할 수 있는 PCR 증폭밴드가 나타났다(도 1 참조). 이를 확대하여 농가에서 많이 사용하는 흑타리, 곤지7호, 수한1호 등에 적용한 결과, 품종 간에 차이를 확인할 수 있는 다형화 밴드를 확인할 수 있었다(도 2 참조).

반면, 본 발명의 비교예에 따른 프라이머를 이용하여 PCR을 수행할 결과, 화성 2호 및 화성 6호는 판별되지 않았으며, 곤지 7호 및 화성 7호도 동일한 패턴을 보여 명확하게 판별할 수 있는 다형화가 나타나지 않았다. 또한, 수한 1호 및 흑타리 품종도, 유사 패턴의 다형화가 나타나 결과해석에 어려움이 있었다(도 3 참조). 이와 같이, 본 발명의 비교예에 따른 종래의 프라이머로는 본 발명의 프라이머와 같이 단시간, 한 번에 다수의 느타리버섯의 품종을 판별할 수 없었다.

이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량할 수 있음이 명백하다. 본 발명의 단순한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 속하는 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

<110> Korea National College of Agriculture and Fisheries <120> Composition for identification of Pleurotus ostreatus cultivar and discrimination method using the same <130> NPF33100 <160> 4 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agtagctcta gtcgcataac gc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tctatatacc gagctgtggc tt 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tagcaccact aacagcacaa ac 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccagtgttcg ggataaagaa ta 22

Claims (7)

1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 제1 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 제2 프라이머 세트를 포함하고,
   화성 2호, 화성 5호, 화성 6호, 화성 7호, 농민 59호, 수한 1호, 흑타리, 원형 1호, 곤지 1호, 곤지 7호, 춘추 2호, 김제 9호, 및 치악 3호 중에서 각각의 느타리버섯 품종을 판별하는, 느타리버섯 품종 판별용 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 느타리버섯은 버섯 균사체 또는 버섯 자실체인, 느타리버섯 품종 판별용 조성물.
   
5. 제1항 또는 제4항에 따른 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 포함하는, 느타리버섯 품종 판별용 키트.
   
6. (i) 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
   (ii) 상기 (i) 단계에서 분리한 DNA를 제1항의 느타리버섯 품종 판별용 조성물을 이용하여 증폭하는 단계; 및
   (iii) 상기 (ii) 단계에서 증폭된 PCR 산물을 확인하는 단계를 포함하는, 느타리버섯 품종을 판별하는 방법으로,
   상기 느타리버섯 품종은 화성 2호, 화성 5호, 화성 6호, 화성 7호, 농민 59호, 수한 1호, 흑타리, 원형 1호, 곤지 1호, 곤지 7호, 춘추 2호, 김제 9호, 및 치악 3호 중에서 각각의 느타리버섯 품종을 판별하는 것인, 방법.
   
7. 삭제

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