KR20110086264A - 느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 느타리 품종 중 수한 계통을 판별하기 위한 특이 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 느타리 품종 중 수한 계통을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 느타리 품종 중 수한 계통을 판별하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 느타리 품종 중 수한 계통을 판별하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트 및 이의 용도는 환경의 영향을 받지 않고, 품종 자체의 고유성을 검정할 수 있는 기술로서, 품종 구별 시 표현형적 특성을 대체 보완할 수 있는 것으로 활용도가 높다.

Description

느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도{Specific primers for discriminating Suhan strains in Pleurotus ostreatus, and uses thereof}
본 발명은 느타리버섯 품종 중 수한 계통을 판별하기 위한 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 SCAR 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하는 방법에 관한 것이다.
DNA 다형성 분석법 중 RAPD (Ramdom Amplified Polymorphic DNA) 방법은 분석이 쉽고, 간편하기 때문에 가장 보편적으로 이용되어 왔으나, 반응조건에 따라서 결과가 달라질 수 있기 때문에 정확한 실험결과를 기대하기가 어려웠다 (Cutler et al . 2006 Scientia horticulturae 107: 264~270). 따라서 이러한 문제의 해결책으로 RAPD 분석결과에서 생성된 특이 밴드들을 클로닝(cloning) 및 염기서열분석 과정을 거쳐 새로운 SCAR (Sequenced Characterized Amplified Region) 프라이머를 제작하여 특정 DNA 단편을 재현성 있게 증폭하는 SCAR 마커가 개발되었다.
RAPD 마커의 SCAR 마커로의 전환은 상추에서 노균병(downy mildew) 저항성 마커로 처음 개발되었으며 (Paran et al . 1993 Theor Appl Genet 85: 985~993), Bang 등 (2004 Korean J Medicinal Crop Sci 12: 53~59)은 백출의 기원식물 판별에 이용하여 유통 건재약재를 판별하였다. 또한 Koveza와 Gostimsky (2005 Russian J of Genetics 41: 1254~1261)는 다양한 완두 품종과 변종들을 식별하기 위한 SCAR 마커를 개발하였고, Lee 등 (2006 Biol Pharm Bull 29: 629~633)은 다른 동속 식물로부터 애엽 (Artemisia Herb)을 선택적으로 감별하기 위해 특이 마커를 개발한 바 있다.
Lee 등 (2004 Theor Appl Genet 108: 1487~1491)은 18S rDNA, RAPD, SCAR 마커를 이용하여 돌배 (Pyrus pyrifolia)와 서양배 (P. communis)의 품종을 구분하는 연구를 하였는데, 이들 마커가 배나무 (Pyrus) 종을 구분하는데 효율적이라고 보고하였다. Hongyan 등 (2008 World J Microbiol Biotechnol 24: 1223~1226)도 약용버섯인 영지 (Ganoderma lucidum)를 확실히 구분할 수 있는 계통 특이적 SCAR 마커를 ISSR 마커로 전환하여 개발하였다. 또한 SCAR 마커는 병 저항성 유전자나 온도 민감성 유전자의 탐색과 같은 분야에서도 효율적으로 이용되고 있다 (Dedryver et al . 1996 Genome 39: 830~835; Lang et al . 1999 Heredity 131: 121~127).
RAPD는 우성유전자가 발현된다는 성질과 실험의 민감성 때문에 실용화 문제에 제한이 있으나, 우성인 RAPD 마커의 공우성 SCAR 마커로의 전환은 F2 집단에 대한 분석에 많은 도움을 주어 유전자연관지도 작성 등에 유용하게 이용될 수 있다 (Paran 및 Michelmore, 1993 Theor Appl Genet 85: 985~993). 즉, SCAR는 RAPD 표지인자의 불안정성을 개선하기 위해 선발된 RAPD 밴드의 염기서열을 분석하여 종간, 종내 특이 밴드의 염기서열 정보로부터 프라이머를 제작한 후 높은 어닐링(annealing) 온도에서 PCR을 수행하여 표지인자를 선발하는 방법으로서 단일 밴드로 나타나며 프라이머 설계를 바꾸어 공우성 마커(co-dominant marker)로 전환할 수 있기 때문에 유전분석에 유리하고 이형접합체의 분석이 가능한 장점이 있다 (Negi et al . 2000 Theor Appl Genet 101: 146~152).
느타리버섯은 2000년부터 품종보호대상 작목으로 지정되었으나 2009년 현재 국립종자원에 121 품종이 생산수입판매신고되어 있고 이 중 품종보호등록된 품종 수는 27개에 불과하여 아직 대다수의 품종은 생산판매신고만으로 유통이 되고 있다. 이들 품종은 육성경위에 대한 기초자료도 없어 품종의 구별성이 모호한 실정이다. 현재의 품종보호등록과 생산수입판매신고의 이원화된 체제에서는 소비자에게 인기 있는 품종을 중심으로 복제하여 다른 이름으로 유통될 수 있다. 하지만 자실체의 모양으로는 복제된 품종을 구분하기 어려운 실정이다.
국내에서 재배되고 있는 느타리 품종은 생산ㆍ판매 신고된 명칭으로 종균을 사용하고 있으며, 품종의 정체성과 특성이 명확하게 알려져 있지 않아 재배농가에 혼선을 가져오며, 동일 품종이 다른 이름으로 재배되는 경우도 있어 문제점으로 지적되고 있다. 또한 국내의 육종 여건 또는 종자산업법 운영상 유통품종의 상당 부분이 유사하고 그만큼 유통체계 질서가 혼란스러운 경우가 있다.
본 발명은 느타리버섯 품종 중 수한 계통을 판별하기 위하여 환경의 영향을 받지 않으며, 품종 자체의 고유성을 검정할 수 있는 기술을 개발하여 유통품종 중 수한 계통 품종을 확인해 달라는 민원을 해결할 수 있으며, 표현형적 특성을 대체 보완할 수 있는 분자표지를 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 SCAR 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 느타리버섯 품종 중 수한 계통을 판별할 수 있는 DNA 다형성 검정방법으로서 환경의 영향을 받지 않고, 품종 자체의 고유성을 검정할 수 있는 기술로서 품종 구별 시 표현형적 특성을 대체 보완할 수 있어 활용도가 높다고 할 수 있다.
DNA는 재배환경이나 발육단계, 조직에 따른 영향을 받지 않으므로 분자생물학적 마커를 이용한 품종 구분은 객관성을 유지할 수 있어 높은 신뢰성을 줄 수 있다. 또한 이와 같은 분자생물학적 방법에 기초를 둔 해석은 직접적인 품종육성 및 품종의 판별뿐 아니라, 종간 또는 종내 변이 정도 및 근연관계를 구명하는 방법인 동시에 유전육종관련 기초연구에 활용할 수 있다.
도 1은 1.5% 아가로즈 겔상에서 S-Op-1 마커에 대한 PCR 조건 검정을 보여준다. N: 증폭 산물 없음.
도 2는 S-Op-1 프라이머를 사용하여 증폭된 느타리속 (Pleurotus species) DNA의 SCAR-PCR 산물을 보여준다.
도 3은 S-Op-1 (정방향) 및 S-Op-1 (역방향) 프라이머로 증폭된 수한 유사 계통에 대한 SCAR 마커를 보여준다. 590 bp 단편이 수한 유사 계통에서 증폭되었다. M: 1 kb 플러스 DNA 래더(ldder) (TaKaRa); Ⅰ, 원형(Weonhyeong) 유사 계통; Ⅱ, 왕흑평(Wangheukpyeong) 유사 계통; Ⅲ, 수한 유사 계통; Ⅳ, 춘추-2(Chunchu-2) 유사 계통.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 프라이머 세트를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 프라이머 세트는 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 마커로 이용된다. 상기 마커를 개발하기 위해, 먼저 느타리속 8 종을 포함한 81 개 품종을 대상으로 RAPD 분석을 실시하여, 수한 계통 품종에 특이적인 약 600 bp 크기의 밴드를 찾아, 상기 특이 밴드를 대상으로 클로닝(cloning)과 염기서열분석을 수행하였다. 상기 염기서열정보를 바탕으로 RAPD 랜덤(random) 프라이머 서열에 10~12 bp의 염기를 추가하여 SCAR 프라이머들을 제작하여, 상기 제작된 SCAR 프라이머들을 이용하여 원형 유사 계통, 왕흑평 유사 계통, 수한 유사 계통, 및 춘추-2 유사 계통을 대상으로 PCR을 수행한 결과 수한 유사 계통에서 특이적인 밴드를 보이는 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 선발하였다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 느타리버섯 수한 계통을 판별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
느타리버섯에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 느타리버섯 수한 계통을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 느타리버섯 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 반응의 프라이머의 어닐링(annealing)은 60℃~68℃에서 25초~35초간 수행하며, 바람직하게는 65℃에서 30초간 수행할 수 있다. 상기 증폭 반응의 사이클은 28~33회, 바람직하게는 30회 수행할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SCAR 프라이머 제작
RAPD 프라이머를 이용한 PCR 결과, 약 600 bp 부근에서 수한 계통 품종에 대한 특이 밴드를 찾아, 상기 특이 밴드를 대상으로 클로닝(cloning)과 염기서열분석을 수행하였다. 상기 염기서열정보를 바탕으로 random 프라이머 서열을 포함한 염기에 10~12 bp의 염기를 추가하여 SCAR 프라이머 (S-Op-1, 정방향 22 mer, 역방향 20 mer)를 제작하였다.
느타리버섯 '수한'의 분석에 사용된 SCAR 프라이머
SCAR 프라이머 뉴클레오티드 서열 (5'
Figure pat00001
3')		 서열번호 GC (%) T m (℃)
S-Op-1 (정방향) CAGCACCCACATAGAAACAATC 1 45.45 59.50
S-Op-1 (역방향) TACGCTGCCGGGTTAGTATC 2 55.00 54.10
실시예 2. S-Op-1 마커의 PCR 증폭
S-Op-1 마커의 PCR 증폭은 ABI PCR SYSTEM 9700을 이용하였다. 최초 DNA의 열변성을 위하여 94℃에서 5분간 1 회 후, 94℃에서 1분간의 변성, 65℃에서 30초간 어닐링(annealing), 72℃에서 2분간 연장(extension) 과정을 총 30 회 수행하였을 때 가장 양호한 밴드를 형성하여, 상기 조건을 수한 계통 품종의 판별조건으로 제시하였다 (도 1). PCR 조건이 맞지 않아도 비특이적 밴드가 나올 수 있기 때문에 어닐링 온도를 높여가며 실험을 하였고, 상기 프라이머의 결합 부위는 수한 계통 품종들에만 특이적으로 작용하기 때문에 다른 품종들에서는 밴드가 나타나지 않았다.
실시예 3. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 수한 계통의 특이적 검출
느타리속 8 종을 포함한 81 개 품종을 대상으로 S-Op-1 프라이머를 이용하여 PCR 했을 때 수한 계통 품종으로 판별된 품종들이 모두 동일한 밴드를 보였으며, 590 bp에서 단일 밴드가 나타나 다른 품종들과 구분이 용이하며, 랜덤(random) 프라이머 사용 시와는 다르게 밴드의 재현성이 높으며, 진하고 명확한 밴드를 볼 수 있었다 (도 2 및 3).
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Specific primers for discriminating Suhan strains in Pleurotus ostreatus, and uses thereof <130> PN10014 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER S-Op-1 F <400> 1 cagcacccac atagaaacaa tc 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER S-Op-1 R <400> 2 tacgctgccg ggttagtatc 20

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하는 느타리버섯 '수한' 계통을 판별하기 위한 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) 프라이머 세트.
  3. 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 느타리버섯 수한 계통을 판별하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
  5. 느타리버섯에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 느타리버섯 수한 계통을 판별하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 반응의 프라이머의 어닐링(annealing)은 60℃~68℃에서 25초~35초간 수행하며, 상기 증폭 반응의 사이클은 28~33회인 것을 특징으로 하는 방법.
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