KR20160115871A

KR20160115871A - 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호의 판별을 위한 pcr 프라이머

Info

Publication number: KR20160115871A
Application number: KR1020160103866A
Authority: KR
Inventors: 류재산; 김민근; 김희대; 정완규; 박보경
Original assignee: 경상남도
Priority date: 2016-08-11
Filing date: 2016-08-11
Publication date: 2016-10-06
Also published as: KR101835224B1

Abstract

본 발명은 느타리버섯 품종별로 DNA 단편이 특이한 패턴으로 증폭되는 느타리버섯의 품종판별을 위한 PCR 프라이머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에 특이한 패턴으로 증폭하여 품종을 확인할 수 있는 방법을 제공하는 것에 그 하나의 목적과, 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에서만 특이한 패턴으로 존재하는 DAN 단편을 제공하는 것에 또 하나의 목적과, 느타리버섯의 품종별로 특이한 패턴으로 DNA가 증폭되도록 하는 방법을 제공하는 것에 또 다른 목적이 있다.
이상과 같이 구성되는 본 발명은 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 판정할 수 있는 특이패턴의 DNA단편을 확인하고, 이 특이패턴의 DNA단편을 검출할 수 있는 방법 및 특이 프라이머를 제공하여 느타리버섯의 품종을 신속, 정확하게 판별할 수 있는 등의 효과를 제공하게 된다.
[색인어]
느타리버섯, 품종판별마커, 중합효소연쇄반응(PCR), 프라이머

Description

느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호의 판별을 위한 PCR 프라이머{PCR PRIMERS FOR DETERMINATION OF CULTIVARS OF PLEUROTUS OSTREATUS, SUHAN-1HO, WHASUNG-2HO AND GIMJE-9HO}

본 발명은 느타리버섯(Pleurotus ostreatus) 품종별로 특이한 패턴으로 DNA 단편이 증폭되는 느타리버섯 품종 판별을 위한 PCR 프라이머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 느타리버섯 유전체 서열 중 단순반복서열(SSR; Simple Sequence Repeat)을 찾아내고 이를 포함하여 증폭되게 고안된 프라이머를 이용하여 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에서만 특이하게 존재하는 중합효소연쇄반응(PCR; Polymerase Chain Reaction)의 다형성 밴드(polymorphic band)를 분리 및 염기배열을 결정하여 느타리버섯품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 정확하게 특이적으로 검출할 수 있는 느타리버섯 품종 판별을 위한 PCR 프라이머에 관한 것이다.

느타리버섯은 여러 대륙에 걸쳐 자생하는 균류로 주로 가을철에 포플러나무 미루나무 등의 활엽수 고사목에 발생하고 다른 버섯에 비해 넓은 재배기후대와 영양기질의 다양성으로 많은 국가에서 식용하고 있다. 세계적으로 가장 많이 생산되며, 우리나라에서도 생산량 76,389톤(2014년)으로 1위를 기록하였다.

우리나라 느타리버섯 품종은 1974년 농기2-1호를 시작으로 균상이나 병재용 등으로 다양한 품종이 개발되어 현재 52종이 등록되어 있어 국내 육성품종 점유율이 40-50%('11년)를 기록하여 버섯류 중 1위를 차지하고 있다. 한편, 느타리버섯은 품종에 따라 재배환경과 배지 요구조건이 다르고 수량과 품질차이 많으므로 정확한 품종명을 알아야 하는데, 균사나 종균상태에서는 품종특성이 거의 나타나지 않으므로 품종판별이 어렵다. 판별을 위하여 흔히 대치배양이나 버섯자실체 비교방법을 사용하였는데, 수한1호, 김제9호, 화성2호 등과 같이 자실체 모양이 유사한 계통은 판별에 많은 시간과 노력이 요구되어 한번의 반응으로 단시간에 여러 품종을 정확하게 판별하는 새로운 판별기술이 필요하다.

품종특이 프라이머와 PCR(Polymerase Chain Reaction;중합효소연쇄반응)를 사용하면 기존 방법보다 시간이 1/10로 줄어들게 된다. 따라서, PCR과 특이프라이머에 의한 다형화현상을 이용한 종의 분류나 특이 형질의 검출, 유연관계분석은 널리 사용되는 핵산지문기술이다.

현재 가장 많이 쓰이고 있는 방법은 RAPD, RFLP, AFLP와 SSR 등이 있는데 RFLP를 제외한 세가지 방법은 PCR의 기술을 근간으로 하고, PCR 기술은 열에 견디는 DNA 중합효소를 사용하여 프라이머로 불리는 짧은 핵산염기와 핵산서열의 원료인 dNTP와 완충용액을 포함하여 DNA 변성 → 프라이머 붙이기 → 합성 → DNA변성과정을 반복하여 프라이머에 상보적인 특이 서열을 증폭하는 기술이다. PCR 산물의 확인은 정제된 아가로스에서 전기를 사용하여 전개한 후, 염색시약(Safeview)으로 염색한 후 DNA 밴드를 검출한다. 이 방법은 소량의 게놈DNA(10-50ng)로도 정확하고 간단하게 생물의 다양한 형질을 확인할 수 있다. 기존에 개발된 버섯품종 판별 프라이머에 대한 특허는 국내공개특허인 "미토콘드리아 DNA 다형성 분석에 의한 느타리버섯류의 품종 판별 특이 프라이머 및 이의 용도(등록번호 1011667810000, 2012.07.12)", "느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도(등록번호 1011377990000, 2012.04.12)", ""느타리버섯 원형 계통 판별용 특이 프라이머 이의 용도(등록번호 1011378030000, 2012.04.12)"가 있으나 이들 특허내용에 제시된 프라이머는 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에서 판별력을 제공하지 못하였다.

[특허1] 미토콘드리아 DNA 다형성 분석에 의한 느타리버섯류의 품종 판별 특이 프라이머 및 이의 용도(등록번호 1011667810000, 2012.07.12) [특허2] 느타리버섯 수한 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도(등록번호 : 1011377990000, 2012.04.12) [특허3] 느타리버섯 원형 계통 판별용 특이 프라이머 및 이의 용도(등록번호 : 1011378030000, 2012.04.12)

본 발명은 이러한 문제점들을 해결하기 위해 안출된 것으로, 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에 특이한 패턴으로 증폭하여 품종을 확인할 수 있는 프라이머를 제공하는 것에 그 하나의 목적과, 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에서만 특이한 패턴으로 존재하는 DAN 단편을 제공하는 것에 또 하나의 목적과, 느타리버섯의 품종별로 특이한 패턴으로 DNA가 증폭되도록 하는 방법을 제공하는 것에 또 다른 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 각각에 특이성을 가지는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4인 DNA 서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4의 DNA 단편의 존재유무를 버섯 균사체에서 확인함으로써 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호을 판정하는 검정방법을 제공한다.

그리고, 본 발명은 서열번호 5와 서열번호 6의 염기서열의 19 혹은 20 mer를 포함하는 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호을 판정하는 검정용 프라이머를 제공한다.

이상과 같이 구성되는 본 발명은 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호을 판정할 수 있는 특이 DNA단편을 확인하고, 이 특이 DNA단편을 검출할 수 있는 방법 및 특이 프라이머를 제공하여 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 신속, 정확하게 판별할 수 있는 등의 효과를 제공하게 된다.

[도1] 단순반복서열 증폭 프라이머 184를 이용하여 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호와 곤지7호, 흑타리, 춘추2호, 원형1호, 구슬, 한라2호의 균사체의 게놈DNA를 PCR하여 DNA다형성 밴드를 관찰한 것이고,
[도2] 본 발명의 프라이머 JHH SSR 184 F와 JHH SSR 184 R을 이용하여 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 균사체를 PCR하여 품종별로 특이 밴드양상을 나타내는 것인데, 그림상의 ①은 서열번호 1의 특이 DAN밴드, ②는 서열번호 2의 특이 DAN밴드, ③은 서열번호 3의 특이 DAN밴드, ④는 서열번호 4의 특이 DAN밴드를 나타내고,
[도3] 본 발명의 프라이머 JHH SSR 184 F와 JHH SSR 184 R을 이용하여 느타리버섯 품종 곤지7호, 흑타리, 춘추2호, 원형1호, 구슬, 한라2호에서 각 품종별로 나타나는 특이 밴드의 양상을 나타내는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 이하에서 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에서 특이패턴으로 DNA 단편이 증폭됨을 확인하였고, 이 특이적으로 증폭된 단편을 이용하여 디자인된 프라이머를 이용하여 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호의 검정방법을 제공하도록 구성되어 있다.

이때, 본 발명에서 느타리버섯 품종특이 DNA 프라이머의 PCR 산물은 크기가 다른 4개의 DNA로, 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 특이적으로 검정할 수 있는 방법을 제공하게 된다(도2).

여기서, 효율적인 검정방법은 본 발명의 JHH SSR 184 F(서열번호 5)와 JHH SSR 184 R(서열번호 6) 프라이머를 PCR을 이용하여 증폭하여 약 168bp, 195bp, 393bp, 411bpb의 DNA 단편의 양상을 확인하는 것으로, PCR에 의한 증폭반응이 가장 바람직하다.

이때, PCR에 의한 증폭반응을 수행하기 위한 반응용액은 본 발명의 JHH SSR 184 F(서열번호 5)와 JHH SSR 184 R(서열번호 6) 프라이머, 내열성 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충용액 등을 포함할 수 있다

그리고, 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호을 확인하기 위한 PCR에서 가장 중요한 것은 특정 부분을 증폭할 수 있는 프라이머이며, 본 발명에 있어 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 검정용 프라이머는 상기 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에 특이적인 4개의 약 168bp, 195bp, 393bp, 411bp DNA 단편에 포함된 일련의 염기서열을 포함하는 특이 단편 또는 4개의 특이 단편을 증폭할 수 있도록 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 검정용 프라이머는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기서열을 이용하여 제조할 수 있으며, PCR의 결과를 충실하게 얻기 위해서는 일반적인 최적 프라이머의 제조방법을 근간으로 제조하는 것이 좋다.

이때, 최적의 방법으로 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 검정용 프라이머는 19-20 mer를 포함하고, 프라이머내에 GC %가 45 내지 65 %인 것이 바람직한데, GC %가 45 미만인 경우 프라이머와 DNA간의 결합이 약한 문제가 있고, GC %가 65를 초과할 경우 프라이머와 DNA 간의 접촉이 어려운 문제점이 있다.

특히, 상기 프라이머는 서열번호 5의 JHH SSR 184 F와 서열번호 6의 JHH SSR 184 R 프라이머 한 쌍을 사용할 수 있다.

본 발명의 PCR을 이용한 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 검정방법은 상기 프라이머를 이용하여 이루어지며, PCR의 조건은 통상의 방법이 바람직하고, 프라이머의 특성에 따라 적절히 조절하여 실시가능하다.

여기서, PCR에 사용되는 시료는 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 균사체 혹은 자실체가 적당하고, 상기 균사체나 자실체 게놈 DNA를 분리하여 PCR하는 것이다.

본 발명의 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 특이 DNA 단편은 4개의 서로 다른 크기로 나타나고 품종에 따라 다른 패턴을 보임으로써, 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 검정할 수 있는 마커로 이용할 수 있고, 또한 본 발명의 PCR 검정법으로 상기 느타리버섯 품종 특이 DNA 단편을 신속하고도 정확하게 증폭시켜 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호을 쉽게 판별할 수 있도록 구성하게 된다. 또한 수한1호 화성2호, 김제9호외에 추가적으로 곤지7호, 흑타리, 춘추2호, 원형1호, 구슬, 한라2호도 명확하게 구분할 수 있다.

이하에서는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시하되, 하기의 실시예가 본 발명을 한정되는 것은 아니다.

(1) 느타리버섯 KNR2197의 단핵균사 유전체 서열 분석

품종에 특이한 밴드를 탐색하기 위하여 단순반복염기서열(SSR, simple sequence repeat)을 찾기 위해서 느타리버섯 KNR2197의 단핵균사의 유전체를 분석 하였다. 느타리버섯의 염색체는 반복서열(repeatitive sequence) 비중이 높아 분석을 용이성을 위하여 핵이 하나 있는 단핵균사를 분석하였다. KNR2197의 단핵포자(post-meiotic offspring)를 살균증류수에 희석한 후 버섯완전배지(MCM)배지에 도말한 후 25℃에서 10~15일 배양한 후 독립된(single colony) 균사를 채취하여 현미경(×400)으로 단핵균사인지 확인하여 사용하였다.

여기서, DNA를 분리하기 위하여 상기 단핵균사를 버섯완전배지 위에 살균된 셀로판지를 깔고 그 위에 균주를 접종하여 약 5일간 배양한 후, 균사체를 회수하여 동결건조 후, 또는 생체를 액체질소를 사용하여 분말로 만든 후, 100 ㎍를 1.5 ml의 시험관에 옮기고, DNA 추출 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0; 200 mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5 % SDS) 400 ㎕와 프로테아제 K (20mg/ml)를 첨가한 다음, vortex를 사용하여 균사체가루가 완충액과 완전히 혼합되도록 하고, 37 ℃ 항온기에서 1시간 반응시켜 균사체가루와 완충액을 혼합시킨 혼합액을 만들게 된다.

이때, 상기 혼합액에 2 × CTAB(sigma) 완충액을 동량 첨가하여 65℃에서 15분간 방치한 다음, 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 넣고 vortex를 2분정도 사용하여 완전히 혼합되도록 한다.

혼성화된 액을 12,000 rpm에서 원심분리하여 분리되는 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 원액의 × 0.7 부피배의 이소프로판올을 첨가하여 실온에서 10분간 두어 DNA를 침전시킨 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한다.

그리고, 침전된 DNA에 70%의 에탄올을 넣어 3-4번 상하로 조심스레 흔들어 세척하고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 에탄올을 조심스레 기울여 버리고 건조한 다음, TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) 100 ㎕에 용해한다.

여기서, 상기 DNA 용액을 RNase(10 mg/ml) 2㎕를 넣어 37 ℃에서 30분 처리하여 RNA를 분해제거하고, 농도를 Nano DROP(Nano DROP Technologies)로 측정하였다. 게노믹 DNA 8.2ug을 얻어서 PacBio RSII platform(Pacific biosciences)으로 서열 분석하고 assembly 하여 총 40.4Mb의 유전체서열을 얻었다.

(2) 단순반복서열 분리(SSR; Simple Sequence Repeats) 및 프라이머 디자인

상기의 유전체 서열을 대상으로 반복되는 형태에 따라서 992개의 SSR을 찾아내어 이 중 유전체상의 위치를 고려하여 282개를 선발하였고, 각 SSR서열을 PCR로 증폭할 수 있도록 상기의 프라이머 GC % 합성기준에 맞추어 서열을 디자인하고 합성하였다.

(1) 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 특이 DNA 단편 검출

느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 실시예 1과 같이 버섯완전배지에 배양시켜 균사체를 발생시켜서 무균적으로 균사를 수확하고 살균증류수로 세척하여 실험재료로 사용하였다. 자실체의 경우는 동결건조후 분쇄 혹은 액체질소로 마쇄하여 사용한다.

실시예 1에서 확보한 SSR 프라이머를 이용하여 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호의 균사체에서 유래한 게노믹 DNA를 사용하여 PCR 반응하여 품종별로 특이한 DNA산물이 만들어 지는 것을 탐색하였다.

각 버섯시료의 DNA를 분리하기 위한 방법은 상기의 실시예 1과 동일하다. PCR 반응 총량은 20㎕으로 하고, 각 균주의 균사체로부터 분리한 게놈 DNA 20 ng과 4종류의 dNTP(각 2.0 mM), 내열성 DNA 중합효소(e-taq polymerase, Solgent, Korea) 1.0 unit, 10 pmol 프라이머, 20 ng 버섯 게노믹 DNA 및 완충용액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01 % 젤라틴)을 완전히 섞는다.

PCR반응은 Dyad(Bio-rad)를 사용하여 실시하였고, 반응조건은 95 ℃에서 3분간 유지하여 DNA를 변성시키고, 연쇄반응 35회(95 ℃, 30초(변성) → 58℃, 40초(재결합) → 72 ℃, 1분(DNA 중합) → 94 ℃, 1분(변성))와 72 ℃ 5분의 마지막 합성을 실시하였다.

PCR의 증폭산물을 1.2%의 아가로스 젤에서 전기영동하고, Safeview(iNtRON Biotechnology, Korea)로 염색하여 DNA 다형성 밴드를 UV로 조사하여 검출하였으며, Gel-Doc system(Bio-rad)으로 저장하고 인쇄하여 도1의 왼쪽에 나타내었다. 참고로, 수한1호, 화성2호, 김제9호외에 곤지7호, 흑타리, 춘추2호, 원형1호, 구슬, 한라2호도 같은 방법으로 PCR 반응 후 DNA 다형성 밴드를 도1의 오른쪽에 나타내었다.

도1의 M은 DNA 크기측정 마커(100bp plus DNA ladder, Bioneer)이고, 나머지 밴드는 느타리버섯 품종에 따른 다형화 DNA 밴드이다.

도1에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 사용한 모든 느타리버섯 품종에서 PCR로 증폭된 다양한 크기의 DNA가 확인되어 사용한 느타리버섯 품종의 유전적 배경이 다르다는 것을 확인하였다. 그 중 200bp 부근과 400bp 부근의 약 168bp, 195bp, 393bp, 411bp 크기의 DNA단편이 품종별로 다른 패턴으로 확인되었다(도1). 그렇지만, 다른 DNA의 수가 많고 일부는 강도가 약하여 좀 더 선명하고 신뢰성 있는 밴드를 나타내기 위하여 그 상기의 특이 DNA단편 각각을 서열분석 하였다.

(2) 염기서열분석 및 특이프라이머 제작

상기의 품종 특이밴드를 서열분석하였다.

상기 실시예 2에서 품종판별력이 확인된 특이한 약 168bp, 195bp, 393bp, 411bp 크기의 DNA 단편을 Gel elution kit(GeneALL, Korea)로 아가로스로부터 분리 정제하여 pGEM-T Easy에 클로닝하고 벡터의 일반적인 서열분석용 프라이머 M13을 사용하여 양방향에서 염기서열을 분석하였으며, 이때 분석에 사용한 시약은 PRISM Ready Reaction Dye Terminator/primer cylcle sequencing kit(Perkin-Elmer, USA)이다.

총 10㎕ 반응액을 제품회사가 제공한 방법으로 thermal cycler로 반응시킨 다음, 반응산물을 4 %의 아크릴아마이드 젤에 전기영동 하여 ABI PRISMTM 377 DNA 서열분석기(Perkin Elmer, USA)으로 염기서열을 결정하였다.

양방향으로 서열분석한 후, 가운데 겹치는 부분은 서열을 합쳐서 각 DNA 단편의 온전한 서열을 완성시켰다.

실시예 2에서 제작한 프라이머 서열번호 5인 JHH SSR 184 F와 서열번호 6인 JHH SSR 184 R이 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 판별하는지 확인하였다.

상기의 균주들을 실시예 2의 방법으로 DNA를 분리한 다음 30ng의 게놈 DNA에 대하여 thermal cycling(PCR)을 실시하였다.

PCR의 반응시 총 반응액은 20 ㎕이고, 2.0 mM dNTP(Fermentas, USA), 1.0 unit의 내열성 DNA 중합효소(e-taq polymerase, Solgent), 20 pmol JHH SSR 184 F, 20 pmol JHH SSR 184 R 프라이머, 20 ng 버섯 게노믹 DNA 및 완충액(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01 % 젤라틴)이 조성액이다.

PCR반응은 실시예 2번과 동일한 방법으로 실시하였다.

상기 방법으로 증폭된 증폭산물을 실시예 2와 같은 방법으로 전기영동 후, Gel-Doc system으로 저장하여 도 2에 나타내었다.

이때, M은 DNA 크기 표준 마커(100bp plus, Bioneer, Korea)이고, 나머지는 느타리버섯 품종명이다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 실시예 2의 본 발명의 JHH SSR 184 F와 JHH SSR 184 R 프라이머는 느타리버섯 품종 수한1호에서 약 168bp, 195bp, 411bp 크기의 DNA 단편을, 화성2호에서 약 168bp 크기의 DNA 단편을, 김제9호에서 약 168bp, 195bp, 393bp 크기의 DNA 단편을 증폭시켰음을 알 수 있다.

따라서, JHH SSR 184 F와 JHH SSR 184 R 프라이머는 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에서 특이패턴으로 DNA단편이 증폭·검출되어 신속, 정확한 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 판별 프라이머로 활용가능하다.

상기의 결과로써 본 발명의 방법으로 느타리버섯의 균사체에서 직접 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호 품종을 판별할 수 있게 되어, 경제적이고 빠른 확인이 가능하게 되었다.

실시예 2에서 제작한 프라이머 서열번호 5인 JHH SSR 184 F와 서열번호 6인 JHH SSR 184 R이 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호외에 추가로 느타리버섯 품종 곤지7호, 흑타리, 춘추2호, 원형1호, 구슬, 한라2호를 판별하는지 확인하였다.

PCR반응과 증폭산물의 전기영동과 그림의 저장은 실시예 2번과 동일한 방법으로 실시하였고 그 결과는 도3에 나타내었다.

이때, M은 DNA 크기 표준 마커(100bp plus, Bioneer, Korea)이고, 나머지는 느타리버섯 품종명이다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 실시예 2의 본 발명의 JHH SSR 184 F와 JHH SSR 184 R 프라이머는 느타리버섯 품종 곤지7호에서 약 195bp크기의 DNA 단편을, 흑타리에서 연한 약 168bp, 진한 약 195bp 크기의 DNA 단편을, 춘추2호에서 약 250bp, 270bp 크기의 DNA 단편을, 원형1호에서 약 210bp 크기의 DNA 단편을, 구슬에서는 약 195bp, 260bp, 393bp 크기의 DNA 단편을, 한라2호에서 약 180bp, 250bp크기의 DNA 단편을 증폭시켰음을 알 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관해 설명하였으나, 이는 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다.

그러므로, 본 발명의 실질적인 범위는 상술된 실시예에 의해 한정되어져서는 안되며, 후술하는 청구범위 뿐만 아니라 청구범위와 균등한 구성에 의해 정해져야 함은 당연하다.

서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4는 실시예 2에서 분리한 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에 특이적인 약 168bp, 195bp, 393bp, 411bp 크기의 DNA 단편 각각의 염기서열이고, 상기 서열번호의 염기서열을 근간으로 안정된 밴드가 합성되도록 20mer의 정방향 프라이머(서열번호 5)와 19mer의 역방향 프라이머(서열번호 6)를 작성하였다.
서열번호 5는 JHH SSR 184 F 프라이머이고, 서열번호 6는 JHH SSR 184 R 프라이머 서열이다.

<110> Gyeongsangnam-do <120> PCR PRIMERS FOR DETERMINATION OF CULTIVARS OF PLEUROTUS OSTREATUS, SUHAN-1HO, WHASUNG-2HO, GIMJE-9HO <130> PO_CSM <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 168 <212> DNA <213> Pleurotus ostreatus <400> 1 taccctaata tcttgctagg gtccatggga tcccgtttgc cgccaccacc atgttggcgg 60 gaagtcgggg tttcatcgtc tgcttcggag gcttcgtcga ctgcttcggg ggtatctgca 120 ccgggagttg gtgctacgtc ctcgtcctcg tatatgtcgt cctcgtct 168 <210> 2 <211> 195 <212> DNA <213> Pleurotus ostreatus <400> 2 taccctaata tcttgctagg gtccatggga tcccgtttgc cgccaccacc atgttggcgg 60 gaagtcgggg tttcatcgtc tgcttcggag gcttcgtcga ctgcttcggg ggtatctgca 120 ccgggagttg gtgctacatc ctcgtcgacc tcgtcgacct cgtcgacctc gtcctcgtat 180 atgtcgtcct cgtct 195 <210> 3 <211> 393 <212> DNA <213> Pleurotus ostreatus <400> 3 taccctaata tcttgctagg gtccatggga tcccgtttgc cgccaccacc atgttggcgg 60 gaagtcgggg tttcatcgtc tgcttcggag gcttcgtcga ctgcttcggg ggtatctgca 120 ccgggagttg gtgctacgtc ctcgtcgacc tcgtcgtcct cgtcgacctc gtcgtcctcg 180 tcgacctcgt cgtcctcgtc gacctcgtcg tcctcgtcga cctcgtcgtc ctcgtcgacc 240 tcgtcgtcct cgtcgacctc gtcgtcctcg tcgacctcgt cgtcctcgtc gacctcgtcg 300 tcctcgtcgt cctcgtcgtc ctcgtcgacc tcgtcgtcct cgtcgacctc gtcgtcctcg 360 tcgtcctcgt cctcgtatat gtcgtcctcg tct 393 <210> 4 <211> 411 <212> DNA <213> Pleurotus ostreatus <400> 4 taccctaata tcttgctagg gtccatggga tcccgtttgc cgccaccacc atgttggcgg 60 gaagtcgggg tttcatcgtc tgcttcggag gcttcgtcga ctgcttcggg ggtatctgca 120 ccgggagttg gtgctacgtc ctcgtcgacc tcgtcgtcct cgtcgacctc gtcgtcctcg 180 tcgacctcgt cgtcctcgtc gacctcgtcg tcctcgtcga cctcgtcgtc ctcgtcgacc 240 tcgtcgtcct cgtcgacctc gtcgtcctcg tcgacctcgt cgtcctcgtc gacctcgtcg 300 tcctcgtcgt cctcgtcgtc ctcgtcgacc tcgtcgtcct cgtcgacctc gtcgtcctcg 360 tcgacctcgt cgtcctcgtc gtcctcgtcc tcgtatatgt cgtcctcgtc t 411 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Pleurotus ostreatus <400> 5 taccctaata tcttgctagg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Pleurotus ostreatus <400> 6 agacgaggac gacatatac 19

Claims

느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호에 특이성을 가지는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4의 DNA 단편.
서열번호 5 및 서열번호 6의 한 쌍의 프라이머 세트.
청구항 1의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4번의 DNA 단편의 존재유무를 느타리버섯 균사체나 자실체에서 확인함으로써 느타리버섯 품종 수한1호, 화성2호, 김제9호를 판별하는 검정방법.
청구항 3에 있어서,
상기 검정방법은 제2항에 따른 서열번호 5와 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하고, 상기 프라이머와 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 이용하여 PCR 하는 것인 느타리버섯 수한1호, 화성2호, 김제9호 품종 검정방법.
청구항 4에 있어서,
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것인 조성물.