KR20190070641A - 만가닥 버섯 품종 구별용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만가닥 버섯 품종을 구별하기 위한 분자 마커 및 이를 식별하기 위한 프라이머 쌍에 관한 것이므로, 본 발명에 따른 만가닥 버섯 구별용 프라이머 쌍을 이용함으로써 용이하게 만가닥 버섯 품종을 판별하여 시간과 비용을 절감할 수 있다.

Description

만가닥 버섯 품종 구별용 조성물{A composition for discrimination of beech mushroom varieties}

본 발명은 다형성 마커를 이용한 만가닥 버섯 품종 식별용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 만가닥 버섯 품종을 구별하기 위한 SNP 마커 및 이를 식별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용한 품종의 식별 방법에 관한 것이다.

DNA 마커는 게놈상에서 다형성 여부를 판단할 수 있는 특정 염기서열 단편을 의미한다. DNA 마커는 작물 육종분 야에서 형질과 연관된 마커의 개발과 이를 이용한 marker assisted selection (MAS), 유전자 지도 작성, 양적 형질 유전자좌 분석, 순도 검정, 유전적 다양성 분석 및 품종식별 등의 분야에 활용되고 있다.

일반적으로 식물 품종을 식별하는 방법은 크게 재배시험을 통한 형태적 특성 검정과 품종간 동위효소의 차이를 통한 검정, DNA 분석 방법으로 나뉜다. 이 중 DNA 분석 방법은 표현형에 근거한 식별방법에 비해 재배환경 및 작물의 생장단계에 영향을 받지 않아 객관적이며 재현성 또한 높다는 장점이 있다. 국제 신품종 보호 연맹 (UPOV)은 DNA 마커를 신품종의 특성 조사와 식물 품종 보호권 부여에 활용하기 위한 논의를 진행 중이다. 다양한 연구에서 유전자 수준에서의 염기서열 차이를 이용하여 품종식별을 위한 분자마커로 활용할 수 있는 가능성 을 제안하고 있다. 구체적으로 분자마커 종류 중 품종간 다형성 정도, 분석의 재현성, 염색체 상의 분포 정도를 고려할 때 SSR(Simple Sequence Repeat), SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 방법을 활용하는 것을 제안하고 있다.

국내에서 품종식별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황을 살펴보면, 농촌진흥청에서 벼, 콩 등에 대한 SSR 분자 마커 및 참깨에 대한 CAPS 분자마커를 이용한 품종식별 기술을 보고한 바 있다. 국립 종자원은 SSR 분자마커를 이용하여 고추, 배추, 수박 등에 대한 작물의 DNA 프로파일 및 SNP 분자마커를 이용하여 구기자 등에 대한 작물의 DNA 프로파일을 데이터베이스화하였으며, 종자 분쟁 발생시 이를 중재하기 위한 수단으로서 분자마커를 활용 하여 품종보호 출원품종에 대한 대조품종 선정에 유전자 분석 결과를 활용하고 있는 추세이다.

국내에서 품종식별에 대한 DNA 분석 개발 및 활용 현황의 다른 예를 살펴보면, 시판 고추 F1 품종식별을 위한 SNP 마커(등록특허 10-0974821), 국내외산 벼 품종식별 SNP 마커(등록특허 10-0713669) 등 유전자 마커를 이용한 다양한 분석법이 농업적으로 활용되고 있다.

이처럼 유전물질 (DNA)를 이용한 개체간의 차이에 대한 연구가 꾸준히 진행되어 왔고, 최근 분자유전학 및 DNA 분석기술의 발달로 분자생물학적 수준에서 경제형질 관련 유전자 탐색 및 질병관련 유전자 발굴 등 SNP를 포함한 유전자마커(genetic marker) 개발이 활발히 진행되고 있다.

핵산을 이용한 유전자 증폭 기술 (PCR, Polymorase chain reaction)등 다양한 DNA 분석 기법이 발전함에 따라 종판별 및 개체식별 등 다양한 산업 전반에 걸쳐 활용되고 있다. 특히, 대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응 (Allele-specific PCR : AS-PCR)은 유전자 증폭을 위하여 사용되는 프라이머 말단에 SNP가 위치하며, 프라이머 말단에 인위적인 돌연변이를 디자인하여 프라이머 끝(3` end)부분의 단일 염기가 결합되거나 결합되지 못하는 특징을 이용함으로써 유전자 증폭 산물의 형성 유무를 통해 개체별 SNP형을 확인하는 방법이다.

이에 본 발명자들은 본 발명에서는 단일염기다형성(SNP) 등의 변이를 이용하여 최근 느타리 버섯과 함께 식용 버섯으로 많이 소비되고 있는 만가닥 버섯 품종 육종에 이용하기 위한 품종 구별함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 10-0713669

본 발명의 목적은 만가닥 버섯 품종 구별용 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 만가닥 버섯 품종 구별용 SNP 마커를 식별하는 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 만가닥 버섯 품종을 구별하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 만가닥 버섯 품종을 구별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 만가닥 버섯 품종 구별용 분자 마커를 제공한다:

서열번호 1로 표시되는 염기서열의 384번 위치, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 2100번 위치, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1574번 위치, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 1815번 위치, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 215번 위치, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 2040번 위치 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 2348번 위치의 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP 마커;

서열번호 8로 표시되는 염기서열의 1913번 위치, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 3483번 위치, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 701번 위치 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 2350번 위치의 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 마커; 및

서열번호 12로 표시되는 염기서열의 1379번 위치의 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 마커.

상기 만가닥 버섯 품종은 하기 표 1로 표시되는 품종 자원일 수 있다:

균주번호	속명	종명	갓색	한국명	품종명	년도	수집국	수집지역
ASI8069	Hypsizigus	marmoreus	회갈색	만가닥버섯	해미	2009	한국	원예원
ASI8088	Hypsizigus	marmoreus	백색	만가닥버섯		2007	일본	후쿠시마
ASI8090	Hypsizigus	marmoreus	백색	만가닥버섯		2012	베트남	베트남달랏마트-강현민, 김민구
ASI8091	Hypsizigus	marmoreus	진한 갈색	만가닥버섯	HM3-10	2015	한국	덕유산*

일 실시예에서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 384번 위치, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 2100번 위치, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1574번 위치, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 1815번 위치, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 215번 위치, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 2040번 위치 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 2348번 위치의 뉴클레오티드가 C; 서열번호 8로 표시되는 염기서열의 1913번 위치, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 3483번 위치, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 701번 위치 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 2350번 위치의 뉴클레오티드가 G; 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열의 1379번 위치의 뉴클레오티드가 G 인 품종은 ASI8069 품종일 수 있다.

다른 일 실시예에서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 384번 위치, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 2100번 위치, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1574번 위치, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 1815번 위치, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 215번 위치, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 2040번 위치 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 2348번 위치의 뉴클레오티드가 T; 서열번호 8로 표시되는 염기서열의 1913번 위치, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 3483번 위치, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 701번 위치 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 2350번 위치의 뉴클레오티드가 G; 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열의 1379번 위치의 뉴클레오티드가 G 인 품종은 ASI8088 품종일 수 있다.

또 다른 일실시예에서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 384번 위치, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 2100번 위치, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1574번 위치, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 1815번 위치, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 215번 위치, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 2040번 위치 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 2348번 위치의 뉴클레오티드가 T; 서열번호 8로 표시되는 염기서열의 1913번 위치, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 3483번 위치, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 701번 위치 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 2350번 위치의 뉴클레오티드가 G; 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열의 1379번 위치의 뉴클레오티드가 A인 품종은 ASI8091 품종일 수 있다.

또 다른 일실시예에서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 384번 위치, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 2100번 위치, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1574번 위치, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 1815번 위치, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 215번 위치, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 2040번 위치 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 2348번 위치의 뉴클레오티드가 C; 서열번호 8로 표시되는 염기서열의 1913번 위치, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 3483번 위치, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 701번 위치 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 2350번 위치의 뉴클레오티드가 A; 및 서열번호 12로 표시되는 염기서열의 1379번 위치의 뉴클레오티드가 G 인 품종은 ASI8090 품종일 수 있다.

또한, 본 발명은,

서열번호 1의 384번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 13 및 14의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 2의 2100번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 15 및 16의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 3의 1574번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 4의 1815번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 19 및 20의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 5의 215번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 21 및 22의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 6의 2040번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 23 및 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 7의 2348번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 8의 1913번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 9의 3483번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 29 및 30의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 10의 701번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 31 및 32의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 11의 2350번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 및

서열번호 12의 1379번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 35 및 36의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 만가닥 버섯 품종 구별용 프라이머 쌍을 제공한다.

상기 프라이머 쌍을 구성하는 염기서열 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티 오에이트와 같은 뉴클레오티드 유사체(analogue), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid) 또는 삽입 물질 (intercalating agent)을 포함할 수 있다. 상기 염기서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 표지 물질을 더 포함할 수 있다. 상기 형광 표지 물질은 VIC, NED, FAM, PET, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 염기서열의 5' 말단에 표지될 수 있다.

또한, 방사성 표지 물질은, ³²P 또는 S 와같은 방사성 동위원소가 첨가된 PCR 반응액을 이용한 PCR 반응을 통해 증폭 산물에 혼입될 수 있다.

본 발명의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 또는 AS-PCR에 의해 생성되는 증폭 산물의 유무 및 크기 따라 단일염기다형성 유전자형을 구별하거나 또는 삽입-결실(indel)을 식별할 수 있다.

구별하고자 하는 만가닥 버섯 품종에 관한 내용은 상술한 바와 같으므로 생략한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1의 384번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 13 및 14의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 2의 2100번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 15 및 16의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 3의 1574번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 4의 1815번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 19 및 20의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 5의 215번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 21 및 22의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 6의 2040번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 23 및 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 7의 2348번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 8의 1913번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 9의 3483번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 29 및 30의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 10의 701번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 31 및 32의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;

서열번호 11의 2350번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 만가닥 버섯 품종 구별용 키트를 제공한다.

상기 키트는 DNA 중합 효소, dNTP 및 PCR 완충용액을 더 포함할 수 있다. 또한, PCR, 구체적으로 AS-PCR 또는 증폭 산물의 확인에 필요한 구성 성분이 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다. 상기 PCR 완충용 액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl 2 를 함유할 수 있다. 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은,

만가닥 버섯으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 쌍을 사용하여 증폭하는 단계; 및

얻어진 증폭 산물로부터 상기 만가닥 버섯의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 만가닥 버섯 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

상기 게놈 DNA는 식물체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 상기 게놈 DNA는 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용하여 수득될 수 있다.

상기 방법에서, 핵산의 증폭은 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 핵산의 증폭은 AS-PCR을 이용하여 수행될 수 있다.

PCR 또는 AS-PCR 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수 있다.

PCR 또는 AS-PCR 반응은 당업계에 PCR 또는 AS-PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 반응액을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 반응액은 예를 들면, 분석하고자 하는 만가닥 버섯으로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 프라이머 세트, DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법은, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다.

형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광 물질로 표지된 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 방사성 측정을 통해 검출할 경우, 방사성 물질을 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)와 같은 방사성 측정기를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

상기 방법에서, 얻어진 증폭 산물로부터 상기 만가닥 버섯의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, 상기 프라이머 쌍에 의해 상기 표 1에 표시된 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것일 수 있다.

본 발명은 국내 및 외국에서 수집된 만가닥 버섯 품종을 대상으로 분자마커를 이용한 만가닥 버섯 품종 구별 방법 및 체계를 확립하였다. 육종의 각 단계에서의 판별, 새로운 수집종이 기본 균주 중 어느 것과 가까운지의 판별에 이용할 수 있다. 아울러 농산물 원산지표시제에도 활용할 수 있다. 나아가, 만가닥 버섯 품종의 진위성 규명, 종자분쟁의 중재 및 품종보호 출원품종의 대조품종 선정 등과 같은 분야에 기여할 수 있다.

도 1은 만가닥 버섯 품종 구별용 SNP 마커 및 이를 식별하기 위한 프라이머 세트를 선별하는 과정을 나타낸 모식도이다.

이하 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 분석방법

<1-1> Sequence pre-processing

Short reads의 전처리 과정을 위하여 SolexaQA (v.1.13) package의 DynamicTrim 및 LengthSort 프로그램을 사용하였다. DynamicTrim은 phred score에 따라 short read의 양쪽 끝의 bad quality base를 잘라내고 양질의 cleaned read로 정제하는 과정을 수행하며, LengthSort는 DynamicTrim에서 너무 많은 base가 잘린 read를 제거하는 과정을 수행하였다. DynamicTrim의 phred score ≥20을, Length Sort 과정은 short read length ≥25bp 사용하였다.

<1-2> Alignment to reference genome

전처리 과정을 통과한 cleaned reads를 BWA (0.6.1-r104) 프로그램을 사용하여 표준유전체에 mapping을 수행하였다. mapping은 표준유전체와 시퀀싱한 샘플간의 raw SNP (In/Del)을 detection하기 위한 선행과정으로서 BAM format의 파일을 생성하며, 다음의 옵션 이외에는 기본값을 사용하였다.

- maximum number of gap extensions(-e) = 50

- seed length(-l) = 30

- maximum differences in the seed(-k) = 1

- number of threads (-t) = 32

- mismatch penalty(-M) = 6

- gap open penalty(-O) = 15

- gap extension penalty(-E) = 8

<1-3> Raw SNP detection 및 consensus sequence 추출

Clean reads를 표준유전체에 mapping하여 생성된 SAM format의 파일을 SAMtools(0.1.16) 프로그램을 사용하여 raw SNP을 detection하고, consensus sequence를 추출하였다. 이때, SNP detection하는 과정 전에 기존의 script를 사용하여 SNP validation을 거친 후에, raw detection을 수행하였다. 다음의 옵션 이외에는 기본값을 사용하였다.

- minimummapping quality for SNPs (-Q) =30

- minimummapping quality for gaps (-q) =15

- minimumread depth (-d) = 3

- maximum read depth(-D) = 500

- min indel score for nearby SNP filtering(-G) = 30

- SNP within INT bp around a gap to be filtered(-w) = 15

- window size for filtering dense SNPs(-W) = 15

<1-4> Generate SNP matrix

분석대상간의 SNP 비교분석을 수행하기 위해 샘플간 통합 SNP matrix를 작성하였다. 각 샘플을 표준유전체와 비교하여 얻은 raw SNP position을 후보로 하여 합집합의 리스트를 구축하고, 이때, 빈영역(non-SNP loci)은 샘플의 consensus sequence로부터 채워 넣는 filling 과정을 거쳐 raw matrix를 작성하였다. 이후 샘플간의 SNP 비교를 통해 mis-calling된 SNP좌를 필터하여 final SNP matrix를 작성하였다. 해당 좌를 기반으로 SNP을 유형구분 기준에 따라 분류하였다.

*** SNP 유형구분기준***

Homozygous: SNP read depth ≥90%

Heterozygous: 40% ≤SNP read depth ≤60%

Etc.: Homozygous/Heterozygous 유형으로 구분할 수 없는 경우

*** Nucleotide N, n 의차이***

소문자‘n’은 해당 SNP 좌에 read mapping이 안되어 missing을 의미하며,

대문자‘N’은 read mapping은 되었지만 mapped read가 여러 염기서열로 혼재하게 mapping되어 해당좌의 염기서열을 구분지을 수 없는 경우를 의미함.

<1-5> 품종간 SNP 변이탐색

샘플간 통합 SNP matrix를 대상으로, 같은 strain 샘플끼리 동일한 SNP를 선발한 후에 비교품종간의 동일한 SNP좌의 염기서열을 비교하여 서로 SNP인 경우(polymorphic SNP)를 선발하였다.

<1-6> SNP 마커개발

비교 품종간의 polymorphic SNP 좌를 target으로 하여 HRM (High Resolution Melting)용 SNP 마커를 개발하였다. 그러나 primer 디자인 시에, target loci에 인접한 다양한 변이 SNP로 인해 primer를 디자인하는데 어려움이 있는 SNP좌는 마커 후보 대상에서 제외하였다. primer는 Primer3(v2.3.5) 프로그램을 사용하여 다음의 조건 이외에는 기본값을 만족하는 primer를 디자인하였다. 이후 in silico PCR을 수행하여 게놈상에 한 번 관찰되는 primer를 선발하였다. 이를 primer set 후보로 분류하였다.

변이

Product size 80~150 bp

Primer size 20~24 bp (optimum 20 bp)

Melting temp. 55~65℃(optimum 60℃)

SNP

[주] 단, primer 디자인 조건을 만족하여 얻은 primer-set 중에서 amplified sequence 상에 염기서열결실(unmapping region)이 존재하는 primer의 경우는 결실 염기서열로 인해 HRM용 primer에서 실험결과가 예상과 다를 가능성이 있다.

<실시예 2> 연구 결과

<2- 1> Sequencing raw data

하기 표 2 내지 6과 같이 4개의 균주에 대하여 서열 분석한 결과 및 SNP 정보를 얻었다.

*Mapped region : Assembled transcript 대비, read mapping되어 cover하는 영역. Mapping region에서 percentage는 Assembled transcript의 총길이 (=19,585,723 bp)를 기준으로 read mapping이 되어 cover하는 영역의 총길이를 percentage로 계산함.

<2-2> strain간의 polymorphic SNP detection

만가닥 버섯 4개 strain(24개샘플) 통합 SNP matrix에서 같은 strain간에 동일한 homo 타입의 공통 SNP 좌를 선발하고, 4개 strain 간의 합집합 SNP 좌를 다음 표 7과 같이 선발하였다.

<2-3> 품종구분용 마커세트 primer design

Strain 간의 polymorphic SNP를 target으로 하여 HRM(High Resolution Melting) primer을 디자인하되, 결과의 정확성을 높이기 위해 엄격한 기준의 필터 과정을 거쳤다. primer 디자인은 reference genome 서열을 사용하였다.

* Polymorphic SNP: 비교 strain간에 동일 SNP 좌에서 서로polymorphism을 보이는 경우.

* Recommend: 디자인된 primer-set 중에서 product sequence의 염기서열이 모두 read mapping되어 base의 비교과정을 통과한primer로서추천하는 primer-set의 개수를 의미함.

Recommend primer 좌 13,621 좌를 대상으로 4개 Strain 간의 품종구분용 마커 세트 3개를 선발하였다. 3개타입“CTTC”후보좌 7개, “GGAG” 후보좌 1개,“GGGA” 후보좌 4개 총12개 후보좌 및 상기 후보좌의 SNP를 식별가능한 프라이머 쌍을 하기 표 10과 같이 결정하였다.

Id	pos	SNP_marker _set	5'_primer_seq	3'_primer_seq
Htessellatus1SL002874t0001 (서열번호 8)	1913	GGGA	TCTTGACAAGCAGAGCCAGG (서열번호 27)	GATGCCGTTTCCCAAGCATG (서열번호 28)
Htessellatus1SL004255t0001 (서열번호 1)	384	CTTC	CTTCGTTGAGCTGGCCTACA (서열번호 13)	TGTAAGCAACAAGAAAGCCCG (서열번호 14)
Htessellatus1SL013123t0001 (서열번호 2)	2100	CTTC	TTTGGGTCGGTCATCGTCAG (서열번호 15)	ACGATGAAAGCGACGAAGGT (서열번호 16)
Htessellatus1SL006553t0008 (서열번호 3)	1574	CTTC	CATAACCCGCCGTATCTGCT (서열번호 17)	TTGCCAATTGCCGCCATCAT (서열번호 18)
Htessellatus1SL001255t0001 (서열번호 4)	1815	CTTC	CGTTCGCGTTTCATCGACTG (서열번호 19)	AGGGGCCTTTTGTGTCAACA (서열번호 20)
Htessellatus1SL006607t0002 (서열번호 5)	215	CTTC	ACCGTCCTTTCCGCTTGTTA (서열번호 21)	GCCATTGCCTTTGCCTTCAA (서열번호 22)
Htessellatus1SL004780t0001 (서열번호 6)	2040	CTTC	ACTGCCTGGAATCAGCGAAT (서열번호 23)	GGAGGCTGGAACATTGCTCT (서열번호 24)
Htessellatus1SL006530t0001 (서열번호 9)	3483	GGGA	TGATATCTAGCTCGGGCCGA (서열번호 29)	AGGCCTTGAAAATCGAGCGA (서열번호 30)
Htessellatus1SL012513t0002 (서열번호 10)	701	GGGA	GGCCGTGGTAGGACAATGAA (서열번호 31)	CCACACCTGACCCTGCTTAC (서열번호 32)
Htessellatus1SL014433t0001 (서열번호 11)	2350	GGGA	AAACCTTTCCTCCGAGGCTG (서열번호 33)	TCTCGACCCTTTTCCTGTGC (서열번호 34)
Htessellatus1SL013653t0001 (서열번호 7)	2348	CTTC	CACCTGGACGGTCTCGAAAA (서열번호 25)	GTCAGCTTCGCTTTCGTTGG (서열번호 26)
Htessellatus1SL008494t0004 (서열번호 12)	1379	GGAG	ACCAAGTACCTTGTCACGGC (서열번호 35)	CAACATACTCCGACCCACCC (서열번호 36)

선별된 품종 구분용 마커 세트 3개를 이용하여 만가닥 버섯 4개의 strain을 구분하였다. 예를 들어 마커타입=“CGG”일 경우 strain“8069”으로 구분되고, 마커타입=“TGG”일 경우 strain“8088”으로 구분되며, 마커타입=“TAG”일 경우strain“8090”으로 구분되고, 마커타입=“CGA”일 경우 strain“8091”으로 구분되었다.

<110> Republic of Korea <120> A composition for discrimination of beech mushroom varieties <130> P17R12C1304 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1297 <212> DNA <213> Hypsizygus marmoreus <400> 1 tgatgatccc tggaccattc gtccgacaca gagctgagct ccgtctggtc atctgtgctt 60 cttctgcttc tttgctcgca agtctcccac ctgccgtcga acggttctga cttgtctcaa 120 ggtctatgta catgagcacg gaatgcaaag tatcttgagt gtgctgcgat atgtcgtttt 180 tgggtttttt attatatgca gtgccaccat cgctagtgtc gctgtctgga ataatagtct 240 tgctcagtca gttggttgga atttgcaggt tgacatttat ctcatttttc tgggatgctt 300 tgggctggcc cttatcttcg caataatctt cgttgagctg gcctacaggc atgcctttac 360 tggtcgcgtc tggtttgaat gtgcctgggt cgggctttct tgttgcttac atctggccgg 420 tgctgtcgcc gtaacgtcca tcgtgccgac tcgtatgtgt agcttccagc tccgccgtat 480 cttgagcgat tcatgtatct cgactcatgt cttgatggct ttcacatgga taattaccac 540 catactcttg ttgtattttt tccttctagt caccgcatcc ctagttcacg tcaagcacga 600 ctcgcggata tggcactgct acgttcacaa atttccctgg agcgattgtt cccgtcctct 660 tgctagtacc tcataccttg ctagtacccc atacccaacg tcaccttcgc cgttccccca 720 gtttctaaaa aagatgccat ccatcgtcgc cccgaaaccg cagcgcccag cacctgctac 780 tatctatgca cagcgttccg gacttggctc agaatatgag atcgagtcct tctcgacacc 840 agttcctggt atggatcgac ctgccccaca ctttcctgct atgcctgcag gctttcccat 900 acctcataac actccccaag tcgaaatata tcaaacacct tcgttgtatc ctcagtacat 960 ggagtccgct ttcatatccc agccgctccg tgttcagttg gcccctcagc cacctactca 1020 actattccaa gcgccgacgt cgccttcacc actaggtgat tggccgcgcc cgaacgccgt 1080 catgctgcca ccatcacggg caagacggaa tagaccaatt ccgccagcaa tgggaataga 1140 tcaacttgta gttggaggaa caccgagtag cccgactggc cctcgaccgc gcccttccgg 1200 tccccggcga cggtcagatg gtgaacctcg aagtacccgt acagcgttgg attcttctcg 1260 aacagaacat ggtagatatt gaacggccaa tgtatta 1297 <210> 2 <211> 5209 <212> DNA <213> Hypsizygus marmoreus <400> 2 gctcttcttc gcaggtttcg ccgttacgtg tacaaggtgt acagtccaag tgtgcaatcg 60 ttactgttgt agccgattga aacttgaaag aacggagatg atgtcaagtt tgtatgtcaa 120 tgcttggtcc agaatcgcaa cgcgacactc tagccgtttt cccttttgag cctgagtggc 180 gacatcgact ttttctgtta accaatcatc ctgggacttt cccataatgc gaccttcggt 240 tacccggctg gttcggatta tcccacgcaa aacaatccag ctcgatgaga agaaaattcg 300 tttaccaccc gctccccaaa ctcaggattt gaagaagccc accctcattg aaacgctcat 360 gaaacaccag gccgaagtcg gagacgcctg gccccggaac atcagaatcg aaccagcagt 420 gaagaaggag gcattcaaac atgttcaggc ggacgtgaga gttagattga agaagttgtt 480 gaaggaacgg tagcatgcag tattagacgc tatgactggg tgggttggaa gatggagttc 540 gaggttgaaa gtgggggctt cctagaaatg accagttatg tgccaaggcc acatttttta 600 gatcaagcgc cgagcacaaa caacgttaag gctctctact ttgatgccga aaacgatgca 660 gagggttccg cagtccaatg ttctgtgttc tgtagcccat gtctacctaa ggatgcaagg 720 ttgacgcatt gatgggccac gtctttgatc atcacttgaa ccaccatgag taaagtgctt 780 cgagatgttg tcctgccact cactgtgttc tctgttctta ttgccttcgc atggcgcttc 840 atcttcggac atctgcacga gtctggtctt gacgtagcac ttgccaacgc atgctctccc 900 aaaaatacgt ccggcagatc atatcgcatc ccatacaccg gctttgacaa aatagatggc 960 catgtccttt gcccactcgt cgcttttttc atgaggcaat ggaatcctca gacgcaatta 1020 ccttcctgac atattttgtt ggtattggtg ctcccctgag catcatcccc tctatcgaag 1080 gctggaggca aggccgtcgt ctgttgattg cataccccgt catatttggt ctcctctctc 1140 agactctgac aatcggagtg acgatgccaa tgtattggtt gattttcctc ctgtcgggcg 1200 gggcaaacac aggacgaaat ggcaatcccg gcggcgccaa aataactcag gcccatgctg 1260 aggcaattgt ctttggtatt gtcgtaggag gtgtaatccc atcagtgggc atgctcctgt 1320 tggaagatcc tttggttact gccatctggc agccataccc aatctacatt tccctagctc 1380 agctcgctca cttggcattt cgtcgcgttt caaaacaccc tgattcggga tacagcacta 1440 ttcgtgcact gtacattggc gcgttcatcg ttagttcatc agtacacatt tcgacaatct 1500 ggccgctgct taaagacgtc agcacactac aaaacgtgtt cctcccttcc atcattgtcc 1560 caaacacttc ggcctctctg tcaattcgcg tgttgcattt cctgaaatgg gacttcacgt 1620 tcggatttct ttcaagtatc gttgccacat tgtggtttgc gcgctctatg ggcgagttcc 1680 tcgcccttgt cgcctggagc ataatcgcca ccccagtgtt tggaccaggt gcggccctta 1740 ccggcaccgc tctctggcgg gagtcaacgc tgcaggtcga atcagcacca tccaaggcaa 1800 agcagactta atgaccatgc ctccaatgtg gcaaaacatg gaaagttcta gcgttcatgg 1860 acgacgaaat agtaggaaaa ggtcatattt actataccaa tgtgttggag tttgtcacgg 1920 taatgcgaaa caagatatcc tgcatcatac attcaacgtt tcttgctctt tccgttggcc 1980 ttgccatttg gttttgactt ggactttttg ggtcggtcat cgtcagagtc atccgagtcc 2040 ccgcccttct tacccccctc gactcgtttc atgtcagatt tcgctgcttt cctctccagc 2100 tcatcccaat cttcaccttc gtcgctttca tcgtcaccac cgaaatccga accgctctca 2160 tcactgccag catcagagtc atcatagtca cttgcttcat cactgctctc attttcaacc 2220 aggtcttctt cgtctgcctc gaattcggac tccgagtctg actcgtcaga atgatcgctc 2280 tcagctccac cgccaccaag gaaagtccat ccgccctgcg agaagaattc gtgcggattc 2340 tcgttgatgt gtttcatgat agggccccag ttcaaattga caggaccttc gctcattgga 2400 atatcaacag agtcgagcca gtttttcacg tcatccatct gagaacttgg tatcgaattg 2460 atatggagag gaggtttcgt aaagtctttg aatatgaaca cgagatcgaa ctgtttcaag 2520 ctgtactgga cgcgctccaa agacgcaatt tcaatgtcgg ccaatgttac cacaaggaat 2580 ggtggatccg tgaggtgaac aagacactcc gtagttggtt gaagccgaga actggtccgg 2640 aacggaacac cttcgaaaga tagttctctg aaaggtatgt cgagttcaag agtctcgccg 2700 tttgaggctg atgccgcttc agcaatcttt tcggcgaacg ctttgatctc tttgttgagc 2760 attgcccgcc gcttacgctc ctgttgctcc atctcgattt catcctcatc accgtaacga 2820 tgctttcgtt tgcgattgcc cgtctcgtcg aactggacat cggttgcttc acggaagaat 2880 tggacatcga aagccttttt cttgccgatc ataatgggtg ctttcagatg gagatgaatg 2940 atgacaagga gctcgtgatc gcatggctgg aagaacagat gcttcacatt gctgaagaga 3000 atatcgatct tttgagagcc aagcggtgat tgataccgta gaccattttg gtgaatttca 3060 acctcgcctg gcagtcgctt accgtcaaga gcaggtcgta taaaagcttc agacattttt 3120 gcaggccgtc ggcctttgat ttccacaagg gtcccttgct caatgacgtc agccatctcc 3180 ttcttctgct gctctcgttt gttggcttct ttcttaagat cggtgatctg cttgcagatg 3240 ttatcgaagc gatgaccatc cggcgaccga tatgagactg agcgaatgaa agtggcgtcg 3300 gggtcttcga atggcgtatc ctccttcttc cctgctaatt gaccaggggt ctggaaattg 3360 atccgaagaa tagtgaattc gccctcgtcg ttcttgcttg cgttcttaat ggtattgata 3420 tggaagggga ctgcagatcc gtgcataggt agtatcacag tctgcgcctt gcggtcgacg 3480 aatatgcgga gccgctcgac ctccggaggt aaagctccct cccctttata actttggaac 3540 tttttccatc ctttcccttc cttaccgccg gttcctccac cgtcctccgt gtagcgttgc 3600 attccttctg cttgcagttt atcgtgcaac tctcgttgat gctcagccaa ccgcgctgca 3660 gctgtcatat gtacctcatc ttgaacggct cgtcgtgttt gatttcgcaa aaccttcccg 3720 gcaacagtct tcttttgagg agatccattg gaacgaggaa tcaccggagg atgtctttca 3780 ctttttgggg gtttctcttc ttcactgtcg ggagtcaaga aaaataaggt gtcttttgcc 3840 gatcttgttc cttcagtgag gaggatggac ttgtttgatt cgaccctaat ggtatccgca 3900 agatgaagag agtacttttt accactgcca tccaccaaat ccacgagtcc cagagcaaga 3960 ttgataatca tgtcggcctt gagagttcgt ccatttttag cagagagaac gtaggaagag 4020 tcgcgaaatt ctatccccat cccaaaacca acattcttca cgaagtgctt ctccagctct 4080 ggaatctttc ctttcacgta agagatagca tgttggtaca cctcgcgagc agagacccca 4140 tccttgatcg tcgacagcat ttctgactgt agagaaagca atagattgta ttgtgcttct 4200 tgatctgtgt tcggatccac gatgaatgtc cttccaacat ttgcgcagta cgatttgtat 4260 cgcaacccaa atgcaaccaa aagaacacct ttatgggcga tgttgtcatc actggattcc 4320 gctgtgtatc gcaggtcata tccagatttg ctcgagcgag atataataat tgggggatag 4380 cagaattcaa ccagttgcca gtcaacatcg ttcaatccct ttcccttatt ccaaactttc 4440 atatcaggac ccttggctgt gctgccctcg ccagatccaa gccgtgcttc gatttgagca 4500 gccaacatct catgcgttat tttcgcttcc ttgtccaata ttgattctag tttgagcgct 4560 acatgatgtt tcaaaagagt ggacgttagg tttgctgcgg tctgggtgat tttcagttcc 4620 tcagaatcct tgacagccat gaagccggag actgcaggac tcatgtcaac gatctcgggc 4680 ttgctctgcg actcagcaat cagcttatcc cattcagtta taagtcttcc tgtgtgagtt 4740 tccttcagga gtgtgccgac gcgctttttg gatgtgtatt tctctccgaa cttgggtagg 4800 gcatcattgg gagcatcctt tcctttggct tgtgcgaata tctcgattgg gacatgccca 4860 gattcgtttt ctatctgagc aaggatcttg gcttttgacg cggagcagag aatagatatt 4920 ctgtctttct ggaagagaaa cagcgtggaa ggaaattcgt atccaaggag ccattgctgc 4980 agacaagtcc cctttcgcat tggttcatcc tcagacgccg ggtccccggc aataagaagc 5040 aaagcatctg tatctgctat cgagctataa tcatcatcgt tttttgcgct attccaaccg 5100 tcgtagatac gctttacgcg ggagttaaac agctgcttgt tcagctcgat gagcatattg 5160 agcagtgggg aatgctggga aagaaggcca gaaatgaagc gcgtcaagt 5209 <210> 3 <211> 2269 <212> DNA 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tcctacaagt 840 tgagcaacaa gtccaagtcc ccgtgaggcc gctccaaaaa atgccaaata ccatactgta 900 cgagcgaaac aaagcgcatc aacaaggaat aataaaaatt caggaaaacc aacaagagat 960 aggacggcaa atatggagtt gaaaacgggg aatgaaaagg agtgacgagg tggggaggcg 1020 gaatcgaaac aatgggatgt ggtgcgtgcg agagcatacg taggtccgat tgctttcccc 1080 ctcaacccat cttgctgtcc ttcttcttct gcttgcgcgg tggtgttacc gggcgcccga 1140 cattcatccc accataggga tacttcgcct ttttctccgc tggtttcaga atctggaacg 1200 aacacagcag tgtttcgtca acactcatca tcgccccagc gttatcaaac tccccgcagt 1260 aattaggcgc cgagaatagc gtcactagat gccgcttggc gaagaactcg tatccgtctt 1320 ccacgacctg atgtgctcga cagatcaggt ccatatcgtg cttttgaagg aaccgcgaaa 1380 ccacatcggg gccaaaggta aatgacactc cccggtcgtt ctccgaccac cccgtgatat 1440 ccttgtcggg gtctgaccat agaagatcac agagtagacc cgtgtccgga acgtctgtcg 1500 gacgcataac ccgccgtatc tgctccatcg actgcaggtc tggacttagc ccaccgtgca 1560 ttgtgaagat cttctcatcg atgatggcgg caattggcaa gcaattaaag caatccgtaa 1620 aggttttcca caacttgatg ttgtatcgac gtttacattc atcatagaag ccgtatatcc 1680 tgttaatact agcgcattcg tggttgcctc gcagtatgaa gaaattttcg gggtatttga 1740 tcttgtaggc gaggagaagg cagatagtct cgagagactg tttccctcgg tcgacataat 1800 cgccgaggaa gaggtagttt gcttctggcg gaaatccgcc gtattcgaaa agtcgaagaa 1860 ggtcgtaata ttggccgtgt atgtcaccgc atatcttaat cggagcctcc aactcgagca 1920 gaatgggctg gttgatgaag atctctcttg cttttgtaca tagatatttg atttcgtatt 1980 cttgcagctg caccggcttg ccaggtcgat tgccacggac ttccagaagc ctgtcgatga 2040 ccgagtcaag atcatcaggt ccatatcgtg cttttgaagg aaccgcgaaa ccacatcggg 2100 gccaaagagt agacctagag aaaacaaacg cataaaagaa tatcacgcct gccatcagtc 2160 gcctattccg cacgtagcca cccatgacaa ggcaaggaga ggaagaagga tgctcacccg 2220 tgtccggaac gtctgtcgga cgcataaccc gccgtatctg ctccatcga 2269 <210> 4 <211> 3483 <212> DNA <213> Hypsizygus marmoreus <400> 4 aggggcctca agctcgggga tgtcatcatc atcttcttca tcgccaccag caccgtccat 60 tctatctcct ttctggctct tatttcttgg ttaaatcata caaaatgtgg agacccgcga 120 ctcgccaaat cactggcaca aacgatgtac cactcggcca acgtcgtcgt tttggccctg 180 cgcctgcgga 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gatgaaaacc agatctgcca aaactgcggt ggtgtcggac 1080 accgcaaata tgactgccca gaacagcgaa acttcactgc taacatcatc tgtcgtgttt 1140 gcggcagcgc tggacatatg gctcgcgatt gcactgtcaa caaggatccc aacgccccca 1200 tgccaattgg cggaccatca ccacctcaag cgcgcagtgg attcgattca gagtatgcga 1260 gtctgatggc tgagcttggg gagggagggg gcggagccac cgatccagga gcagcgtggg 1320 ctgcaccagc catgggacat gatatcaccg ctggcgggtc aaacattcca ccttggcgtc 1380 gtcctgaatc ctggatacag cctgtcaata accagtctca gcagggcggc tatcgcccac 1440 ctcaagctgg atatggagct ggatatggtg gcgctcctgc tggaggttat ggagccgcag 1500 ctggtcaatg ggcaggttat caggccggtg gctatcagca acctcaagaa tatgccaact 1560 acgcatctta ctaccaaggc caatacgctc agcaacagac cagctaatcg aatcatcttc 1620 tgatcgtcat tattcacctc tctaacactc cgtagcggca aaagattctc acaggcttac 1680 cctcttattc tttgagcccg gttctcttac acaactctcg atcgtcgaca cccaccgtct 1740 gcggactctg gtatgatcat gggaggtaat aagtattcac atcgttcgcg tttcatcgac 1800 tgcatagtgg acgattgacg aaaccagcag agaacttcct taaatactct tcattgtagc 1860 gcacctttct ctttaacacg 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F <400> 21 accgtccttt ccgcttgtta 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL006607t0002 primer R <400> 22 gccattgcct ttgccttcaa 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL004780t0001 primer F <400> 23 actgcctgga atcagcgaat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL004780t0001 primer R <400> 24 ggaggctgga acattgctct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL013653t0001 primer F <400> 25 cacctggacg gtctcgaaaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL013653t0001 primer R <400> 26 gtcagcttcg ctttcgttgg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL002874t0001 primer F <400> 27 tcttgacaag cagagccagg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL002874t0001 primer R <400> 28 gatgccgttt cccaagcatg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL006530t0001 primer F <400> 29 tgatatctag ctcgggccga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL006530t0001 primer R <400> 30 aggccttgaa aatcgagcga 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL012513t0002 primer F <400> 31 ggccgtggta ggacaatgaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL012513t0002 primer R <400> 32 ccacacctga ccctgcttac 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL014433t0001 primer F <400> 33 aaacctttcc tccgaggctg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL014433t0001 primer R <400> 34 tctcgaccct tttcctgtgc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL008494t0004 primer F <400> 35 accaagtacc ttgtcacggc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Htessellatus1SL008494t0004 primer R <400> 36 caacatactc cgacccaccc 20

Claims (7)

1. 하기의 단일염기다형성(SNP)을 포함하는 만가닥 버섯 품종 구별용 분자머커:
   서열번호 1로 표시되는 염기서열의 384번 위치, 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 2100번 위치, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열의 1574번 위치, 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 1815번 위치, 서열번호 5로 표시되는 염기서열의 215번 위치, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열의 2040번 위치 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열의 2348번 위치의 뉴클레오티드가 C 또는 T인 SNP 마커;
   서열번호 8로 표시되는 염기서열의 1913번 위치, 서열번호 9로 표시되는 염기서열의 3483번 위치, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열의 701번 위치 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열의 2350번 위치의 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 마커; 및
   서열번호 12로 표시되는 염기서열의 1379번 위치의 뉴클레오티드가 G 또는 A인 SNP 마커.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 만가닥 버섯 품종은 하기 표로 표시되는 것인, 만가닥 버섯 품종 구별용 분자머커:
   [표]
   

   
3. 서열번호 1의 384번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 13 및 14의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 2의 2100번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 15 및 16의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 3의 1574번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 17 및 18의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 4의 1815번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 19 및 20의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 5의 215번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 21 및 22의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 6의 2040번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 23 및 24의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 7의 2348번 위치의 뉴클레오타이드인 C 또는 T를 구별하기 위한 서열번호 25 및 26의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 8의 1913번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 27 및 28의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 9의 3483번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 29 및 30의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 10의 701번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 31 및 32의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍;
   서열번호 11의 2350번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 33 및 34의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍; 및
   서열번호 12의 1379번 위치의 뉴클레오타이드인 G 또는 A를 구별하기 위한 서열번호 35 및 36의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 만가닥 버섯 품종 구별용 프라이머 쌍.
   
4. 제 3항에 있어서,
   상기 만가닥 버섯 품종은 하기 표로 표시되는 것인, 만가닥 버섯 품종 구별용 프라이머 쌍:
   [표]
   

   
5. 청구항 제3항 또는 청구항 제4항의 프라이머 쌍을 포함하는, 만가닥 버섯 품종 구별용 키트.
   
6. 만가닥 버섯으로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고 청구항 제 3항의 프라이머 쌍으로 증폭하는 단계; 및
   상기 얻어진 증폭 산물로부터 상기 만가닥 버섯의 품종을 결정하는 단계를 포함하는, 만가닥 버섯 품종을 구별하는 방법.
   
7. 청구항 제6항에 있어서,
   상기 얻어진 증폭 산물로부터 상기 만가닥 버섯의 품종을 결정하는 단계는, 얻어진 증폭 산물을, 청구항 제3항의 프라이머 세트에 의해 하기 표에 기재된 만가닥 버섯 품종의 핵산을 증폭한 결과와 비교함으로써 수행되는 것인, 만가닥 버섯 품종을 구별하는 방법:
   [표]
   

   

   
   
   

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