CN111961735B - 一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性引物对、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性序列,所述特异性序列为(AT)6A(AT)6。本发明利用11种检疫性实蝇的基因组数据,发现枣实蝇的物种特异性SSR序列位点,并通过软件设计引物,PCR扩增后只在枣实蝇检测到特异性条带。最终分子生物学实验验证了枣实蝇的物种特异性SSR序列位点及其引物可以有效地区分出枣实蝇,对枣实蝇的高效率快速鉴定提供具有理论指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,尤其涉及一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性引物对、试剂盒和方法。
背景技术
实蝇是植食性昆虫,幼虫均为潜食性,绝大多数种类为水果、蔬菜、花卉作物的害虫,严重影响我国农业经济。传统的昆虫检疫鉴定以形态学鉴定为主,但对于个体微小、形态相近的形态鉴定困难的样品,在口岸检疫时的存在一定的局限性。一方面,对于形态近似的隐存种、复合种,形态差异非常小,需要有长期鉴定经验的专一类群的鉴定专家才可能给出准确判定;另一方面,对于检疫截获的形态特征模糊的样本,如幼体及受损样本或非成虫虫体,则难以通过形态学方法有效鉴定。另外,实蝇存在大量复合种的现象,其复合种的鉴定十分困难,目前还没有一个能够涵盖所有桔小实蝇复合种的分类检索表。
随着现代分子生物学技术及生物信息学的快速发展,越来越多基于DNA的鉴定体系被应用于物种识别鉴定中。目前在实蝇类昆虫中最常用的是线粒体基因,其特点是基因两端序列相对保守,而密码子第三位碱基可以自由变异,在不同物种之间差异较大,因此常用于区分相近物种,但隐存种和复合种的种间差异小,不能有效区分,导致检疫过程中发生漏检、误检,引起国际争端。因此,需要更为高效的分子鉴定手段对实蝇类昆虫进行快速鉴定,帮助口岸形成较为完善的实蝇类昆虫的快速检测技术体系。
发明内容
本发明旨在提供利用11种实蝇的基因组survey测序数据,鉴定实蝇特异性SSR序列位点并设计引物以区分出枣实蝇,以克服现有技术中存在的不足。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性序列,所述特异性序列为(AT)6A(AT)6。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,一种特异性引物对,所述引物对的序列如SEQ ID NO:1-2所示。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,一种用于快速鉴定枣实蝇的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性序列,以及权利要求2所述的特异性引物对序列。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,权利要求2所述的特异性引物在鉴定枣实蝇物种中的应用。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,权利要求3所述的试剂盒在鉴定枣实蝇物种中的应用。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,一种基于快速鉴定枣实蝇的特异性序列设计引物鉴定的方法,包括以下步骤:
(1)根据物种特异性SSR序列位点,利用软件设计引物,并在测序实蝇的基因组内进行比对,筛选出枣实蝇的特异性引物;
(2)利用实蝇基因组DNA作为模板,进行PCR扩增;
(3)PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测是否存在预期大小条带。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,在步骤(1)中,设计引物时,扩增产物在2000bp以内。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,在步骤(2)中,利用11种检疫性实蝇成虫,利用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,在步骤(2)中,PCR扩增的体系为20μL,其中包括2×Premix Ex Taq(Takara)10μL,DNA模板1μL,10μM浓度的上下游引物各1μL,余量为灭菌蒸馏水。
在本发明的一个较佳实施例中,进一步包括,PCR扩增条件:95℃预变性3min,94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸45s,35个循环后72℃延伸5min。
本发明的有益效果:
(1)本发明的电泳结果显示,特异性条带只存在对应物种中,在其余物种中均不存在,说明发现的枣实蝇物种特异性SSR序列位点可以用来设计引物以区分出枣实蝇。
(2)本发明利用11种检疫性实蝇的基因组数据,发现枣实蝇的物种特异性SSR序列位点,并通过软件设计引物,PCR扩增后只在枣实蝇检测到特异性条带。最终分子生物学实验验证了枣实蝇的物种特异性SSR序列位点及其引物可以有效地区分出枣实蝇,对枣实蝇的高效率快速鉴定提供具有理论指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1枣实蝇的特异性引物PCR扩增电泳效果图;
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施,因此,本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
实施例1
本专利发明利用6属11种重要跨境实蝇低丰度基因组测序数据(墨西哥实蝇(Anastrepha ludens)、加勒比实蝇(Anastrepha suspensa)、番石榴实蝇(Bactroceracorrecta)、桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)、橘大实蝇(Bactrocera minax)、瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae)、枣实蝇(Carpomya vesuviana)、地中海实蝇(Ceratitiscapitata)、小南瓜实蝇(Dacus ciliatus)、黑脊实蝇(Dacus punctatifrons)、欧洲樱桃实蝇(Rhagoletis cerasi)),鉴定发现物种特异性SSR序列位点,该特异性特异性SSR序列位点为(AT)6A(AT)6。
实施例2
本发明利用实施例1中的特异性SSR序列位点,设计出特异性引物,用于鉴定枣实蝇物种特异性序列的引物如表1中所示。
表1枣实蝇的物种特异性SSR序列位点及引物序列
实验方法:
(1)利用软件Primer Premier 5.0设计引物,扩增产物大小设置在2000bp以内,设计好的引物通过NCBI primer-blast工具在各实蝇基因组间进行筛选获得特异性的引物;
(2)分别收集11种检疫性实蝇成虫,利用QIAGEN基因组DNA提取试剂盒提取DNA,并通过紫外分光光度计确定浓度;
(3)以11种检疫性实蝇DNA作为模板,利用ExTaq酶(Takara)进行PCR扩增反应。
PCR扩增的体系为20μL,其中包括2×Premix Ex Taq(Takara)10μL,DNA模板1μL,10μM浓度的上下游引物各1μL,余量为灭菌蒸馏水;
PCR扩增条件:95℃预变性3min,94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸45s,35个循环后72℃延伸5min。
本发明的扩增反应在VeritiTM 96孔美国ABI基因扩增仪上进行。
电泳检测:PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳分离检测。
如图1中所示,电泳结果显示,特异性条带只存在枣实蝇物种中,在其余物种中均不存在,说明发现的枣实蝇物种特异性SSR序列位点可以用来设计引物以区分出枣实蝇。
本发明利用11种检疫性实蝇的基因组数据,发现枣实蝇的物种特异性SSR序列位点,并通过软件设计引物,PCR扩增后只在枣实蝇检测到特异性条带。最终分子生物学实验验证了枣实蝇的物种特异性SSR序列位点及其引物可以有效地区分出枣实蝇,对枣实蝇的高效率快速鉴定提供具有理论指导意义。
此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心
浙江大学
乌鲁木齐海关技术中心
广州海关技术中心
<120> 一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性引物对、试剂盒和方法
<130> 1
<141> 2020-08-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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Claims (4)
1.一种用于快速鉴定枣实蝇的特异性引物对,其特征在于,所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO:1-2所示。
2.一种用于快速鉴定枣实蝇的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物对。
3.权利要求1所述的特异性引物对在鉴定枣实蝇物种中的应用。
4.权利要求2所述的试剂盒在鉴定枣实蝇物种中的应用。
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