CN105063214A - 快速鉴定番石榴实蝇的ss-pcr特异性引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及快速鉴定番石榴实蝇的SS-PCR特异性引物及试剂盒。所述快速鉴定番石榴实蝇的特异性SS-PCR引物对包括引物：LJF400：5’-ACTCTGTTTAGCCGGGATCT-3’；LJR564：5’-CCGGCTAAAACTGATGGAGA-3’。本发明所建立的SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的方法具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点，可以在8小时之内完成锈实蝇的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。

Description

快速鉴定番石榴实蝇的SS-PCR特异性引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及快速鉴定番石榴实蝇的SS-PCR特异性引物及试剂盒。
背景技术
番石榴实蝇隶属双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、寡毛实蝇亚科(Dacinae)、寡毛实蝇族(Dacini)、果实蝇属(Bactrocera)，目前主要分布在泰国、越南、缅甸、尼泊尔、印度、巴基斯坦、斯里兰卡、中国的云南、台湾地区等地区。番石榴果实蝇寄主范围广，危害性大，是果蔬生产中的重要害虫，受到国内外植物检疫的普遍关注。近几年，由于国际贸易的日渐频繁，合作领域不断拓宽，在进出境的果蔬中经常截获番石榴实蝇等各种不同的实蝇幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体；对于幼虫的分类鉴定要比成虫困难得多，为了保证鉴定的准确性通常是将幼虫在室内饲养为成虫，而这需要花费较长的时间，严重影响了果蔬进出口贸易的通关速度；而对于残体则是无法对其进行正确的识别鉴定。因此为了防止检疫性实蝇传入以及扩散，迫切需要开展关于实蝇的快速鉴定识别的技术。
近年来，由于分子生物学技术能解决传统的形态学分类方法难以解决的问题且不受虫态的影响，越来越多的分子生物学技术被运用于昆虫的鉴定中，种特异引物PCR(Species-specificPCR，SS-PCR)技术，即在设计目标物种的引物时必须充分考虑引物的特异性，使得在扩增未知模板时能够根据目标片段条带的有无就能把目标种类与其他种类鉴别开来。本发明提供了一种采用特异性引物快速鉴定番石榴实蝇的方法，能够准确及时对截获的疑似番石榴实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等进行鉴定，建立了一种快速鉴定番石榴实蝇的方法。
发明内容
本发明的目的是提供快速鉴定番石榴实蝇的SS-PCR特异性引物。
本发明的再一目的是提供快速鉴定番石榴实蝇的试剂盒。
本发明的再一目的是提供快速鉴定番石榴实蝇的方法。
根据本发明的快速鉴定锈实蝇的SS-PCR特异性引物，引物序列为：
FR447：3’ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5’；
FF463-486：3’CACAACCGTTATTAACATGCG5’。
选择桔小实蝇B.dorsalis，颜带实蝇B.cilifer，锈实蝇B.rubigina，瑞丽果实蝇B.ruiliensis，瘤胫实蝇B.tuberculata，杨桃实蝇B.carambolae，瓜实蝇B.cucurbitae，辣椒实蝇B.latifrons，南瓜实蝇B.tau，具条实蝇B.scutellata，近黑颜实蝇B.parater，黑膝实蝇B.scutellaris，滇寡鬃实蝇B.modica，何氏华实蝇B.hochii，枣实蝇Carpomyavesuviana，瓜棍腹实蝇Dacuslongicornis，腿端黑实蝇B.atrifemur，黑颜实蝇B.diaphora，五指山实蝇B.wuzhishana作为阴性对照来证明本发明设计的引物的特异性，大大缩短了锈实蝇的鉴定周期。
上述引物对扩增得到的鉴定番石榴实蝇的特异性片段的序列为：番石榴实蝇Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi)，645bp：
5’-CACAACCGTTATTAACATGCGATCGACAGGAATTTCATTTGACCGAATACCTCTATTCGTTTGAGCAGTTGTATTAACAGCTTTATTACTTCTGTTATCACTACCAGTTTTAGCAGGAGCTATCACTATACTATTAACAGATCGAAACTTAAATACTTCCTTTTTTGACCCCGCAGGAGGAGGAGACCCTATTCTCTACCAACACTTATTTTGATTCTTTGGACACCCAGAAGTTTACATTTTAATTTTACCAGGATTCGGAATAATTTCTCATATTATTAGTCAAGAATCAGGAAAGAAGGAAACATTCGGATCTTTAGGAATAATTTATGCTATAATAGCAATTGGTCTCTTAGGATTCATTGTATGAGCTCATCATATATTTACTGTAGGAATAGATGTAGACACTCGAGCTTATTTCACTTCAGCTACAATAATTATTGCTGTACCCACAGGTATTAAAATTTTTAGTTGACTAGCCACATTACACGGTACACAATTAAATTACTCCCCAGCCATATTATGAGCCCTAGGGTTTGTATTCCTATTTACAGTAGGAGGATTAACAGGAGTTGTCCTAGCTAATTCATCTGTAGACATTATTCTTCATGACACATATTATGTTGTTGCTCATTTCCACTACGT-3’
本发明具体提供了一种采用特异性引物快速鉴定番石榴实蝇的方法，具体方法如下：
(1)通过种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出了1对番石榴实蝇的特异性引物FR447：3’ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5’；
FF463-486：3’CACAACCGTTATTAACATGCG5’。
(2)采用SSR-PCR引物的种特异性的检验：选用桔小实蝇B.dorsalis，颜带实蝇B.cilifer，锈实蝇B.rubigina，瑞丽果实蝇B.ruiliensis，瘤胫实蝇B.tuberculata，杨桃实蝇B.carambolae，瓜实蝇B.cucurbitae，辣椒实蝇B.latifrons，南瓜实蝇B.tau，具条实蝇B.scutellata，近黑颜实蝇B.parater，黑膝实蝇B.scutellaris，滇寡鬃实蝇B.modica，何氏华实蝇B.hochii，枣实蝇Carpomyavesuviana，瓜棍腹实蝇Dacuslongicornis，腿端黑实蝇B.atrifemur，黑颜实蝇B.diaphora，五指山实蝇B.wuzhishana作为阴性对照，番石榴实蝇为阳性对照，验证番石榴实蝇特异性引物的种特异性。结果表明，仅番石榴实蝇在645bp处有一条特异性扩增的条带，阴性对照均无特异性目标片段，从而证明该引物在实验涉及的这些实蝇种类范围内，能特异性的鉴定番石榴实蝇。
一方面，引物的特异性是本实验成功的关键，特异性片段要有足够变异能够将不同物种区分开。另一方面，当口岸仅发现卵或是残体时，即只能提取到微量DNA时，SS-PCR检测鉴定方法的灵敏度就至关重要了。根据本发明的技术方案具有较高的灵敏度，能检测到的DNA模板浓度可低至36.24ng/uL，同时该SS-PCR特异性引物能够稳定区分近似物种，因此，本发明的检测鉴定方法在实际检疫工作中也得到应用和验证。
综上所述，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的方法具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点，可以在8小时之内完成锈实蝇的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。
附图说明
图1显示引物FR447和FF463的种特异性验证，M：100bpDNALadder，1：番石榴实蝇B.correcta，2：桔小实蝇B.dorsalis，3：颜带实蝇B.cilifer，4：锈实蝇B.rubigina，5：瑞丽果实蝇B.ruiliensis，6：瘤胫实蝇B.tuberculata，7：杨桃实蝇B.carambolae，8：瓜实蝇B.cucurbitae，9：辣椒实蝇B.latifrons，10：南瓜实蝇B.tau，11：具条实蝇B.scutellata，12：近黑颜实蝇B.parater，13：黑膝实蝇B.scutellaris，14：滇寡鬃实蝇B.modica，15：何氏华实蝇B.hochii，16：枣实蝇Carpomyavesuviana，17：瓜棍腹实蝇Dacuslongicornis，18：腿端黑实蝇B.atrifemur，19：黑颜实蝇B.diaphora，20：五指山实蝇B.wuzhishana，21：空白对照ddH2O。
图2显示SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的应用与验证，M：100bpDNALadder，1-19：番石榴实蝇B.correcta，20：空白对照ddH2O。
图3显示引物FR447和FF463的灵敏度验证，M：100bpDNALadder，1：100，2：10-1，3：10-2，4：10-3，5：空白对照ddH2O。
具体实施方式
供试实蝇有1：番石榴实蝇B.correcta，2：桔小实蝇B.dorsalis，3：颜带实蝇B.cilifer，4：锈实蝇B.rubigina，5：瑞丽果实蝇B.ruiliensis，6：瘤胫实蝇B.tuberculata，7：杨桃实蝇B.carambolae，8：瓜实蝇B.cucurbitae，9：辣椒实蝇B.latifrons，10：南瓜实蝇B.tau，11：具条实蝇B.scutellata，12：近黑颜实蝇B.parater，13：黑膝实蝇B.scutellaris，14：滇寡鬃实蝇B.modica，15：何氏华实蝇B.hochii，16：枣实蝇Carpomyavesuviana，17：瓜棍腹实蝇Dacuslongicornis，18：腿端黑实蝇B.atrifemur，19：黑颜实蝇B.diaphora，20：五指山实蝇B.wuzhishana。
采用OMEGAE.Z.N.A.TMInsectDNAKit试剂盒法提取DNA。具体步骤为：选用整只实蝇或是实蝇部分身体(如一条腿或是一片翅膀)或是蛹、幼虫于2ml离心管中，加入适量液氮充分研磨，然后根据试剂盒的说明书操作步骤进行，最后将得到的DNA样品保存于-20℃备用。
利用通用引物LCO1490和HCO2198来进行实蝇样本DNA的质量检测，PCR反应在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：2×EasyTaqPCRSuperMix(天根生化科技有限公司)12.5uL，引物各1uL，模板各2uL，加ddH2O至总体积25uL；反应条件为94℃/5min，94℃/40s，48℃/30s，72℃/1min，35个循环，最后延伸10min；分别提取5uLPCR产物在含DNA染色剂的1.5％的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30min(120V)，利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。通用型引物LCO1490和HCO2198的序列分别为：
LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’；
HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；
选用除番石榴实蝇除外的其它19种实蝇作为阴性对照，番石榴实蝇为阳性对照，验证本实验所设计引物的种特异性。SS-PCR在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：2×EasyTaqPCRSuperMix12.5uL，引物各1uL，模板各2uL，加ddH2O至总体积25uL；反应条件为94℃/5min，94℃/40s，52℃/30s，72℃/1min，30个循环，最后延伸7min；分别提取5uLPCR产物在含DNA染色剂的1.5％的琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30min(120V)，利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。
利用核酸蛋白分析仪测试提取的番石榴实蝇DNA模板的浓度。将番石榴实蝇DNA模板按10-1、10-2、10-3倍梯度稀释，然后使用种特异性引物LJF400和LJR564进行PCR扩增，来验证该检测方法的灵敏度。
利用由长乐机场截获的的番石榴实蝇(已饲养到成虫并经过形态鉴定)的DNA为模板，使用种特异性引物FR447：3’ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5’；FF463-486：3’CACAACCGTTATTAACATGCG5’进行PCR扩增，来验证该方法的稳定性与准确性。
利用通用引物LCO1490和HC02198对提取的实蝇DNA模板进行PCR扩增，结果表明，所有的实蝇DNA均能扩增出单一且清晰的，长度约700bp的目标条带。
通过筛选最终选择的种特异性引物FR447：3’ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5’；FF463-486：3’CACAACCGTTATTAACATGCG5’。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
(1)引物的种特异性
结果显示仅番石榴实蝇扩增出清晰且单一的约645bp的条带，其它实蝇种类均未出现目标条带。重复实验3次，结果均一致，表明该实验设计的种特异性引物具有较强的特异性及稳定性(图1)。
将实验所得到的PCR产物送到英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，将所得到的序列提交NCBI数据库进行BLAST，结果表明该段序列与数据库中的番石榴实蝇序列具100％的一致性。
(2)引物的灵敏度
利用核酸蛋白分析仪测试提取的番石榴实蝇DNA模板的浓度为36.24ng/uL。取不同浓度的DNA模版进行最低检出阈值的测定，随着模版浓度的降低，扩增出的条带逐渐减弱，在稀释10-1倍后仍有明显条带，说明该方法具有较高的灵敏度(图3)。
截获的实蝇标本均有目标条带，结果表明，分子生物学鉴定结果与形态学鉴定结果一致，该方法具有较好的稳定性，可以应用于番石榴实蝇的实际鉴定工作(图2)。
本实验选用桔小实蝇B.dorsalis，颜带实蝇B.cilifer，锈实蝇B.rubigina，瑞丽果实蝇B.ruiliensis，瘤胫实蝇B.tuberculata，杨桃实蝇B.carambolae，瓜实蝇B.cucurbitae，辣椒实蝇B.latifrons，南瓜实蝇B.tau，具条实蝇B.scutellata，近黑颜实蝇B.parater，黑膝实蝇B.scutellaris，滇寡鬃实蝇B.modica，何氏华实蝇B.hochii，枣实蝇Carpomyavesuviana，瓜棍腹实蝇Dacuslongicornis，腿端黑实蝇B.atrifemur，黑颜实蝇B.diaphora，五指山实蝇B.wuzhishana作为阴性对照，番石榴实蝇作为阳性对照，利用本发明设计的引物进行PCR扩增，仅番石榴实蝇能特异性并稳定性地扩增出长度约645bp的清晰且单一的目标条带，其它实蝇种类均无条带出现，进一步验证了本实验所设计引物的特异性。然而当口岸仅发现卵或是残体时，即只能提取到微量DNA时，SS-PCR检测鉴定方法的灵敏度就至关重要了，本实验所建立的方法具有较高的灵敏度，能检测到的DNA模板浓度可低至36.24ng/uL。同时该SS-PCR检测鉴定方法在实际检疫工作中也得到应用和验证。
综上所述，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的方法具有快速简便、特异性高、灵敏度高等优点，可以在8小时之内完成番石榴实蝇的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速通关的要求。

Claims (4)

1.快速鉴定番石榴实蝇的特异性SS-PCR引物对，其特征在于，包括以下引物：
FR447：ACGTAGTGGAAATGAGCAACA
FF463-486：CACAACCGTTATTAACATGCG。
2.用于番石榴实蝇的快速鉴定的特异性基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo:3所示。
3.一种番石榴实蝇特异性检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述SS-PCR引物对进行PCR扩增的步骤。
4.一种番石榴实蝇检测特异性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的番石榴实蝇特异性SS-PCR引物对。
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