CN105112410A - 用于马来沉香鉴定的基因检测引物、探针和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马来沉香鉴定的基因检测引物、探针和方法，所述方法包括具有马来沉香的专属特异性引物、探针和PCR检测方法。利用本发明鉴定方法采样量少，并且能快速、准确、客观地得到马来沉香的种属鉴定结果。

Description

用于马来沉香鉴定的基因检测引物、探针和方法

技术领域

本发明涉及木材材种鉴定的基因检测领域，具体地说涉及对马来沉香的基因鉴定方法及其所使用的引物和探针。

背景技术

马来沉香是瑞香科沉香属的一种，分布在孟加拉国、印度、印度尼西亚、老挝、马来西亚、缅甸、菲律宾、新加坡、泰国等地，属于世界濒危保护树种，马来沉香是沉香的主要来源。以往一般通过理化鉴别和显微观察横切面法对沉香进行鉴别。

传统的木材鉴定识别方法是利用人工经验进行识别，主要通过对木材截面进行人工观察的方式完成。一般情况下依赖肉眼和放大镜进行宏观识别，而微观识别则需要使用光学显微镜观察其内部的解剖结构特征，也就是观察构成木材的各类细胞与组织的形态及排列特征，该方法涉及的识别特征较多，鉴定相对准确，但对于鉴定工作者的要求很高，要对此做出准确的鉴定，必须具有丰富的实践经验。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性,推动了木材识别技术的发展。但是，无论是基于识别者经验的传统识别技术还是基于计算机图像检索的识别技术，都没有脱离木材本身的形态结构及特征，鉴定识别工作都必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构的基础上，这就为木材识别工作带来了一定的局限性，同时，相近种属木材易出现材质结构的相似，为木材识别的准确性带来困难。

因此建立起以马来沉香的DNA条形码技术为基础的分子鉴定方法，实现马来沉香的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明提供一种用于用于马来沉香鉴定的基因检测引物和探针，所述引物和探针序列包括：

MLCXPrimer-F：5'-TCCCGTTCGCTACTTTGACT-3'

MLCXPrimer-R：5'-GCTATCCCGACCCTTACCA-3'

MLCXPrimerProbe：5'-VIC-TTGACATACACCCAAGC-MGB-3'。

进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。

进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为：MLCXPrimer-F:MLCXPrimer-R:MLCXPrimerProbe=1:1:2。

本发明还提供了一种用于马来沉香的分子鉴定的方法，包括如下步骤：

（1）木材样本的预处理；

（2）提取经（1）处理后的木材样本中的DNA；

（3）利用引物MLCXPrimer-F和MLCXPrimer-R，以及探针MLCXPrimerProbe对（2）中提取的DNA进行荧光PCR扩增；

（4）木材种类的确定；

所述引物和探针序列包括：

MLCXPrimer-F：5'-TCCCGTTCGCTACTTTGACT-3'

MLCXPrimer-R：5'-GCTATCCCGACCCTTACCA-3'

MLCXPrimerProbe：5'-VIC-TTGACATACACCCAAGC-MGB-3'。

进一步地，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：实时荧光定量PCR技术具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时检测。该法综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，易于统一标准。本发明通过一对特异性扩增引物及MGB探针对目的基因进行扩增，条件依赖少，一般的PCR实验室设备即可满足，对结果的分析非常直观。

本发明在对马来沉香大量基因信息进行分析比较的基础上，根据序列位点多态性，设计马来沉香种属特异引物和探针，建立了马来沉香特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明很好地满足各相关部门对马来沉香快速筛查和鉴定的要求，能有效杜绝马来沉香制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范市场，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。

附图说明

图1是马来沉香和15个对照组树种DNA提取效果实验。

图2是本发明方法的特异性实验结果。

图3是本发明方法的灵敏度实验结果。

图4是取自针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。

实施例1检测马来沉香的引物、探针和检测试剂盒

利用NCBI等资源信息，找出马来沉香与其他木材的基因差异位点，筛选出一对特异性扩增引物对（MLCXPrimer-F和MLCXPrimer-R），并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针（MLCXPrimerProbe）。所述扩增引物对和探针序列分别是：

MLCXPrimer-F：5'-TCCCGTTCGCTACTTTGACT-3'

MLCXPrimer-R：5'-GCTATCCCGACCCTTACCA-3'

MLCXPrimerProbe：5'-VIC-TTGACATACACCCAAGC-MGB-3'。

一种检测马来沉香的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

其中所述qPCR扩增反应体系为：20μl的体系包括：

SYBRPrmixTaqⅡ（2×）10μl

ROXReferanceDyeⅡ（50×）0.4μl

MLCXPrimerProbe0.4μl

MLCXPrimer-F（20μM）0.2μl

MLCXPrimer-R（20μM）0.2μl

DNA样品模板8.8μl

其中所述引物和探针序列分别为：

MLCXPrimer-F：5'-TCCCGTTCGCTACTTTGACT-3'

MLCXPrimer-R：5'-GCTATCCCGACCCTTACCA-3'

MLCXPrimerProbe：5'-VIC-TTGACATACACCCAAGC-MGB-3'。

阳性对照品：含有本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。

阴性对照品：不含本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。

空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质的ddH₂O。

实施例2：实时荧光PCR的鉴定方法

（1）木材样本的预处理：

用75%的乙醇对木材表面进行彻底的消毒，经无菌水冲洗并用擦干木材。切除待测木材表面部分以避免其他职务组织的污染。取一定量的木材样本，在预冷的研钵中加入液氮和石英砂研磨成粉末备用。当不立即使用时，样品DNA溶液在-20℃下保存待用。

（2）木材样本DNA提取：

采用植物基因组提取试剂盒（PlantGenomicDNAKit，TIANGEN）提取步骤（1）中预处理的木材总DNA，置于-40℃冰箱中备用。

（3）实时荧光PCR扩增：

将步骤（2）中提取的DNA进行qPCR检测。其中扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI7500RealTimePCRSystem完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。

MLCXPrimer-F：5'-TCCCGTTCGCTACTTTGACT-3'

MLCXPrimer-R：5'-GCTATCCCGACCCTTACCA-3'

MLCXPrimerProbe：5'-VIC-TTGACATACACCCAAGC-MGB-3'。

（4）确定木材种类

根据荧光PCR扩增结果确定木材样品的种类。

实施例3：DNA提取与检测

分别提取马来沉香（实验组1）、对照组为：A.sinensis（白木香）；A.beccariana（北氏白木香）；A.crassna；A.urdanetensis；A.yunnanensis（云南沉香）；A.khasiana；A.parvifolia；A.citrinacarpa总共8个对照的基因组DNA作为模板，利用植物內源基因tRNALeu及实施例1的反应体系和实施例2所述的检测方法，对提取的DNA进行检测。

tRNALeu的引物和探针序列分别为（标准）

tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'

tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'

tRNALeuProbe：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'

如图1表明实施例3中实验组和对照组样本的DNA均已经被成功提取。

实施例4：荧光PCR扩增的特异性

以实施例3提取DNA作为模版，实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法，进行马来沉香荧光PCR检测的特异性实验。

如图2所示实验结果表明，本发明所述的引物、探针和方法能扩增出马来沉香。而同属的A.sinensis（白木香）；A.beccariana（北氏白木香）；A.crassna；A.urdanetensis；A.yunnanensis（云南沉香）；A.khasiana；A.parvifolia；A.citrinacarpa不能被扩增，均为阴性。因此本发明所述引物、探针和方法能够检测出马来沉香，检测特异性好。

另外，将本实施例实验组和对照组的完整木材用传统的鉴定方法作进一步确认实验。结果表明，利用本发明所述分子鉴定方法确认的结果准确。由此可见，本发明具有很好的特异性。

实施例5：荧光PCR扩增的灵敏度

以同一根干燥的马来沉香木材为材料，烘干至恒重，然后分别以0.1g、0.5g、1.0g和2.0g取样，利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。

图3所示，随着样品量的增加，对应qPCR的Ct值成比例下降，样品取样量与结果对应性强。实验结果表明，利用本发明所述的引物和探针，可以检测出样品量仅为0.1g的DNA信息。

由于本发明所述分子鉴定方法只需要极少量的木材样本就可完成检测，它并不依赖于木材的形态结构是否完整。因此本发明不仅可以对形态完整的马来沉香进行鉴定，还可以对看不出原始形态的马来沉香加工成品或半成品等进行鉴定。

实施例6：检测经不同处理方式得到的木材样本

选用的木材样本分别来自：利用25℃和65℃三种温度干燥的木材；潮湿木材，即受潮的木材；分别采用挤压、熏蒸或气干处理的木材。利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图4所示的实验结果表明本发明所述的引物和探针，可以准确地分析出利用不同方法处理后的马来沉香的DNA情况。其中图中的A、B、C、D分别表示A：干燥木材；B：潮湿木材；C：挤压木材；D：熏蒸木材；E：气干木材。

SEQUENCELISTING

<110>浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>用于马来沉香鉴定的基因检测引物、探针和方法

<130>

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tcccgttcgctactttgact20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gctatcccgacccttacca19

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ttgacatacacccaagc17

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgaaatcggtagacgctacg20

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ttccattgagtctctgcacct21

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcaatcctgagccaaatcc19

Claims (5)

1.用于马来沉香鉴定的基因检测引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：

MLCXPrimer-F：5'-TCCCGTTCGCTACTTTGACT-3'

MLCXPrimer-R：5'-GCTATCCCGACCCTTACCA-3'

MLCXPrimerProbe：5'-VIC-TTGACATACACCCAAGC-MGB-3'。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。

3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的使用浓度比为：MLCXPrimer-F:MLCXPrimer-R:MLCXPrimerProbe=1:1:2。

4.用于马来沉香鉴定的基因检测方法，所述方法包括如下步骤：

（1）木材样本的预处理；

（2）提取经（1）处理后的木材样本中的DNA；

（3）利用引物MLCXPrimer-F和MLCXPrimer-R，以及探针MLCXPrimerProbe对（2）中提取的DNA进行荧光PCR扩增；

（4）木材种类的确定；

其特征在于，所述引物和探针序列包括：

MLCXPrimer-F：5'-TCCCGTTCGCTACTTTGACT-3'

MLCXPrimer-R：5'-GCTATCCCGACCCTTACCA-3'

MLCXPrimerProbe：5'-VIC-TTGACATACACCCAAGC-MGB-3'。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃34s，共40个循环。