CN105132542B - 利用pcr技术鉴定红木中阔叶黄檀的方法、引物和探针 - Google Patents

利用pcr技术鉴定红木中阔叶黄檀的方法、引物和探针 Download PDF

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Abstract

本发明公开了红木中阔叶黄檀的PCR鉴定用的引物、探针和方法，所述方法包括具有阔叶黄檀专属特异性的引物和探针，以阔叶黄檀基因的序列位点多态性信息为依据，能准确、客观地获得阔叶黄檀的种属鉴定结果，克服了传统鉴定法必须依赖于木材有完整易辨识的形态结构的缺点。因此本发明不仅能为执法过程提供准确的木材信息，对规范市场，保护消费者权益，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。另一方面，本发明检测需要的样本量非常小，因此鉴定过程中不会破坏木材的外形结构。

Description

利用PCR技术鉴定红木中阔叶黄檀的方法、引物和探针
技术领域
本发明涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说涉及对阔叶黄檀的分子鉴定方法及其所使用的引物和探针。
背景技术
红木是我国高端、名贵家具用材的统称。国家根据密度等指标对红木进行了规范，把红木规范为：二科、五属、八类、三十三种。
阔叶黄檀（Dalbergia emarginata Roxb），属于豆科蝶形花亚科，是一种具有重要经济价值的树种，它主要用于制作高级家具和装饰材料以及医药用途等。阔叶黄檀的主产地为：印度，印度尼西亚，爪哇岛中、西部，属《红木》国标五属八类里的黑酸枝类，所以市场上也俗称印尼黑酸枝。
近年来，由于红木家具受到越来越多消费者的喜爱，促进了红木家具制造业的繁荣，因此红木木材的进口量也随之逐年增加。但是，长期以来由于受利益驱使，红木市场良莠不齐，掺假造假情况突出：一方面用较次的红木冒充较好的红木，另一方面用非红木冒充红木等。
传统的红木鉴定主要依赖于形态鉴定方法，它必须建立在所检红木有完整易辨识的形态结构的基础上，这就为红木鉴定工作带来了一定的局限性。同时，相近种属红木易出现材质结构的相似，给红木鉴定的准确性带来困难。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性，推动了木材识别技术的发展。但是，基于计算机图像检索的识别技术依然没有脱离对木材本身的形态结构及特征的依懒性。
为红木建立起以DNA的分子鉴定技术，一方面杜绝红木制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范红木市场具有重要的意义，另一方面，为检验检疫、农林、工商的快速筛查和鉴定提供技术方法，促进物种资源的保护和利用，具有非常重要的社会意义。然而，目前对阔叶黄檀的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。因此建立起分子鉴定方法，实现阔叶黄檀的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明提供一种用于阔叶黄檀的PCR鉴定用的引物、探针，所述引物和探针序列包括：
KYHT Primer-F：5'-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3'
KYHT Primer-R：5'-GGTCGCGCGCATGACT-3'
KYHT Primer Probe ：5'-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3'。
进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃，2min；95℃ 15s，55℃ 34s，共40个循环。
进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为：KYHT Primer-F:KYHT Primer-R:KYHT Primer Probe=1:1:2。
本发明还提供了一种阔叶黄檀的PCR鉴定方法，包括如下步骤：
（1）木材样本的预处理；
（2）提取经（1）处理后的木材样本中的 DNA；
（3）利用引物KYHT Primer-F和KYHT Primer-R，以及探针KYHT Primer Probe对（2）中提取的DNA进行荧光PCR扩增；
（4）木材种类的确定；
所述引物和探针序列包括：
KYHT Primer-F：5'-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3'
KYHT Primer-R：5'-GGTCGCGCGCATGACT-3'
KYHT Primer Probe ：5'-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3'。
进一步地，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃ 15s，55℃ 34s，共40个循环。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：实时荧光定量PCR技术(real timequantitative PCR，RQ-PCR)具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时检测。而MGB探针法，既保证了反应的特异性，同时很好的控制了成本，该法综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
本发明在对阔叶黄檀大量基因信息进行分析比较的基础上设计阔叶黄檀种属特异引物和探针，建立了阔叶黄檀特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明很好地满足各相关部门对阔叶黄檀快速筛查和鉴定的要求，能有效杜绝阔叶黄檀制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范市场，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。
附图说明
图1是红木中阔叶黄檀和15个对照组树种DNA提取效果实验。
图2是本发明方法的特异性实验结果。
图3是本发明方法的灵敏度实验结果。
图4是取自针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果。
图5是取自木材不同部位样本的检测实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。
实施例1 检测阔叶黄檀的引物、探针和检测试剂盒
利用NCBI等资源信息，找出阔叶黄檀与其他木材的基因差异位点，筛选出一对特异性扩增引物对（KYHT Primer-F和KYHT Primer-R），并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针（KYHT Primer Probe）。所述扩增引物对和探针序列分别是：
KYHT Primer-F：5'-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3'
KYHT Primer-R：5'-GGTCGCGCGCATGACT-3'
KYHT Primer Probe ：5'-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3'。
一种检测阔叶黄檀的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
其中所述qPCR扩增反应体系为：20µl的体系包括：
SYBR Prmix Taq Ⅱ（2×） 10µl
ROX Referance Dye Ⅱ（50×） 0.4µl
KYHT Primer Probe 0.4µl
KYHT Primer-F（20µM） 0.2µl
KYHT Primer-R（20µM） 0.2µl
DNA样品模板 8.8µl
其中所述引物和探针序列分别为：
KYHT Primer-F：5'-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3'
KYHT Primer-R：5'-GGTCGCGCGCATGACT-3'
KYHT Primer Probe ：5'-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3'。
阳性对照品：含有本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。
阴性对照品：不含本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质的ddH2O。
实施例2：实时荧光PCR的鉴定方法
（1）木材样本的预处理：
用75%的乙醇对木材表面进行彻底的消毒，经无菌水冲洗并用擦干木材。切除待测木材表面部分以避免其他职务组织的污染。取一定量的木材样本，在预冷的研钵中加入液氮和石英砂研磨成粉末备用。当不立即使用时，样品DNA溶液在-20℃下保存待用。
（2）木材样本 DNA提取：
采用植物基因组提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit， TIANGEN）提取步骤（1）中预处理的木材总DNA，置于-40℃冰箱中备用。
（3）实时荧光PCR扩增：
将步骤（2）中提取的DNA进行qPCR检测。其中扩增条件为：95℃，2min；95℃ 15s，55℃ 34s，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI 7500 Real Time PCRSystem完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。
其中所述引物和探针序列分别为：
KYHT Primer-F：5'-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3'
KYHT Primer-R：5'-GGTCGCGCGCATGACT-3'
KYHT Primer Probe ：5'-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB -3'。
（4）确定木材种类
根据荧光PCR扩增结果确定木材样品的种类。
实施例3：DNA提取与检测
分别提取阔叶黄檀（实验组1）、对照组：刀状黑黄檀、黑黄檀、降香黄檀、东非黑黄檀、巴西黑黄檀、亚马孙黄檀、伯利兹黄檀、卢氏黑黄檀 、巴里黄檀、赛川黄檀、交趾黄檀、绒毛黄檀、中美洲黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀，总共15个对照的基因组DNA作为模板，利用植物內源基因tRNALeu及实施例1的反应体系和实施例2所述的检测方法，对提取的DNA进行检测。
tRNALeu的引物和探针序列分别为（标准）：
tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
tRNALeu Probe ：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'
如图1表明实施例3中实验组和对照组样本的DNA均已经被成功提取。
其中，各树种的拉丁名称分别为：降香黄檀D. odorifera，刀状黑黄檀D.cultrate， 黑黄檀D. fusca， 阔叶黄檀D. latifolia， 卢氏黑黄檀D. louvelii， 东非黑黄檀D. melanoxylon， 巴西黑黄檀D. nigra， 亚马孙黄檀D. spruceana， 伯利兹黄檀D.stevensonii， 巴里黄檀D. bariensis， 赛州黄檀D. cearensis， 绒毛黄檀D.frulescens， 中美洲黄檀D. granadillo， 奥氏黄檀D. oliveri， 微凹黄檀D. Retusa，交趾黄檀D. cochinchinensis。
实施例4：荧光PCR扩增的特异性
以实施例3提取DNA作为模版，实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法，进行阔叶黄檀荧光PCR检测的特异性实验。
如图2所示实验结果表明，本发明所述的引物、探针和方法能扩增出阔叶黄檀。而同属的刀状黑黄檀、黑黄檀、降香黄檀、东非黑黄檀、巴西黑黄檀、亚马孙黄檀、伯利兹黄檀、卢氏黑黄檀 、巴里黄檀、赛川黄檀、交趾黄檀、绒毛黄檀、中美洲黄檀、奥氏黄檀、微凹黄檀均为阴性，均不能被扩增。因此本发明所述引物、探针和方法能够检测出阔叶黄檀，检测特异性好。
另外，将本实施例实验组和对照组的完整木材用传统的鉴定方法作进一步确认实验。结果表明，利用本发明所述分子鉴定方法确认的结果准确。由此可见，本发明具有很好的特异性。
实施例5：荧光PCR扩增的灵敏度
以同一根干燥的阔叶黄檀木材为材料，烘干至恒重，然后分别以0.1g、0.5g、1.0g和2.0g取样，利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。
图3所示，随着样品量的增加，对应qPCR的Ct值成比例下降，样品取样量与结果对应性强。实验结果表明，利用本发明所述的引物和探针，可以检测出样品量仅为0.1g的DNA信息。
由于本发明所述分子鉴定方法只需要极少量的木材样本就可完成检测，它并不依赖于木材的形态结构是否完整。因此本发明不仅可以对形态完整的阔叶黄檀进行鉴定，还可以对看不出原始形态的阔叶黄檀加工成品或半成品等进行鉴定。例如能对以阔叶黄檀为原材料的红木家具成品进行客观地鉴定，且对家具本身并没有造成破坏，家具依然保持原先的设计状态。
实施例6：检测经不同处理方式得到的木材样本
选用的木材样本分别来自：利用25℃和65℃三种温度干燥的木材；潮湿木材，即受潮的木材；分别采用挤压、熏蒸或气干处理的木材。利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图4所示的实验结果表明本发明所述的引物和探针，可以准确地分析出利用不同方法处理后的阔叶黄檀的DNA情况。其中图中的A、B、C、D分别表示A：干燥木材；B：潮湿木材；C：挤压木材；D：熏蒸木材；E：气干木材。
实施例7：木材不同部位的鉴定实验
分别取阔叶黄檀的边材与心材，按实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图5所示实验结果表明：本发明所述方法可以以不同部位的材质作为检测的样品，且检测结果准确。因此，无论以阔叶黄檀的哪个部位作为红木制品的原材料，本发明所述方法都适用。
进一步说明：边材1（Sapwood 1）外围部分，边材2（Sapwood 2）表示边材内部靠近心材的部分；心材1（Heart wood 1）和心材2（Heart wood 2）表示心材的最中心部分。边材：树木次生木质部的外围活层，位于树干的外围部分，细胞中水分较心材多，色浅，较软，无心材中常见深色沉积物质。心材：多年生的树木其近中心部分的木材，不含生活细胞，其贮藏物质已不存在或转化为心材物质，色深，材质较硬且致密，含水量少，无输导输液与贮藏营养物质的功能，主要对整株植物起支持作用。商业上心材通常指树心部分有显著材色者。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 利用PCR技术鉴定红木中阔叶黄檀的方法、引物和探针
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtggattcag cgccatgac 19
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtcgcgcgc atgact 16
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgagcatct cctc 14
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgaaatcggt agacgctacg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttccattgag tctctgcacc t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaatcctga gccaaatcc 19

Claims (6)

1.用于红木中阔叶黄檀的PCR鉴定用的引物、探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：
KYHT Primer-F：5'-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3'
KYHT Primer-R：5'-GGTCGCGCGCATGACT-3'
KYHT Primer Probe：5'-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB-3'。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，还包括检测植物內源基因tRNALeu的引物和探针，所述序列分别为：
tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
tRNALeu Probe：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3。
3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的使用浓度比为：KYHT Primer-F:KYHT Primer-R:KYHT Primer Probe＝1:1:2。
4.阔叶黄檀的PCR鉴定方法，包括如下步骤：
(1)木材样本的预处理；
(2)提取经(1)处理后的木材样本中的DNA；
(3)利用引物KYHT Primer-F和KYHT Primer-R，以及探针KYHT Primer Probe对(2)中提取的DNA进行荧光PCR扩增；
(4)木材种类的确定；
其特征在于，所述引物和探针序列包括：
KYHT Primer-F：5'-GTGGATTCAGCGCCATGAC-3'
KYHT Primer-R：5'-GGTCGCGCGCATGACT-3'
KYHT Primer Probe：5'-VIC-TTGAGCATCTCCTC-MGB-3'。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃，2min；95℃15s，55℃ 34s，共40个循环。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括检测植物內源基因tRNALeu的引物和探针，所述序列分别为：
tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
tRNALeu Probe：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3。
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降香黄檀木材DNA 提取及rDNA-ITS 序列条形码分子鉴定;余敏 等;《林产化学与工业》;20141031;第34卷(第5期);第103-108页 *

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