CN106929575B - 一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型dna条形码及其鉴别方法和应用 - Google Patents

一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型dna条形码及其鉴别方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码，所述微型DNA条形码为DNA序列ndhF‑rpl32或该序列的一部分。本发明还公开了一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的分子方法及其应用。本发明提供的鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码及其方法可实现檀香紫檀和染料紫檀的准确鉴别，解决了依靠传统木材解剖手段无法鉴别二者的难题，为海关、质量检验检疫等木材贸易监管执法部门和木材经营贸易人员提供一种高效可靠的檀香紫檀和染料紫檀鉴别方法，具有很强的应用价值。

Description

一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码及其鉴别方 法和应用
技术领域
本发明属于木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体涉及一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码及其鉴别方法和应用。
背景技术
檀香紫檀(Pterocarpus santalinus L.f.)，隶豆科紫檀属，主产于印度，是一种名贵的红木树种。由于巨大的经济价值，檀香紫檀木材资源逐渐匮乏，被列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)附录II管制。近年来，木材市场出现一种与檀香紫檀构造极为相近的染料紫檀(Pterocarpus tinctorius Welw.)，俗称“血檀”或“赞比亚血檀”，主产于非洲。由于构造特征的相似性，不法商家经常将其用于作为檀香紫檀的混伪品，严重扰乱了木材贸易市场，同时也侵犯了消费者的合法权益。由于二者宏观及微观构造极为近似，通过传统的木材解剖技术很难实现鉴别区分。而近年来发展起来的DNA条形码技术却为木材“种”水平识别提供了可能。同时，针对檀香紫檀和染料紫檀物种的序列差异，开发特异专属性的DNA引物，为有效鉴别二者提供了科学途径。
木材进出口贸易中所需鉴定的样品大多是经过干燥处理或较长时间存储的干木材。受干燥处理及存储时间等因素影响，木材细胞中残存的DNA会进一步发生降解及片段化。有研究表明，仅能从存储数十年的干木材中获取长度小于200bp的DNA片段。然而，用于物种识别的植物DNA条形码片段长度通常大于650bp，这就给DNA条形码技术应用于已发生严重DNA降解的木材样本的识别带来了很大难度。
而微型DNA条形码是一段长度通常为100-250bp的可用于物种识别的短DNA片段，针对博物馆动物标本等DNA发生降解材料提出。与完整DNA条形码(～650bp)相比，微型DNA条形码具有更高的获取成功率，同时与完整DNA条形码物种识别能力也较为接近。因此，微型DNA条形码为DNA发生严重降解的干燥处理或长期存储木材的物种识别提供科学新途径。
总体来说，基于木材解剖学的传统识别技术难以实现木材“种”水平的识别，而新兴的微型DNA条形码技术逐步成为木材识别技术的研究热点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对传统木材识别技术无法准确鉴别檀香紫檀和染料紫檀，而提供一种基于质体基因间隔ndhF-rpl32微型DNA条形码序列差异实现二者准确区分的分子鉴别方法。
所以，本发明的第一目的是提供一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码。
本发明的第二目的是提供一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的分子方法。
本发明的第三目的是提供所述微型DNA条形码和分子方法在鉴别檀香紫檀和染料紫檀中的应用。
基于此，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码，所述微型DNA条形码为DNA序列ndhF-rpl32或该序列的一部分。
优选的，所述微型DNA条形码为DNA序列ndhF-rpl32的部分序列，如，檀香紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.1所示，染料紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.2所示。
进一步地，本发明提供了一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的分子方法，该方法是利用微型DNA条形码ndhF-rpl32序列差异，檀香紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.1所示，染料紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.2所示，并利用分子生物学的方法来鉴别檀香紫檀和染料紫檀。
具体地，所述方法包括以下步骤：
(1)将木材样品研磨处理成木粉；
(2)提取步骤(1)所得木粉样品的DNA；
(3)以步骤(2)提取得到的DNA为模板，用序列ndhF-rpl32正反引物进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行测序，并将测序产物分别与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2进行比对后鉴别檀香紫檀与染料紫檀。
优选的，步骤(1)中所述木粉研磨至200目及以上。
优选的，步骤(2)中所述DNA需进行纯化，DNA终浓度为1-200ng/μL。
优选的，步骤(3)中所述PCR扩增的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
优选的，步骤(3)中所述PCR扩增反应体系为0.5-3U DNA聚合酶、1.0-2.0mMMgCl2、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0-8.0的0.1-1.5mg/mL牛血清白蛋白和10-1000ng模板DNA；PCR反应条件为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.05-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.3-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。
优选的，步骤(4)的鉴别标准为若测序产物与SEQ ID No.1序列一致或相似度为99％及以上，则该样品为檀香紫檀；若测序序列与SEQ ID No.2序列一致或相似度为99％及以上，该样品为染料紫檀。
更进一步地，本发明提供了所述微型DNA条形码，或鉴别檀香紫檀和染料紫檀的分子方法在鉴别檀香紫檀和染料紫檀中的应用。
本发明具有如下优点：
1、本发明基于一种微型DNA条形码序列差异，可以实现檀香紫檀与染料紫檀的准确鉴别，突破了传统木材识别技术的局限；
2、本发明设计的鉴别引物特异性好，扩增及测序成功率高；
3、本发明优选的DNA条形码对于檀香紫檀与染料紫檀树种存在明显的差异位点，具有较高的鉴别能力；
4、本发明适用范围广，适用于气干、干燥窑处理、标本、考古及其他长期存储方式等各种加工处理条件下的檀香紫檀和染料紫檀木材的鉴别；
5、本发明取样量极少，且不受取材位置(边材、心边材过渡区及心材)、样品原始状态(木块、木粉)因素影响；
6、本发明实验条件依赖少，一般PCR实验室均可满足；
7、本发明为木材识别技术提供了一种新的途径和思路。
总之，本发明提供的鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码及其方法可实现檀香紫檀和染料紫檀的准确鉴别，解决了依靠传统木材解剖手段无法鉴别二者的难题，为海关、质量检验检疫等木材贸易监管执法部门和木材经营贸易人员提供一种高效可靠的檀香紫檀和染料紫檀鉴别方法，具有很强的应用价值。
附图说明
图1檀香紫檀与染料紫檀ndhF-rpl32序列比对；
图2三种DNA序列的PCR扩增成功率及测序成功率对比。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的发明范围。该技术领域的技术工程师可根据上述发明的内容作出一些非本质性的改进和调整。
实施例1：檀香紫檀与染料紫檀特异性引物设计
(1)下载GenBank中檀香紫檀和染料紫檀的质体DNA序列rbcL、matK和ndhF-rpl32(表1)；
表1GenBank中檀香紫檀和染料紫檀三种DNA片段登录号
(2)应用Clustal X 1.81软件比对序列，并查找确定檀香紫檀和染料紫檀二者各片段序列的差异位点；
(3)应用Primer Premier 5.0软件对rbcL、matK和ndhF-rpl32三个条形码设计引物。所述扩增引物如表2所示。
表2三个条形码引物信息
实施例2：檀香紫檀与染料紫檀标准样品的微型DNA条形码序列选优与确定
(1)标准样品采集。
檀香紫檀标准样品计9号，其中从中国林科院木材标本馆选取檀香紫檀树种4号木材标本CAFW23674，CAFW23675，CAFW23676，CAFW22653；从中国海南省乐东县尖峰岭采集进行植物学鉴定的檀香紫檀叶片5号，分别为TXL01，TXL02，TXL03，TXL04，TXL05。染料紫檀标准样品3号，为RLW01，RLW02，RLL01，分别采自刚果民主共和国的木材边材、木材心材及叶片。
(2)样品制备。
选取木材样品，利用70％酒精消毒后的解剖刀片将木材试样外表面切除，以避免外源污染；将木材试样切成若干木屑，并置于低温冷冻研磨仪中低温预冷3min，研磨3min，运行频率10cps；研磨结束后，过200目筛网，将细木粉分装到若干50mL的微量离心管中，每管木粉量500mg，并置于-80℃低温冰箱保存备用。
针对叶片样品，在液氮环境中人工研磨。研磨结束后，分装置于-80℃低温冰箱保存备用。
(3)DNA提取。
在消毒处理的超净工作环境中，对木材(或叶片)进行DNA提取。
(4)PCR扩增反应与测序。
引物对为实施例1中的三个DNA序列引物对，以DNA提取物为模板进行PCR扩增，反应体系为30μL：其中Premix Ex Taq 15μL(包括l.25U Ex Taq DNA聚合酶，2mM MgCl2，200μM单一dNTP)，0.2μM单一引物和约20ng模板DNA。所有PCR反应均在PCR扩增仪上进行。反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，50℃(rbcL)、52℃(matK)及47℃(ndhF-rpl32)退火30s，72℃延伸20s，循环40次；72℃终延伸7min，即可获得高效扩增的DNA目的片段。将扩增产物纯化后进行双向直接测序。
(5)序列比对分析。
应用ContigExpress软件对测序结果进行测序质量评估，去除两端低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接及校对。通过序列比对发现，檀香紫檀和染料紫檀2个树种中长度485bp的rbcL片段之间仅存在1个差异位点，片段长度为273bp的matK存在2个差异位点，而片段长度为177bp的微型条形码ndhF-rpl32(檀香紫檀如SEQ ID NO.1所示，染料紫檀如SEQ ID NO.2所示)存在8个差异位点(包含6个连续插入缺失和2个碱基突变(图1)。表明微型条形码ndhF-rpl32具有更高的鉴别能力。
(6)微型DNA条形码优选与确定。
对比rbcL、matK和ndhF-rpl32三个条形码的扩增成功率、测序成功率。微型DNA条形码ndhF-rpl32相比其他普通条形码rbcL和matK具有更高的扩增成功率和测序成功率(图2)；基于K2P距离(Kimura-2-parameter distance)比对种间种内差异表明，檀香紫檀与染料紫檀种间遗传距离(0.018)明显大于种内遗传距离(0)，得出微型条形码ndhF-rpl32存在条形码间隔(barcoding gap)，即种间差异大于种内差异，满足理想DNA条形码的要求。
综上，通过三种质体DNA条形码的优选比对，发明人认定了ndhF-rpl32作为鉴别檀香紫檀和染料紫檀的条形码。
实施例3：染料紫檀新鲜木材样品DNA鉴别
(1)染料紫檀新鲜木材样品采集。
于2015年4月16日从刚果民主共和国加丹加省(S10°E28°)采集染料紫檀新鲜木材样品RLW03。木材解剖学观察表明，该木材样品具有《红木》国家标准GB/T 18107—2000中紫檀木类木材特征，然而木材解剖特征不能区别该样品为檀香紫檀还是染料紫檀。
(2)制备木粉并研磨至200目及以上。
(3)木材DNA提取。
在消毒处理的超净工作环境中，对木材进行DNA提取。所述DNA还需进行纯化，DNA终浓度为1-200ng/μL。
(4)PCR扩增反应与测序。
木材DNA提取物为模板进行PCR扩增，扩增引物如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。反应体系为30μL：其中Premix Ex Taq 15μL(包括l.25U Ex Taq DNA聚合酶，2mMMgCl2，200μM单一dNTP)，0.2μM单一引物和约20ng模板DNA。所有PCR反应均在PCR扩增仪上进行。反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，47℃退火30s，72℃延伸20s，循环40次；72℃终延伸7min，即可获得高效扩增的DNA目的片段。将扩增产物纯化后进行双向直接测序。
(5)序列比对分析与树种鉴别。测序序列结果发现，与序列SEQ ID No.2相似度高于99％，确定为染料紫檀。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国林科院木材工业研究所
<120> 一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码及其鉴别方法和应用
<130> 011701594
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 171
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggaatttgt ttattggacc attttaactt tgtactttgc aatattagaa gtattgtgca 60
gagattcaga ataatagaaa attctattta tatgttcact cttttttatt aactgaagcc 120
tttacaaaag agataaaacc gacgaataag aaacaaaact cattacgaat c 171
<210> 2
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggaatttgt ttattggacc atttttactt tgtactttgc aatattagaa gtattgtgca 60
gagattcaga ataatagaaa attctattta tatgttcact cttttttatt attattaact 120
gaagacttta caaaagagat aaaaccgacg aataagaaac aaaactcatt acgaatc 177
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgccgaatct tctactgg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ataagaaacg gtccctcc 18
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttcgtctac cttatccttc ttca 24
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctagcatttg actccgtacc ac 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gattcgtaat gagttttgtt tc 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggaatttgt ttattggacc 20

Claims (9)

1.一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的微型DNA条形码，其特征在于，所述微型DNA条形码为DNA序列ndhF-rpl32的部分序列，檀香紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.1所示，染料紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.2所示。
2.一种鉴别檀香紫檀和染料紫檀的分子方法，其特征在于：该方法是利用微型DNA条形码ndhF-rpl32序列差异，檀香紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.1所示，染料紫檀的微型DNA条形码如SEQ ID No.2所示，并利用分子生物学的方法来鉴别檀香紫檀和染料紫檀。
3.如权利要求2所述的分子方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将木材样品研磨处理成木粉；
(2)提取步骤(1)所得木粉样品的DNA；
(3)以步骤(2)提取得到的DNA为模板，用PCR扩增引物扩增ndhF-rpl32序列中的作为微型DNA条形码用于鉴定的序列作为靶标；
(4)将步骤(3)得到的PCR扩增产物进行测序，并将测序产物分别与SEQ ID No.1和SEQID No.2进行比对后鉴别檀香紫檀与染料紫檀。
4.如权利要求3所述的分子方法，其特征在于，步骤(1)中所述木粉研磨至200目及以上。
5.如权利要求3所述的分子方法，其特征在于，步骤(2)中所述DNA需进行纯化，DNA终浓度为1-200ng/μL。
6.如权利要求3所述的分子方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增的引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
7.如权利要求3所述的分子方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR扩增反应体系为0.5-3U DNA聚合酶、1.0-2.0mM MgCl2、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0-8.0的0.1-1.5mg/mL牛血清白蛋白和10-1000ng模板DNA；PCR反应条件为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.05-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.3-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。
8.如权利要求3所述的分子方法，其特征在于，步骤(4)的鉴别标准为若测序产物与SEQID No.1序列一致或相似度为99％及以上，则该样品为檀香紫檀；若测序序列与SEQ IDNo.2序列一致或相似度为99％及以上，该样品为染料紫檀。
9.权利要求1所述微型DNA条形码，或权利要求2～8任意一项所述鉴别檀香紫檀和染料紫檀的分子方法在鉴别檀香紫檀和染料紫檀中的应用。
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