CN105039600A - 一种检测辣椒黄脉病毒的rt-lamp引物及试剂盒 - Google Patents

一种检测辣椒黄脉病毒的rt-lamp引物及试剂盒 Download PDF

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何自福
佘小漫
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Abstract

本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物及试剂盒。本发明依据辣椒黄脉病毒CP基因序列设计一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物，包括外侧引物对F3和B3、内侧引物对FIP和BIP；辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒包含如下组分：RT-LAMP引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料。其检测方法是以待测样品总RNA为模板，应用RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒在65℃下进行RT-LAMP扩增反应60min，扩增后80℃再反应5min，进而鉴定待测样品是否感染辣椒黄脉病毒。本发明操作简单、快速准确、特异性强、不需要专用仪器设备等特点。

Description

一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物及试剂盒
技术领域
本发明属于植物病毒检测领域，具体涉及一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物及试剂盒。
背景技术
辣椒黄脉病毒(Pepperveinyellowvirus，PeVYV)属黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)成员，由蚜虫持久方式传播，可以嫁接传播。该病毒在欧洲的西班牙、荷兰，非洲的马里、苏丹，亚洲的印度、印度尼西亚、菲律宾、泰国、日本、中国台湾以及北美洲的美国等地均有分布。2013年以来，先后在我国的湖南、山东和广东等3省份也发现辣椒黄脉病毒，田间症状主要表现为叶脉黄化、叶片卷曲、节间缩短等，严重影响到辣椒的产量和品质。目前，检测辣椒黄脉病毒(Pepperveinyellowvirus，PeVYV)的方法主要是反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法。RT-PCR检测方法主要包括：根据已知病毒保守序列设计RT-PCR引物，提取病样中的总RNA，以其中的病毒基因组RNA作为模板，在PCR管中加入逆转录酶、模板、RT-PCR反应成分，PCR仪上进行反应及琼脂糖凝胶电泳检测等步骤。该方法特异、较灵敏，但需要购买专业仪器PCR仪，且较为费时。目前利用RT-PCR检测病毒需要6小时左右。
环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification，LAMP)技术，是利用能识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BstDNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。LAMP呈瀑布式扩增，其扩增效率非常高，反应非常灵敏；利用识别靶序列上的6～8个特异性位点，其特异性很高；反应在60～65℃恒温下进行，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；整个检测反应只需1.0～1.5h，检测周期短。因此，该方法具有检测速度快、灵敏度高及不需要昂贵的专业仪器等优点。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述RT-LAMP引物的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒。
本发明的第三个目的在于提供一种利用上述RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒检测辣椒黄脉病毒的方法，该方法快速、灵敏、简便。
本发明的第四个目的在于提供上述RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒的应用。
一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物，包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：
F3:GATCACGTAACACCCGCC；
B3:GCTCTCTGATAGAGACGGCC；
FIP:GCCTCCATTTCGTCGTCTTCGA-GTTCGCCCTGTCGTTGTG；
BIP:TTGGAGGAAGGTCGAGCAACAG-AAGGTGACAGATCCTGAGGA；
一种辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，包含上述RT-LAMP引物；
所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，优选包含如下组分：上述RT-LAMP引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料；
所述的RT-LAMP反应液优选包含如下组分：Tris-HCl(pH8.8)40mM；KCl20mM；MgSO416mM；(NH4)2SO420mM；Tween200.2％(w/w)；Betaine1.6M；dNTPs每种2.8mM；
所述的酶溶液优选为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液；
所述的核酸荧光染料优选为荧光目视检测试剂(容研生物科技(中国)有限公司产品)；
一种检测辣椒黄脉病毒的方法，包含如下步骤：
以待测样品的RNA为模板，利用RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳性反应；若反应液显橙色，则判断为阴性反应；
所述的RT-LAMP扩增反应的反应体系优选为25μL反应体系，包含如下组分：RT-LAMP反应液12.5μL，酶溶液1.0μL，40pmol/μL引物FIP1.0μL，40pmol/μL引物BIP1.0μL，10pmol/μL引物F30.5μL，10pmol/μL引物B30.5μL，核酸荧光染料1.0μL，RNA模板1.0μL，及去离子水6.5μL；
所述的RT-LAMP扩增反应的条件为：在65℃恒温条件下，扩增反应60min后，加热至80℃，反应5min使酶失活；
所述的RT-LAMP引物或RT-LAMP检测试剂盒在植物病毒检测领域中的应用；
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)简便易操作：本发明的方法只需要恒温水浴锅或者稳定热源的设备就能进行实验，且实验结果通过肉眼观察反应液的颜色就可以判断，不需要专业的仪器，非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强，克服了常规PCR专业性强及需要专用仪器设备等局限性，从而达到实际生产中对植物病害鉴定快速、准确的要求。
(2)快速高效：本发明的检测方法鉴定周期为1小时，而常规的RT-PCR检测鉴定方法需要6小时左右，这样大大提高了检测效率。
(3)特异性强：本发明是通过2对引物识别靶序列上6个特异区域，而常规PCR是通过识别靶序列上2个特异区域，因此大大提高了特异性，减少假阳性的概率。
(4)灵敏度高：以辣椒病样总RNA进行10倍系列稀释后用作模板，分别进行RT-LAMP反应和普通RT-PCR反应。普通RT-PCR可以在10-4倍稀释模板中检测到，而RT-LAMP可以在10-5倍稀释模板中检测到，表明RT-LAMP检测方法比普通RT-LAMP检测灵敏度高10倍。
附图说明
图1是RT-LAMP最佳反应温度扩增曲线结果分析图。
图2是RT-LAMP各温度处理反应液颜色变化结果分析图。
图3是RT-LAMP灵敏度实验颜色反应结果分析图。
图4是RT-LAMP灵敏度实验电泳结果分析图。
图5是RT-PCR灵敏度电泳结果分析图。
图6是RT-LAMP检测田间辣椒病样检测结果分析图；其中，1～6：疑似辣椒病样，7：阳性对照；8：阴性对照。
图7是RT-PCR检测田间辣椒病样的电泳结果分析图；其中，M：2000bpmarker，1～6：疑似辣椒病样，7：阳性对照；8：阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1引物的设计
根据GenBank中已登录的辣椒黄脉病毒外壳蛋白(CP)基因序列(GenBank序列登录号：AB594828.1)，设计外侧引物对F3和B3以及内侧引物对FIP和BIP，设计完成后将引物在NCBI数据库中Primer-Blast模块下进行比对验证，最终选取以下RT-LAMP引物组：
F3:GATCACGTAACACCCGCC；
B3:GCTCTCTGATAGAGACGGCC；
FIP:GCCTCCATTTCGTCGTCTTCGA-GTTCGCCCTGTCGTTGTG；
BIP:TTGGAGGAAGGTCGAGCAACAG-AAGGTGACAGATCCTGAGGA。
实施例2RT-LAMP体系的建立及优化
(一)实验材料
应用已知辣椒黄脉病毒侵染引起的辣椒病叶组织以及已知健康的辣椒叶组织为材料。
辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，包含如下组分：实施例1设计合成的RT-LAMP引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料；
RT-LAMP反应液(2×反应缓冲液，荣研生物科技(中国)有限公司)包含如下组分：Tris-HCl(pH8.8)40mM；KCl20mM；MgSO416mM；(NH4)2SO420mM；Tween200.2％(w/w)；Betaine1.6M；dNTPs每种2.8mM；
酶溶液(荣研生物科技(中国)有限公司)为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液；
核酸荧光染料(荣研生物科技(中国)有限公司)为荧光目视检测试剂；
(二)实验方法
(1)检测病样总RNA提取：称取0.1g待检的辣椒叶片至研钵中，在液氮下研成极细粉末，将粉末迅速转移至预冷的1.5mL离心管中，加lmLTrizol后于室温下静置10min，使其充分裂解；12000r/min，4℃离心5min，弃沉淀，加200μL氯仿，振荡混匀后于室温放置15min；12000r/min，4℃离心15min，吸取上层水相移至另一离心管中，加0.5mL异丙醇，混匀后于室温放置15min；12000r/min，4℃离心15min，弃上清，RNA沉于管底；加lmL体积分数为75％的乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8000r/min，4℃离心5min，弃上清，室温晾干或真空干燥5～10min，最后用40μLRNase-freeddH2O溶解RNA样品，于-80℃保存，即为待检模板RNA。
(2)RT-LAMP反应体系(25μL)：2×反应缓冲液(荣研生物科技(中国)有限公司)12.5μL，酶溶液(荣研生物科技(中国)有限公司)1.0μL，40pmol/μL引物FIP1.0μL，40pmol/μL引物BIP1.0μL，10pmol/μL引物F30.5μL，10pmol/μL引物B30.5μL，荧光目视检测试剂(荣研生物科技(中国)有限公司)1.0μL，RNA模板1.0μL，及去离子水6.5μL。
RT-LAMP扩增反应的条件为：反应温度分别设为59℃、61℃、63℃或65℃，反应时间为60min。扩增反应在实时浊度仪上进行，根据60min内出现扩增曲线的最短时间确定最佳反应温度，并肉眼观察反应液颜色变化情况。
(3)结果鉴别：扩增进行时，如果有产物出现，反应液会产生一定的浊度；LA-320C实时浊度仪(荣研生物科技(中国)有限公司)会将浊度信号收集，以扩增曲线的形式反映。反应结束后，肉眼观察各处理反应液的颜色变化，并与浊度仪曲线进行比对。反应液呈绿色，则判定为阳性反应；若呈橙色，则判定为阴性反应。
(三)实验结果与分析
以感染辣椒黄脉病毒辣椒病叶组织的总RNA为模板，进行RT-LAMP反应，实时浊度仪输出的扩增时间曲线结果如图1。由图中曲线可以看出，RT-LAMP反应在59℃、61℃、63℃和65℃的反应温度下，分别在约42、34、29和27min时扩增曲线开始上升。反应结束后，肉眼观察到各温度处理反应液均呈绿色，而空白对照呈橙色(图2)。根据现场检测时间尽可能短的要求，确定65℃为最佳反应温度。
实施例3对已知病样检测的灵敏度实验
(一)实验材料
应用已知辣椒黄脉病毒侵染引起的辣椒病样叶片组织以及已知健康的辣椒叶片组织为材料。
辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒同实施例2。
(二)实验方法
将所提取的辣椒病叶片组织的总RNA，按1.0×10-1～10-8进行浓度梯度稀释后用作模板，分别进行RT-LAMP和普通RT-PCR检测，比较二者的检测灵敏度。
(三)实验步骤
(1)检测病样品总RNA提取：称取0.1g待检的辣椒叶片至研钵中，在液氮下研成极细粉末，将粉末迅速转移至预冷的1.5mL离心管中，加lmLTrizol后于室温下静置10min，使其充分裂解；12000r/min，4℃离心5min，弃沉淀，加200μL氯仿，振荡混匀后于室温放置15min；12000r/min，4℃离心15min，吸取上层水相移至另一离心管中，加0.5mL异丙醇，混匀后于室温放置15min；12000r/min，4℃离心15min，弃上清，RNA沉于管底；加lmL体积分数为75％的乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8000r/min，4℃离心5min，弃上清，室温晾干或真空干燥5～10min，最后用40μLRNase-freeddH2O溶解RNA样品，于-80℃保存，即为待检模板RNA。
(2)RT-LAMP反应体系(25μL)：2×反应缓冲液(荣研生物科技(中国)有限公司)12.5μL，酶溶液(荣研生物科技(中国)有限公司)1.0μL，40pmol/μL引物FIP1.0μL，40pmol/μL引物BIP1.0μL，10pmol/μL引物F30.5μL，10pmol/μL引物B30.5μL，荧光目视检测试剂(荣研生物科技(中国)有限公司)1.0μL，RNA模板1.0μL，及去离子水6.5μL。
RT-LAMP扩增反应的条件为：在65℃恒温条件下，扩增反应60min后，加热至80℃，反应5min使酶失活。
(3)结果判定
肉眼观察：反应结束后，反应液显绿色，则判断为阳性反应；若显橙色，则判断为阴性反应。
电泳检测：反应结束后，取2μL扩增产物在质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶上100～125V恒压电泳30min。
(4)RT-PCR检测：采用对应量的RNA模板，根据GenBank中已登录的辣椒黄脉病毒基因序列(GenBank序列登录号：AB594828.1)设计扩增大小为562bp目的片段的特异引物对P-F(5’-GTAGTTCAAATTCAAGGATCCG-3’)和P-R(5’-GCTGAGATCTTAAGGTAGACTAG-3’)，进行RT-PCR反应。
RT-PCR反应扩增体系参照TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒说明进行配置，反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性4min，94℃变性30min、52℃退火30sec、72℃延伸1min，35个循环，72℃最终延伸10min，取8μL扩增产物在质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶上100～125V恒压电泳30min，在紫外检测仪下观察并记录结果。
(四)实验结果与分析
将感染辣椒黄脉病毒的辣椒病叶片组织总RNA进行10倍系列稀释后用作模板，分别进行RT-LAMP反应和普通RT-PCR反应。对于RT-LAMP方法，在模板稀释倍数为10-4时，反应液呈明显绿色(阳性反应)，电泳时扩增的目的条带清晰；当模板稀释倍数为10-5时，反应液也呈现绿色，电泳时仍可见扩增的条带；但模板稀释倍数为10-6时，反应液呈现橙色，电泳无目的条带(阴性反应)(图3，4)。对于普通的RT-PCR方法，在模板稀释倍数为10-4时，扩增的目的条带已经非常弱；当模板稀释倍数为10-5时，RT-PCR已经检测不到病毒(图5)。因此，本发明的RT-LAMP检测方法比普通RT-PCR检测方法灵敏度高10倍。
实施例4对未知辣椒病样品的检测与鉴定
(一)实验材料
从广东省各辣椒产区采集疑似辣椒黄脉病毒侵染引起的辣椒病样以及已知健康的辣椒样为材料。
辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒同实施例2。
(二)实验方法
将所提取的疑似辣椒黄脉病毒引起的辣椒叶片组织的总RNA作模板，进行RT-LAMP检测与鉴定。
(三)实验步骤
(1)检测病样品总RNA提取：称取0.1g待检的辣椒叶片至研钵中，在液氮下研成极细粉末，将粉末迅速转移至预冷的1.5mL离心管中，加lmLTrizol后于室温下静置10min，使其充分裂解；12000r/min，4℃离心5min，弃沉淀，加200μL氯仿，振荡混匀后于室温放置15min；12000r/min，4℃离心15min，吸取上层水相移至另一离心管中，加0.5mL异丙醇，混匀后于室温放置15min；12000r/min，4℃离心15min，弃上清，RNA沉于管底；加lmL体积分数为75％的乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；8000r/min，4℃离心5min，弃上清，室温晾干或真空干燥5～10min，最后用40μLRNase-freeddH2O溶解RNA样品，于-80℃保存，即为待检模板RNA。
(2)RT-LAMP反应体系(25μL)：2×反应缓冲液(荣研生物科技(中国)有限公司)12.5μL，酶溶液(荣研生物科技(中国)有限公司)1.0μL，40pmol/μL引物FIP1.0μL，40pmol/μL引物BIP1.0μL，10pmol/μL引物F30.5μL，10pmol/μL引物B30.5μL，荧光目视检测试剂(荣研生物科技(中国)有限公司)1.0μL，RNA模板1.0μL，及去离子水6.5μL。
RT-LAMP扩增反应的条件为：在65℃恒温条件下，扩增反应60min后，加热至80℃，反应5min使酶失活。
(3)结果判定
肉眼观察：反应结束后，若反应液显绿色，则判定为阳性反应；若显橙色，则判定为阴性反应。
(4)RT-PCR验证：采用对应量的RNA模板，根据GenBank中已登录的辣椒黄脉病毒基因序列(GenBank序列登录号：AB594828.1)设计扩增大小为562bp目的片段的特异引物对P-F(5’-GTAGTTCAAATTCAAGGATCCG-3’)和P-R(5’-GCTGAGATCTTAAGGTAGACTAG-3’)，进行RT-PCR反应。
RT-PCR反应扩增体系参照TAKARA公司的一步法RT-PCR试剂盒说明进行配置，反应条件为：50℃反转录30min；94℃预变性4min，94℃变性30min、52℃退火30sec、72℃延伸1min，35个循环，72℃最终延伸10min，取8μL扩增产物在质量分数为1.5％的琼脂糖凝胶上100～125V恒压电泳30min，在紫外检测仪下观察并记录结果。
(四)实验结果与分析
采用RT-LAMP方法，对来自广东各地的7份疑似病样进行检测，结果显示(图6)，疑似病样品1号、2号、3号、5号为阳性，4号和6号为阴性。进一步应用普通RT-PCR加以验证，其检测结果(图7)与RT-LAMP结果一致，二者的符合率为100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物，其特征在于包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：
F3:GATCACGTAACACCCGCC；
B3:GCTCTCTGATAGAGACGGCC；
FIP:GCCTCCATTTCGTCGTCTTCGA-GTTCGCCCTGTCGTTGTG；
BIP:TTGGAGGAAGGTCGAGCAACAG-AAGGTGACAGATCCTGAGGA。
2.一种辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的RT-LAMP引物。
3.根据权利要求2所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：
所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，包含如下组分：权利要求1所述的RT-LAMP引物；RT-LAMP反应液；酶溶液；核酸荧光染料。
4.根据权利要求3所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：
所述的RT-LAMP反应液包含如下组分：Tris-HCl40mM；KCl20mM；MgSO416mM；(NH4)2SO420mM；Tween200.2％w/w；Betaine1.6M；dNTPs每种2.8mM。
5.根据权利要求3所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：
所述的酶溶液为BstDNA聚合酶和AMV逆转录酶的混合溶液。
6.根据权利要求3所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于：
所述的核酸荧光染料为荧光目视检测试剂。
7.一种检测辣椒黄脉病毒的方法，其特征在于包含如下步骤：
以待测样品的RNA为模板，利用权利要求1所述的RT-LAMP引物或权利要求2～6任一项所述的RT-LAMP检测试剂盒进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断为阳性反应；若反应液显橙色，则判断为阴性反应。
8.根据权利要求7所述的检测辣椒黄脉病毒的方法，其特征在于：
所述的RT-LAMP扩增反应的反应体系为25μL反应体系，包含如下组分：RT-LAMP反应液12.5μL，酶溶液1.0μL，40pmol/μL引物FIP1.0μL，40pmol/μL引物BIP1.0μL，10pmol/μL引物F30.5μL，10pmol/μL引物B30.5μL，核酸荧光染料1.0μL，RNA模板1.0μL，及去离子水6.5μL。
9.根据权利要求7所述的检测辣椒黄脉病毒的方法，其特征在于：
所述的RT-LAMP扩增反应的条件为：在65℃恒温条件下，扩增反应60min后，加热至80℃，反应5min。
10.权利要求1所述的检测辣椒黄脉病毒的RT-LAMP引物或权利要求2～6任一项所述的辣椒黄脉病毒RT-LAMP检测试剂盒在植物病毒检测领域中的应用。
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