CN105274258B - 用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用 - Google Patents

用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用，其中引物组合物包括外引物和内引物，外引物包括外引物F3和外引物B3，外引物F3的DNA序列为SEQ ID NO.1所述的DNA序列，外引物B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所述的DNA序列；内引物包括内引物FIP和内引物BIP，内引物FIP的DNA序列为SEQ ID NO.3所述的DNA序列，内引物BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所述的DNA序列。该引物组合物和由其组成的试剂盒可应用于辣椒斑驳病毒的快速诊断和鉴别，具有检测灵敏度高、特异性好、操作简便快捷等优势。

Description

用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的 试剂盒及试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及农业科学技术领域，尤其涉及一种用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。
背景技术
辣椒斑驳病毒（Pepper Mottle Virus，PepMoV）是辣椒上一种危害严重的病毒病，PepMoV是一种（+）单链RNA病毒，是马铃薯Y病毒属（Potyvirus），马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的确定种。该病毒通过蚜虫以非持久性传播，主要侵染包括辣椒、西红柿等重要茄科作物。PepMoV的田间症状主要表现为植株矮缩，叶片花叶、斑点、萎缩，果实畸形，造成减产，以及更为严重的是造成果实的商品性降低，从而带来巨大的经济损失。该病毒最先在美国报道，随后在韩国、墨西哥、日本等地相继有危害的报道，对当地的茄科作物的生产造成严重影响。2011年在我国台湾省报道有该病毒病的发生，而我国内陆尚无PepMoV发生危害的报道。2015年湖南省植物保护研究所从湖南和福建等省采集的辣椒上检测到该病毒，为进一步了解该病毒的分布情况及其危害范围，建立一套快速检测辣椒斑驳病毒的方法刻不容缓。
目前针对PepMoV的检测方法主要有电镜观察法，RT-PCR和qRT-PCR法，但这些方法都需要繁琐的操作和昂贵的仪器，同时检测过程需要长时间的扩增过程，以及繁琐的电泳紫外观察过程。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可特异性检测检测辣椒斑驳病毒的检测试剂盒，还提供了该检测试剂盒的应用方法，该应用方法可应用于辣椒斑驳病毒的快速诊断和鉴别，灵敏度高、特异性强，检测方法方便快捷。
为解决上述技术问题，提供了一种用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物，包括外引物和内引物，所述外引物包括外引物F3和外引物B3，所述外引物F3的DNA序列为SEQ IDNO.1所述的DNA序列，所述外引物B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所述的DNA序列；所述内引物包括内引物FIP和内引物BIP，所述内引物FIP的DNA序列为SEQ ID NO.3所述的DNA序列，所述内引物BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所述的DNA序列。
上述的引物组合物，优选的，所述外引物F3的浓度为5μM～10μM；进一步优选为10μM。所述外引物B3的浓度为5μM～10μM ；进一步优选为10μM。
上述的引物组合物，优选的，所述内引物FIP的浓度为20μM～40μM；进一步有选为40μM。所述内引物BIP的浓度为20μM～40μM；进一步有选为 40μM。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述引物组合物作为LAMP检测的引物检测辣椒斑驳病毒中的应用。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种试剂盒，优选的，所述试剂盒包括上述引物组合物，还包括DNA 聚合酶。进一步优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA 聚合酶。
上述的试剂盒，优选的，所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、外引物BIP、DNA聚合酶、cDNA的体积比为：0.5∶0.5∶1∶1∶1∶2。
上述的试剂盒，优选的，所述检测试剂盒还包括RM反应缓冲液和DEPC水。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的检测试剂盒在检测辣椒斑驳病毒中应用。
上述的检测试剂盒，优选的，所述应用方法为：
（1）提取待测样品的总RNA，并反转录为cDNA；
（2）以步骤（1）中的cDNA为模板，采用所述的检测试剂盒进行LAMP反应得到扩增产物；
（3）将所述步骤（2）中得到的扩增产物按照以下A、B中的一种或两种方法进行检测：
A：加入SYBR Green I显色；如果变成绿色，则证明待测样品中含有辣椒斑驳病毒，如果颜色为橙色，则证明待测样品中不含辣椒斑驳病毒；
B：取扩增产物于进行电泳检测，如果电泳结果显示梯状条带，表明待测样品中含有辣椒斑驳病毒，如果不显示梯状条带，则待测样品中不含有辣椒斑驳病毒。
上述的应用，优选的，所述步骤（2）中所述LAMP反应的温度为60℃～64℃。
上述的应用，优选的，所述步骤（2）中所述LAMP反应的反应时间为45 min～120min。
上述的应用，优选的，所述步骤（3）中所述电泳检测为0.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）本发明提供了一种可用于检测辣椒斑驳病毒的引物，该引物根据辣椒斑驳病毒的核苷酸序列，选择该序列中相对保守且特异区域4180～4378bp，利用LN832375上的对应区域通过在线引物设计软件primerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计引物。本发明的引物3’端或5’端稳定性高，及引物二聚体等参数优于其他引物。
（2）本发明提供了一种可用于检测辣椒斑驳病毒的检测试剂盒，可快速检测辣椒斑驳病毒，灵敏度高、特异性强，检测方法方便快捷。
（3）本发明提供了一种采用检测试剂盒检测辣椒斑驳病毒的应用方法，采用环介导等恒温核酸扩增技术（loop-mediated isothermal amplication，LAMP）进行检测，检测方法快速简便，灵敏度高。LAMP技术是近年来开发的一种新型的DNA扩增技术，该方法不需要如qRT-PCR的复杂操作和昂贵的实时定量PCR仪器，也不需要如RT-PCR长时间的扩增过程以及繁琐的电泳紫外观察过程。LAMP方法从采样到得出结果的全过程仅需1h，并且灵敏度远高于传统的检测方法；更重要的是，可用目测比色直接判断反应结果。LAMP技术在恒温下即可直接进行基因扩增反应，不需要长时间的温度循环；且扩增反应特异性高、效率高。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为采用荧光染料检测实施例2中的扩增产物中是否含有PepMoV的检测结果图。
图2为采用实施例2中RT-LAMP方法检测PepMoV的效果图，图中，1为0.147μg/μl；2为0.147×10-1μg/μl；3为0.147×10-2μg/μl；4为0.147×10-3μg/μl；5为0.147×10-4μg/μl；6为0.147×10-5μg/μl；7为0.147×10-6μg/ μl；8为0.147×10-7μg/μl；9为0.147×10-8μg/μlcDNA；10为阴性对照。
图3为采用对比例1中RT-PCR方法检测PepMoV的效果图，图中，1为0.147μg/μl；2为0.147×10-1μg/μl；3为0.147×10-2μg/μl；4为0.147×10-3μg/μl；5为0.147×10-4μg/μl；6为0.147×10-5μg/μl；7为0.147×10-6μg/ μl；8为0.147×10-7μg/μl；9为0.147×10-8μg/μlcDNA；10为阴性对照。
图4为不同反应温度条件对RT-LAMP反应效果的电泳图，图中M为标准分子量；1为60℃；2为61℃；3为62℃；4为63℃；5为64℃；6为65℃；7为66℃；8为阴性对照。
图5为不同反应时间条件对RT-LAMP反应效果的电泳图，图中M为标准分子量；1为30min；2为45min；3为60min；4为75min；5为90min；6为120min。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1
根据辣椒斑驳病毒的核苷酸序列，选择该序列中相对保守且特异区域4180～4378bp，利用LN832375上的对应区域通过在线引物设计软件primerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）设计引物，通过比对引物相应的3’端或5’端稳定性及引物二聚体等参数，最终选取一组最合适的引物，具体为外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP。
其中，外引物F3的DNA序列为SEQ ID NO.1所述的DNA序列，具体为：CTTCAATGGCATTTAGAAGCT。
外引物B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所述的DNA序列，具体为：CCGTATTGGATCATGTCACAA。
内引物FIP的DNA序列为SEQ ID NO.3所述的DNA序列，具体为：GTGAACTCCACCTCTCTGCC-ACACTAATTGTAAGGTTTTGAAGG。
内引物BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所述的DNA序列，具体为：ACACAATTCCCAGTGAAATTAGTGG-TTGCTACCTGTGCCTTGA。
实施例2：
一种检测试剂盒，包括：
外引物F3（浓度10μM）：0.5μl；
外引物B3（浓度10μM）：0.5μl；
内引物FIP（浓度40μM）：1μl；
内引物BIP（浓度40μM）：1μl；
2×RM反应缓冲液：12.5 μl；
Bst DNA 聚合酶：1μl。
补充DEPC水至：25μl。
一种本实施例中检测试剂盒的应用方法，具体包括以下步骤：
（1）提取植株总RNA：从福建、湖南等地采集病株，运用RT-PCR筛选出的辣椒斑驳病毒样品，参照TRIzol-A+ Reagents（TIANGEN）使用说明，提取辣椒斑驳病毒样品中的总RNA，参照Hiscript®ІІ 1st strand cDNA synthesis Kit（Vazyme）使用说明，使用Randomhexamers将总RNA反转录成cDNA。
（2）LAMP反应：
用酶标仪测定步骤（1）中得到的cDNA浓度为0.147 μg/μl；然后用DEPC水进行10倍比稀释，﹣20℃保存作为模板。取2μL上述模板，加入本实施例的检测试剂盒中，其中外引物F3（浓度10μM）：0.5μl；外引物B3（浓度10μM）：0.5μl；内引物FIP（浓度40μM）：1μl；内引物BIP（浓度40μM）：1μl；2×反应缓冲液（RM）：12.5 μl；Bst DNA 聚合酶：1μl，补充DEPC水至25μl得到检测体系。将检测体系在62℃的恒温条件下反应60min，然后在80℃反应5 min使反应终止得到扩增产物。
（3）检测：
取2.5 μL步骤（2）中得到的扩增产物、2 μL loading buffer、3 μL SYBR Green I（1∶5000）上样，在2%的琼脂糖凝胶上电泳。
同时采用无辣椒斑驳病毒cDNA的RT-LAMP反应体系，作为阴性对照，取琼脂糖凝胶电泳后的凝胶放入PCR管中，向PCR管中加入SYBR Green I（1:1000）2μl， 5 min后观察结果。结果参见图1，从图1中可知：含有辣椒斑驳病毒的PCR管中液体变为绿色，而不含辣椒斑驳病毒的PCR管中液体保持染料原有的橙色。
对比例1
一种采用RT-PCR检测植株中辣椒斑驳病毒的方法，具体包括以下步骤：
（1）提取植株总RNA，反转录成cDNA，同实施例1。
（2）PCR反应：用酶标仪测定步骤（1）中得到的cDNA浓度：0.147 μg/μl；然后用DEPC水进行10倍比稀释，﹣20℃保存作为模板。取2 μL上述模板，以F3和B3为引物进行PCR扩增（使用常规PCR反应体系）得到扩增产物。
（3）检测：取2.5 μL步骤（2）中得到的扩增产物、2 μL loading buffer、3 μL SYBRGreen I（1∶5000）上样，在2%的琼脂糖凝胶上电泳。
对比实施例2的RT-LAMP的检测方法与对比例1中RT-PCR的灵敏度。
图2为本发明实施例2的电泳结果图；图3为对比例1的电泳结果图，图2和图3中1为0.147μg/μl；2为0.147×10-1μg/μl；3为0.147×10-2μg/μl；4为0.147×10-3μg/μl；5为0.147×10-4μg/μl；6为0.147×10-5μg/μl；7为0.147×10-6μg/ μl；8为0.147×10-7μg/μl；9为0.147×10-8μg/μl cDNA；10为阴性对照。比较图2和图3可知：用RT-LAMP方法可以检测到浓度是0.147×10-3 μg/μL的PepMoV的cDNA，而RT-PCR只能检测到浓度是0.147×10-2 μg/μL的PepMoV的cDNA，所以RT-LAMP比RT-PCR灵敏性高出10倍。
实施例3：考察RT-LAMP反应过程中反应温度对检测效果的影响。
（1）提取植株总RNA，反转录成cDNA，同实施例1。
（2）LAMP反应：
用酶标仪测定步骤（1）中得到的cDNA浓度：0.147 μg/μl；然后用DEPC水进行10倍比稀释，﹣20℃保存作为模板。取2 μL上述模板，加入实施例1的检测试剂盒中得到检测体系。将检测体系平均分为7份，分别在60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃，66℃恒温条件下反应60min，然后在80℃反应5 min使反应终止得到扩增产物。
（3）检测：
取2.5 μL步骤（2）中得到的扩增产物、2 μL loading buffer、3 μL SYBR Green I（1∶5000）上样，在2%的琼脂糖凝胶上电泳。
图4为各温度下电泳检测结果，从图4中可知：在相同的反应体系条件下，在60℃、61℃、62℃、63℃、64℃恒温反应60 min后有阶梯状条带产生，60℃、61℃、62℃、63℃恒温反应60 min后的扩增产物的电泳条带亮度几乎一致，64℃恒温反应60 min后扩增产物的条带亮度有些减弱，而65℃、66℃恒温反应60 min及阴性对照无阶梯状扩增带，证明在RT-LAMP反应温度为60～64℃效果较优。
实施例4：考察RT-LAMP反应过程中反应时间对检测效果的影响。
（1）提取植株总RNA，反转录成cDNA，同实施例1。
（2）LAMP反应：
用酶标仪测定步骤（1）中得到的cDNA浓度：0.147 μg/μl；然后用DEPC水进行10倍比稀释，﹣20℃保存作为模板。取2μL上述模板，加入实施例1的检测试剂盒中得到检测体系。将检测体系平均分为6份，在60℃恒温条件下分别反应30 min、45 min、60 min、75 min、90min和120 min；然后在80℃反应5 min使反应终止得到扩增产物。
（3）检测：
取2.5 μL步骤（2）中得到的扩增产物、2 μL loading buffer、3 μL SYBR Green I（1∶5000）上样，在2%的琼脂糖凝胶上电泳。
图5为各反应时间下电泳检测结果，从图5中可知：当反应时间为45 min时开始有扩增产物，但量较少，当反应时间为60 min时，RT-LAMP扩增产物开始增多，此后随着反应时间的增加，扩增产物的量几乎不变。因此本发明确定的RT-LAMP的反应时间为45～120 min效果较优。
实施例5：辣椒斑驳病毒RT-LAMP反应的特异性试验
选择PepMoV、马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的马铃薯Y病毒（Potato Virus Y）, 辣椒环斑病毒（Chilli Ringspot Virus）, 辣椒脉斑驳病毒（Chilli Veinal Mottle Virus）样品，按照实施例1的方法进行RT-LAMP检测。
检测结果显示：采用本实施例1的检测试剂盒去扩增马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的马铃薯Y病毒（Potato Virus Y），辣椒环斑病毒（Chilli Ringspot Virus）， 辣椒脉斑驳病毒（Chilli Veinal Mottle Virus）辣椒病株cDNA时，没有扩增产物；而扩增携带PepMoV的辣椒病株cDNA时能够扩增出目的产物，表明本发明建立的RT-LAMP检测方法具有很好的特异性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
<110> 湖南省植物保护研究所
<120> 用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
<130> 无
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，作为RT-LAMP反应的外引物F3。
<400> 1
cttcaatggc atttagaagc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 根据实验要求而设计，作为RT-LAMP反应的外引物B3。
<400> 2
ccgtattgga tcatgtcaca a 21
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(44)
<223> 根据实验要求而设计，作为RT-LAMP反应的内引物FIP。
<400> 3
gtgaactcca cctctctgcc acactaattg taaggttttg aagg 44
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<223> 根据实验要求而设计，作为RT-LAMP反应的内引物BIP。
<400> 4
acacaattcc cagtgaaatt agtggttgct acctgtgcct tga 43

Claims (9)

1.一种用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物，其特征在于，包括外引物和内引物，所述外引物包括外引物F3和外引物B3，所述外引物F3的DNA序列为SEQ ID NO.1所示，所述外引物B3的DNA序列为SEQ ID NO.2所示；所述内引物包括内引物FIP和内引物BIP，所述内引物FIP的DNA序列为SEQ ID NO.3所示，所述内引物BIP的DNA序列为SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述外引物F3的浓度为5μM～10μM，所述外引物B3的浓度为5μM～10μM；所述内引物FIP的浓度为20μM～40μM，所述内引物BIP的浓度为20μM～40μM。
3.一种权利要求1或2所述的引物组合物在检测辣椒斑驳病毒中的应用。
4.一种用于检测辣椒斑驳病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合物，DNA 聚合酶。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、DNA聚合酶的体积比为：0.5∶0.5∶1∶1∶1。
6.一种权利要求4或5所述的试剂盒在检测辣椒斑驳病毒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其应用方法为：
（1）提取待测样品的总RNA，并反转录为cDNA；
（2）以步骤（1）中的cDNA为模板，采用所述的试剂盒进行LAMP反应得到扩增产物；
（3）将所述步骤（2）中得到的扩增产物按照以下A、B中的一种或两种方法进行检测：
A：加入SYBR Green I显色；如果变成绿色，则证明待测样品中含有辣椒斑驳病毒，如果颜色为橙色，则证明待测样品中不含辣椒斑驳病毒；
B：取扩增产物进行电泳检测，如果电泳结果显示梯状条带，表明待测样品中含有辣椒斑驳病毒，如果不显示梯状条带，则待测样品中不含有辣椒斑驳病毒。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中所述LAMP反应的温度为60℃～64℃；反应时间为45 min～120 min。
9.根据权利要求7或8中任一项所述的应用，其特征在于，所述步骤（3）中所述电泳检测为0.2%琼脂糖凝胶电泳检测。
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