CN111808994A - 一种用于检测香蕉条斑病毒gf分离物的rpa引物及检测方法 - Google Patents

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余乃通
刘志昕
李俊成
高圣风
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明公开了一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物及检测方法，涉及生物技术领域，本发明针对香蕉条斑病毒GF分离物中外壳蛋白基因的保守序列，设计出了特异性RPA引物、探针、试剂盒，能够对香蕉条斑病毒GF分离物进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针，试剂盒准确性高，检测灵敏度为0.1ng，而且操作简单、快速，为香蕉条斑病毒GF分离物中基因特异性检测提供了技术支撑，对香蕉病毒病防治及产品检验检疫具有科学指导意义，同时对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药环境污染也具有重要意义。

Description

一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种用于检测香蕉条斑病毒 GF分离物的RPA引物及检测方法。
背景技术
香蕉条斑病是香蕉重要病毒病害之一，病原为香蕉条斑病毒(Banana streakvirus,BSV)。BSV属于花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)的杆状DNA病毒属(Badnavirus)，基因组大小在7.5～8.0kb的环状双链DNA。BSV侵染香蕉后可以产生多种症状，典型症状是叶片出现断续的和/或连续的褪绿条斑及梭条斑，随着症状的发展，可逐渐成为坏死黑色条斑。根据第十次国际病毒分类委员会 (ICTV)报告，把BSV分成9个种，分别为香蕉条斑GF病毒(Banana streak GF virus,BSGFV)、香蕉条斑UA病毒(Banana streakUA virus,BSUAV)、香蕉条斑IM病毒(Banana streak IM virus,BSIMV)、香蕉条斑MY病毒(Banana streak MY virus,BSMYV)、香蕉条斑OL病毒(Banana streak OL virus,BSOLV)、香蕉条斑UI病毒(Banana streak UI virus,BSUIV)、香蕉条斑UL病毒(Banana streak ULvirus,BSULV)、香蕉条斑UM病毒(Banana streak UM virus,BSUML)和香蕉条斑VN病毒(Banana streak VN virus,BSVNV)。
目前，针对香蕉条斑病的检测方法主要有LAMP和PCR法等，其中PCR应用较为广泛，且具有灵敏、准确的特点，但需要多种精密仪器配合使用。 RPA(Recombinase polymeraseamplification)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。该方法主要具备以下优点：(1)仅需 1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程，优于LAMP的2对引物；(2)只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；(3)反应时间仅需 40min；(4)结果易于判断，不像LAMP产物的弥散带，RPA扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带；(5)RPA与荧光定量PCR技术(qPCR)相结合，通过在反应体系中加入特定类型的探针，可以达到实时荧光检测。
然而，目前尚未有关于香蕉条斑病毒GF分离物的RPA检测技术的报道。因此，如何研究设计一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物及检测方法是我们目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物及检测方法，能够对香蕉条斑病毒GF分离物进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针，试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
第一方面，提供了一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物，所述 RPA引物是基于外壳蛋白基因设计，RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物BSGFV-RPA-F：CTTGGCAAAATTGGAAGGATCTAGATTACC SEQ ID NO.2；
下游引物BSGFV-RPA-R：CTTAGATGATGAATTGGCTCTTCCAC SEQ ID NO.3；
扩增产物片段大小为401bp。
第二方面，提供了一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA试剂盒，其特征是，所述RPA试剂盒包括2条针对外壳蛋白基因设计的特异性引物以及探针；所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物BSGFV-RPA-F：CTTGGCAAAATTGGAAGGATCTAGATTACC SEQ ID NO.2；
下游引物BSGFV-RPA-R：CTTAGATGATGAATTGGCTCTTCCAC SEQ ID NO.3；
扩增产物片段大小为401bp。
优选的，所述探针的核苷酸序列为P：
CTGTCTTCATACTCTCGATCTTAGAACT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)AATTGCAGGAGCAGGAATTACAGCTC-C3spacer；
其中，探针P在第28个bp位置添加有(FAM-dt)基团和(dspacer)修饰，在第29个bp位置添加有(BHQ1-dT)基团，在尾部添加有(C3spacer)修饰。
优选的，所述RPA试剂盒还包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL 上游引物BSGFV-RPA-F、4μL下游引物BSGFV-RPA-R、2μL探针P、100ng的核酸模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液 (280mmol/L)、余量为去离子水。
第三方面，提供了一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA检测方法，其特征是，包括以下步骤：
S1：基于香蕉条斑病毒GF分离物的外壳蛋白基因设计特异性RPA引物；所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物BSGFV-RPA-F：CTTGGCAAAATTGGAAGGATCTAGATTACC SEQ ID NO.2；
下游引物BSGFV-RPA-R：CTTAGATGATGAATTGGCTCTTCCAC SEQ ID NO.3；
扩增产物片段大小为401bp；
S2：提取待测样品中的总DNA；
S3：以S2中的总DNA为模板，采用S1中的RPA引物进行RPA扩增反应；
S4：分析RPA扩增产物，得出检测结果。
优选的，所述RPA扩增反应温度为39℃。
优选的，所述RPA扩增反应时间为30min。
第四方面，提供了上述一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物在香蕉条斑病检测中的应用。
综上，本发明具有以下有益效果：本发明针对香蕉条斑病毒GF分离物中外壳蛋白基因的保守序列，设计出了特异性RPA引物、探针、试剂盒，能够对香蕉条斑病毒GF分离物进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针，试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对香蕉病毒病防治及产品检验检疫具有科学指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中香蕉条斑病毒GF分离物RPA引物特异性检测电泳图；其中，M为DL2000 DNA Marker；1-2为健康香蕉标本；3-4为香蕉条斑病毒GF 分离物特异扩增；
图2是本发明实施例中香蕉条斑病毒GF分离物RPA反应灵敏度检测电泳图；其中，M为DL2000 DNA Marker；1-5的DNA模板浓度分别为100ng/μL、10ng/ μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图与实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
一、RPA引物、探针的设计
1、基于香蕉条斑病毒GF分离物中的外壳蛋白基因设计特异性RPA引物，外壳蛋白基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2、RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物BSGFV-RPA-F：CTTGGCAAAATTGGAAGGATCTAGATTACC SEQ ID NO.2；
下游引物BSGFV-RPA-R：CTTAGATGATGAATTGGCTCTTCCAC SEQ ID NO.3；
扩增产物片段大小为401bp。
3、探针的核苷酸序列为P：
CTGTCTTCATACTCTCGATCTTAGAACT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)AATTGCAGGAGCAGGAATTACAGCTC-C3spacer，如SEQ ID NO.4所示；
其中，探针P在第28个bp位置添加有(FAM-dt)基团和(dspacer)修饰，在第29个bp位置添加有(BHQ1-dT)基团，在尾部添加有(C3spacer)修饰。
二、试剂盒组成及使用方法
RPA试剂盒还包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL上游引物 BSGFV-RPA-F、4μL下游引物BSGFV-RPA-R、2μL探针P、100ng的核酸模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。
使用方法如下：
(1)提取待测分离物中病毒的总DNA。
(2)以(1)中提取的总DNA为模板，采用上述试剂盒基于TwistAmp Basic kits进行一步法RPA扩增。
(3)将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，RPA扩增反应温度为 39℃，扩增反应时间为30min后得到RPA扩增产物。
(4)RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后离心2min，取上清液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并以感染香蕉条斑病毒GF分离物的香蕉叶片作为阳性对照。
本实施中选取五份已感染香蕉条斑病毒GF分离物的A1、A2、A3、A4、A5 以及五份未感染的健康叶片B1、B2、B3、B4、B5，分别采用上述方法进行实验检测，其结果如表1所示：
表1实验结果
Figure BDA0002604292320000051
以A1、A2、B1、B2进行特异性检测，结果如图1所示。其中，M为DL2000 DNA Marker；1-2为健康香蕉，3-4为香蕉条斑病毒GF分离物特异扩增。结果显示，从香蕉条斑病毒GF分离物样本中扩增出特异性带，大小为401bp。从健康样本中未扩增出任何条带。结果表明所设计的引物具有特异性，可用于香蕉条斑病毒 GF分离物检测。
梯度稀释DNA模板，1-5稀释梯度分别为100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL， 0.1ng/μL，0.01ng/μL，其电泳结果如图2所示，结果显示，本发明的检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物的反应灵敏度高，检测灵敏度为0.1ng。
结果分析：本实施例中的RPA引物、探针、试剂盒，能够对香蕉条斑病毒 GF分离物进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针，试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物及检测方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaactccg acctcaaaga gtttgagaac caattccttt cttggaggaa ttcttggcaa 60
aattggaagg atctagatta cctaaatcta gaatcctcat caagagctga cttagctcac 120
aaccttcgga tcactgcata tcgagtagat ctcggtaaca aagccttgtt tgctctaagc 180
aaacagaact gtcttcatac tctcgatctt agaactaaat tgcaggagca ggaattacag 240
ctccaggaga ttggaaaact ttccaaaatt gttcgacaac agcgaaacga tctgaagctg 300
ctgctctcaa aacaggatca tttgcaagaa gagatccttc aactaaggca ggactatctc 360
aaaagaagac ccctgtctaa ggaagacgtt gaagagctgg tgatcaaaat cagcgaacaa 420
ccgaaattta tagaaaagca aacagaagcc ttaacggaag agttagcgaa gaaagttgac 480
aaagtggaag agccaattca tcatctaaga aaaacaattc ttggatga 528
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cttggcaaaa ttggaaggat ctagattacc 30
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttagatgat gaattggctc ttccac 26
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctgtcttcat actctcgatc ttagaactaa attgcaggag caggaattac agctc 55

Claims (8)

1.一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物，其特征是，所述RPA引物是基于外壳蛋白基因设计，RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物BSGFV-RPA-F：CTTGGCAAAATTGGAAGGATCTAGATTACC SEQ ID NO.2；
下游引物BSGFV-RPA-R：CTTAGATGATGAATTGGCTCTTCCAC SEQ ID NO.3；
扩增产物片段大小为401bp。
2.一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA试剂盒，其特征是，所述RPA试剂盒包括2条针对外壳蛋白基因设计的特异性引物以及探针；所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物BSGFV-RPA-F：CTTGGCAAAATTGGAAGGATCTAGATTACC SEQ ID NO.2；
下游引物BSGFV-RPA-R：CTTAGATGATGAATTGGCTCTTCCAC SEQ ID NO.3；
扩增产物片段大小为401bp。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA试剂盒，其特征是，所述探针的核苷酸序列为P：
CTGTCTTCATACTCTCGATCTTAGAACT(FAM-dT)(dSpacer)A(BHQ1-dT)AATTGCAGGAGCAGGAATTACAGCTC-C3spacer；
其中，探针P在第28个bp位置添加有(FAM-dt)基团和(dspacer)修饰，在第29个bp位置添加有(BHQ1-dT)基团，在尾部添加有(C3spacer)修饰。
4.根据权利要求2所述的一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA试剂盒，其特征是，所述RPA试剂盒还包括RPA反应扩增体系：总量为50μL，4μL上游引物BSGFV-RPA-F、4μL下游引物BSGFV-RPA-R、2μL探针P、100ng的核酸模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。
5.一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA检测方法，其特征是，包括以下步骤：
S1：基于香蕉条斑病毒GF分离物的外壳蛋白基因设计特异性RPA引物；所述RPA引物的核苷酸序列为：
上游引物BSGFV-RPA-F：CTTGGCAAAATTGGAAGGATCTAGATTACC SEQ ID NO.2；
下游引物BSGFV-RPA-R：CTTAGATGATGAATTGGCTCTTCCAC SEQ ID NO.3；
扩增产物片段大小为401bp；
S2：提取待测样品中的总DNA；
S3：以S2中的总DNA为模板，采用S1中的RPA引物进行RPA扩增反应；
S4：分析RPA扩增产物，得出检测结果。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA检测方法，其特征是，所述RPA扩增反应温度为39℃。
7.根据权利要求5所述的一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物及检测方法，其特征是，所述RPA扩增反应时间为30min。
8.权利要求1所述的一种用于检测香蕉条斑病毒GF分离物的RPA引物在香蕉条斑病检测中的应用。
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