CN111118221B - 斯里兰卡木薯花叶病毒检测用rpa引物、探针及试剂盒 - Google Patents

斯里兰卡木薯花叶病毒检测用rpa引物、探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒，涉及生物技术领域，其技术方案要点是：对斯里兰卡木薯花叶病毒中外壳蛋白基因的保守序列，设计出了特异性RPA引物、探针、试剂盒，能够对斯里兰卡木薯花叶病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对进出口木薯种质及产品检验检疫具有科学指导意义。

Description

斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒。
背景技术
斯里兰卡木薯花叶病毒(Cassava mosaic virus)是双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员之一。病毒粒子为双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。病毒基因组由两个双链单链DNA组分组成，分别为DNA-A和DNA-B。DNA-A组分全长大小为2760bp，预计编码6个病毒蛋白，分别为外壳蛋白(Coat protein,CP)，运动蛋白(Movement protein,MP)，复制相关蛋白(Replication-associatedprotein,Rep)，转录激活蛋白(Transcriptional activator protein,TrAP)，复制增强子(Replication enhancer,REn)和与症状形成和细胞周期相关蛋白。DNA-B组分全长大小为2737bp，预计编码2个病毒蛋白，分别为运动蛋白(MP)和核穿梭蛋白(Nuclear shuttleprotein,NSP)。
木薯是世界上列于谷类和豆类之后的重要粮食作物，主要种植于在非洲、南美洲、东南亚和印度等，其中非洲是最大的木薯产地。斯里兰卡木薯花叶病毒是木薯最重要的病毒之一，在斯里兰卡、印度等亚洲地区引起危害，严重地区危害达100％。目前，该病毒病未在我国木薯上大面积发生。但是，我国从非洲、印度等疫区引进木薯种质，存在传入我国并大面积危害的隐患。
目前，针对斯里兰卡木薯花叶病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附法和PCR法等，其中PCR应用较为广泛。酶联免疫法的灵敏、准确较低，容易出现假阳性和假阴性问题；PCR灵敏、准确，但需要多种精密仪器配合使用。因此，基于不依赖PCR仪的等温扩增技术在田间检测就显得非常有应用价值。其中，RPA(Recombinase polymerase amplification)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对，并在DNA聚合酶的作用下复制延伸。该方法主要具备以下优点：(1)仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；(2)只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；(3)反应时间仅需40min；(4)结果易于判断，不像LAMP产物的弥散带，RPA扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带；(5)RPA与荧光定量PCR技术(qPCR)相结合，通过在反应体系中加入特定类型的探针，可以达到实时荧光检测。
然而，目前尚未有关于斯里兰卡木薯花叶病毒的RPA检测技术的报道，因此，如何研究一种斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针及试剂盒是我们目前迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针，所述RPA引物核苷酸序列为：
正向引物F：CCTCGAAGGTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGAC；
反向引物R：CTGGACTCAAACGATTGAACCTTACATGGGCC；
所述探针的核苷酸序列为P：
GAATAGTGTGATGTTCTTCCTTGTAAGGGATCGTAG(BHQ1-dt)G(THF)C(FAM-dT)CTGTTGATAAGCCCC(C3spacer)；
其中，探针P在第37个bp位置添加有(BHQ1-dt)基团，在第39个bp位置添加有(THF)基团，在41bp位置添加有(FAM-dT)基团，尾部添加有(C3spacer)修饰。
本发明的另一目的是提供斯里兰卡木薯花叶病毒检测用试剂盒。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：斯里兰卡木薯花叶病毒检测用试剂盒，包括上述RPA引物和探针。
优选的，所述正向引物F、反向引物R的终浓度相同。
优选的，所述正向引物F、反向引物R的终浓度为0.8～1.6μmol/L。
本发明还提供了上述RPA引物、探针在检测斯里兰卡木薯花叶病毒中的应用。
本发明还提供了上述试剂盒在检测斯里兰卡木薯花叶病毒中的应用。
本发明还提供了RPA与荧光定量PCR技术(qPCR)相结合，通过在反应体系中加入特定类型的探针，可以达到实时荧光检测。
本发明具有以下有益效果：本发明针对斯里兰卡木薯花叶病毒中外壳蛋白基因的保守序列，设计出了特异性RPA引物、探针、试剂盒，能够对斯里兰卡木薯花叶病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速，对进出口木薯种质及产品检验检疫具有科学指导意义。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1：
(1)RPA引物的设计
针对斯里兰卡木薯花叶病毒的外壳蛋白基因的保守序列，设计检测斯里兰卡木薯花叶病毒的RPA引物、探针，具体序列如下：
正向引物F：CCTCGAAGGTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGAC；
反向引物R：CTGGACTCAAACGATTGAACCTTACATGGGCC。
(2)探针P
探针的核苷酸序列为P：
GAATAGTGTGATGTTCTTCCTTGTAAGGGATCGTAG(BHQ1-dt)G(THF)C(FAM-dT)CTGTTGATAAGCCCC(C3spacer)。
其中，探针P在第37个bp位置添加有(BHQ1-dt)基团，在第39个bp位置添加有(THF)基团，在41bp位置添加有(FAM-dT)基团，尾部添加有(C3spacer)修饰。
(3)试剂盒组成及使用方法
该试剂盒包括实施例1中的正向引物F、反向引物R、探针P、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、醋酸镁溶液(280mmol/L)、去离子水。
使用方法如下：
S1、提取待测病毒的总DNA。
S2、以S1中提取的总DNA为模板，采用上述试剂盒基于TwistAmp Basic kits进行一步法RPA扩增。
反应体系如下：总量为50μL，4μL正向引物F、4μL反向引物R、2μL探针P、200ng的DNA模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。其中，正向引物F、反向引物R的终浓度相同，终浓度范围为0.8μmol/L。
将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于37℃金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。
S3、RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后离心2min，取上清液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并以感染斯里兰卡木薯花叶病毒的木薯叶片作为阳性对照。
本实施中选取五份已感染斯里兰卡木薯花叶病毒的木薯叶片A1、A2、A3、A4、A5以及五份健康的木薯叶片B1、B2、B3、B4、B5，分别采用上述方法进行实验检测，其结果如表1所示：
表1实验结果
Figure GDA0002477083200000051
Figure GDA0002477083200000061
结果分析：本实施例中的RPA引物、探针、试剂盒，能够对斯里兰卡木薯花叶病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速。
实施例2：
(1)RPA引物的设计
针对斯里兰卡木薯花叶病毒的外壳蛋白基因的保守序列，设计检测斯里兰卡木薯花叶病毒的RPA引物、探针，具体序列如下：
正向引物F：CCTCGAAGGTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGAC；
反向引物R：CTGGACTCAAACGATTGAACCTTACATGGGCC。
(2)探针P
探针的核苷酸序列为P：
GAATAGTGTGATGTTCTTCCTTGTAAGGGATCGTAG(BHQ1-dt)G(THF)C(FAM-dT)CTGTTGATAAGCCCC(C3spacer)。
其中，探针P在第37个bp位置添加有(BHQ1-dt)基团，在第39个bp位置添加有(THF)基团，在41bp位置添加有(FAM-dT)基团，尾部添加有(C3spacer)修饰。
(3)试剂盒组成及使用方法
该试剂盒包括实施例1中的正向引物F、反向引物R、探针P、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、醋酸镁溶液(280mmol/L)、去离子水。
使用方法如下：
S1、提取待测病毒的总DNA。
S2、以S1中提取的总DNA为模板，采用上述试剂盒基于TwistAmp Basic kits进行一步法RPA扩增。
反应体系如下：总量为50μL，4μL正向引物F、4μL反向引物R、2μL探针P、200ng的DNA模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。其中，正向引物F、反向引物R的终浓度相同，终浓度范围为1.2μmol/L。
将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于37℃金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。
S3、RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后离心2min，取上清液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并以感染斯里兰卡木薯花叶病毒的木薯叶片作为阳性对照。
本实施中选取五份已感染斯里兰卡木薯花叶病毒的木薯叶片C1、C2、C3、C4、C5以及五份健康的木薯叶片D1、D2、D3、D4、D5，分别采用上述方法进行实验检测，其结果如表2所示：
表2实验结果
Figure GDA0002477083200000071
结果分析：本实施例中的RPA引物、探针、试剂盒，能够对斯里兰卡木薯花叶病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速。
实施例3：
(1)RPA引物的设计
针对斯里兰卡木薯花叶病毒的外壳蛋白基因的保守序列，设计检测斯里兰卡木薯花叶病毒的RPA引物、探针，具体序列如下：
正向引物F：CCTCGAAGGTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGAC；
反向引物R：CTGGACTCAAACGATTGAACCTTACATGGGCC。
(2)探针P
探针的核苷酸序列为P：
GAATAGTGTGATGTTCTTCCTTGTAAGGGATCGTAG(BHQ1-dt)G(THF)C(FAM-dT)CTGTTGATAAGCCCC(C3spacer)。
其中，探针P在第37个bp位置添加有(BHQ1-dt)基团，在第39个bp位置添加有(THF)基团，在41bp位置添加有(FAM-dT)基团，尾部添加有(C3spacer)修饰。
(3)试剂盒组成及使用方法
该试剂盒包括实施例1中的正向引物F、反向引物R、探针P、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、醋酸镁溶液(280mmol/L)、去离子水。
使用方法如下：
S1、提取待测病毒的总DNA。
S2、以S1中提取的总DNA为模板，采用上述试剂盒基于TwistAmp Basic kits进行一步法RPA扩增。
反应体系如下：总量为50μL，4μL正向引物F、4μL反向引物R、2μL探针P、200ng的DNA模板、再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL、2.5μL醋酸镁溶液(280mmol/L)、余量为去离子水。其中，正向引物F、反向引物R的终浓度相同，终浓度范围为1.6μmol/L。
将RPA扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于37℃金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。
S3、RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后离心2min，取上清液进行琼脂糖凝胶电泳检测，并以感染斯里兰卡木薯花叶病毒的木薯叶片作为阳性对照。
本实施中选取五份已感染斯里兰卡木薯花叶病毒的木薯叶片E1、E2、E3、E4、E5以及五份健康的木薯叶片F1、F2、F3、F4、F5，分别采用上述方法进行实验检测，其结果如表3所示：
表3实验结果
Figure GDA0002477083200000091
结果分析：本实施例中的RPA引物、探针、试剂盒，能够对斯里兰卡木薯花叶病毒进行准确的定性检测，基于该RPA扩增引物、探针、试剂盒不仅准确性高，而且操作简单、快速。
综上，本发明提供的斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针、试剂盒使用效果为100％。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120> 木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针、试剂盒及应用
<130> 3
<140> 202010120732.X
<141> 2020－02－26
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctcgaaggt tcgtcgccgt ctgaacttcg ac 32
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctggactcaa acgattgaac cttacatggg cc 32
<210> 3
<211> 771
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtcgaagc gaccagcaga tatcatcatt tcaactcccg cctcgaaggt tcgtcgccgt 60
ctgaacttcg acagcccata cagcagtcgt gctgctgtcc ccactgtccg cgtcacaaaa 120
agacaagcct ggacaaacag gcccatgaat cggaagccca ggtggtacag gatgttcaaa 180
agcccagatg ttcctagggg atgtgaaggc ccatgtaagg ttcaatcgtt tgagtccaga 240
cacgatgtgg tccatatagg taaggtcatg tgcatctctg atgtcactcg tggagttggg 300
cttactcatc gcgtgggtaa gaggttttgc gttaagtccg tttatatcct gggtaagata 360
tggatggatg aaaatattaa gaccaagaat catacgaata gtgtgatgtt cttccttgta 420
agggatcgta ggcctgttga taagccccag gattttggtg aagtgtttaa tatgttcgat 480
aatgaaccta gtacagctac ggtgaagaac atgcatcgtg atcgttatca agtcctcagg 540
aagtggagtg ccactgtcac tggtggtcag tatgcgagca aggaacaggc tttagttagg 600
cgttttttta gagttaataa ttatgttgtg tataaccagc aagaggctgg caagtatgaa 660
aatcataccg agaatgcatt gatgctgtac atggcgtgta ctcatgcctc taaccctgta 720
tacgctacgc tgaagattag aatctacttc tacgattcgg tcagcaatta a 771

Claims (6)

1.斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针，其特征是，所述RPA引物核苷酸序列为：
正向引物F：CCTCGAAGGTTCGTCGCCGTCTGAACTTCGAC；
反向引物R：CTGGACTCAAACGATTGAACCTTACATGGGCC；
所述探针的核苷酸序列为P：
GAATAGTGTGATGTTCTTCCTTGTAAGGGATCGTAG(BHQ1-dt)G(THF)C(FAM-dT)CTGTTGATAAGCCCC(C3spacer)；
其中，探针P在第37个bp位置添加有BHQ1-dt基团，在第39个bp位置添加有THF基团，在41bp位置添加有FAM-dT基团，尾部添加有C3spacer修饰。
2.斯里兰卡木薯花叶病毒检测用试剂盒，其特征是，包括权利要求1所述的RPA引物和探针。
3.根据权利要求2所述的斯里兰卡木薯花叶病毒检测用试剂盒，其特征是，所述正向引物F、反向引物R的终浓度相同。
4.根据权利要求3所述的斯里兰卡木薯花叶病毒检测用试剂盒，其特征是，所述正向引物F、反向引物R的终浓度为0.8～1.6μmol/L。
5.权利要求1所述的斯里兰卡木薯花叶病毒检测用RPA引物、探针在检测斯里兰卡木薯花叶病毒中的应用。
6.权利要求2-4任意一项所述的斯里兰卡木薯花叶病毒检测用试剂盒在检测斯里兰卡木薯花叶病毒中的应用。
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