CN113667776A - 一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。包括取待测百合植株的叶片，提取总RNA；以提取的百合叶片总RNA为模板，进行逆转录反应获得cDNA；以获得的cDNA为模板，利用特异性引物对CP‑2F/R进行基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光定量PCR检测；以不同浓度的含检测基因片段的质粒PlAMV‑CP2标准品为模板制作标准曲线；根据检测结果Cq值判断植株的带病情况，根据标准曲线对带病植株的病毒进行定量计算。本发明对侵染车前草花叶病毒的百合植株的鉴定具有快速简便、灵敏度高及可重复性强的优点，其检测灵敏度是常规RT‑PCR的100倍，可用于进出境口岸和百合生产中车前草花叶病毒的快速诊断、定量检测及监测防控。

Description

一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法。

背景技术

在生产中，百合采用无性繁殖方式进行繁殖，易感染多种病毒，导致其种球减产、花蕾畸形和凋落，严重影响了百合的产量和品质，我国种植的百合中检测到PlAMV病毒逐渐成为一种危害百合生产的主要病害。百合感染PlAMV后，叶脉呈锈色，花蕾干枯死亡，发病后期坏死严重，导致大面积切花丧失商业价值。PlAMV属甲型线状病毒科(Alphaflexiviridae)，马铃薯X病毒属(Potexvirus)成员)。PlAMV是单链正义RNA病毒，长约6100个核苷酸，全基因组包含5个开放阅读框；ORF1编码一个依赖RNA的RNA聚合酶，ORF2-4编码三个重叠基因蛋白参与病毒的运动和ORF5编码外壳蛋白。PlAMV具有广泛的宿主范围，该病毒除侵染车前草、百合外，还可侵染油菜、报春花、南天竹等植物，危害极为严重。

目前，病毒的检测方法包括酶联免疫吸附试验、直接组织印迹、逆转录环介导的等温扩增、常规RT-PCR和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)等，其中，RT-qPCR作为一种高效、便捷、稳定性好及可定量的检测技术已广泛应用于蔬菜、花卉、果树等植物的病毒检测中。

迄今为止，针对PlAMV的检测开发了多种技术，用RT-LAMP方法对侵染本氏烟和百合的PlAMV进行检测或者使用ELISA和RT-PCR方法检测了入境哥斯达黎加百合的PlAMV，这些方法虽然可以检测出PlAMV，但是在检测灵敏度和定量等方面存在劣势。因此，亟需建立适用于百合PlAMV快速灵敏的RT-qPCR检测技术。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，用于解决现有技术中对带有PlAMV植株的鉴定操作繁琐、灵敏度低和定量复杂等缺陷，本发明可为PlAMV的准确高效监测防控提供技术支持。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种快速鉴定百合中车前草花叶病毒侵染植株的方法，包括如下步骤：

(1)取待测百合植株的叶片，提取总RNA；

(2)以提取的百合叶片总RNA为模板，进行逆转录反应，获得cDNA；

(3)以步骤(2)的cDNA为模板，利用特异性引物对CP-2F/R进行基于荧光染料SYBRGreenI的实时荧光定量PCR检测；所述特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，所述特异性引物的序列如下：

CP-2F：5’-TCTTCGATGGCCTCCTCAAC-3’，

CP-2R：5’-TAGGGATCGTGCCGTCTCAT-3’，

(4)以不同浓度的含有检测基因片段的质粒PlAMV-CP2标准品为模板制作标准曲线；

(5)根据步骤(3)的检测结果判断植株的带病情况，根据步骤(4)获得的标准曲线对带病植株的病毒进行定量计算。

本发明主要适用于百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植株的鉴定。

进一步地，所述步骤(1)中取百合待测植株的叶片50-100mg，采用多糖多酚植物组织裂解法对百合叶片样品进行总RNA提取。

进一步地，所述步骤(2)中逆转录的反应体系及程序为：在RNase Free Microtube管中加入7.0μL模板RNA、1.0μLAnchored Oligo(dT)₂₀Primer(0.5μg·μL^-1)、1.0μL

II RT/RI Enzyme Mix、1.0μL gDNA Remover、10.0μL 2×TS II Reaction Mix配置混合液。混合液50℃孵育15min，85℃加热5s得到的cDNA用于实时荧光定量PCR；混合液50℃孵育30min，85℃加热5s得到的cDNA用于常规PCR。

进一步地，所述步骤(3)的实时荧光定量PCR检测，反应体系为：所述cDNA 2.0μL，CP-2F和CP-2R引物各0.5μL，2×PerfectStart^TMGreen qPCR SuperMix 10.0μL，RNase FreeddH₂O 7.0μL。反应条件：94℃预变性30s；94℃变性5s，53～63℃退火15s，72℃延伸10s，39个循环。熔解曲线分析温度范围65～95℃。

进一步地，所述步骤(3)中荧光定量PCR扩增时，退火温度为59.4℃。

进一步地，所述步骤(4)中标准曲线的制作方法如下：取百合中车前草花叶病毒外壳蛋白基因克隆质粒作为标准品，用RNase Free ddH₂O稀释为1.3×10³-1.3×10⁹copies·μL^-1的10倍浓度梯度模板，然后进行实时荧光定量PCR扩增，扩增完成后，以Cq值为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，制作标准曲线。

进一步地，所述标准曲线扩增效率(E)为98.7％，决定系数(R2)为0.990，标准曲线的方程为y＝-3.353Log₁₀ ^C+37.104，y为Cq值，C为浓度(单位为copies·μL^-1)。

进一步地，所述步骤(5)中待百合检测植株带病情况的判断方法如下：通过扩增曲线及Cq值来判定待测植株是否为病毒侵染阳性植株，当扩增曲线良好并且Cq<35时，则为阳性，即判断待测植株带毒；反之，Cq≥35时，则为阴性，即判断待测植株不带毒。

进一步地，所述步骤(5)中，当检测出待测百合植株带毒时，根据待测样品Cq值以及所述标准曲线，计算待测植株内病毒浓度。

如上所述，本发明通过选取PlAMV的外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计特异性检测引物CP-2F/R，通过优化反应条件，建立了该病毒的高效实时荧光定量PCR检测技术体系。该实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度比常规PCR高100倍，最低检出病毒浓度为13copies·μL^-1，特异性强，重复性高(组内和组间变异系数均小于1.5％)，并可实现对感病植株内PlAMV病毒的定量分析。

由于本发明对百合车前草花叶病毒侵染植株的鉴定具有快速简便、灵敏度高及可重复性强的特点，以及对植株内的PlAMV病毒可进行定量分析，在百合进口鉴定、大规模种植及病害流行调查时，采用本发明对PlAMV病毒侵染植株进行快速检测。

附图说明

图1显示为4对CP引物A、B、C、D在4个感染PlAMV样品中的常规PCR扩增结果胶图；

图2显示为不同引物浓度下PlAMV的RT-qPCR扩增曲线；

图3显示为不同退火温度下PlAMV的RT-qPCR扩增曲线；

图4显示为不同退火温度条件下PlAMV熔解曲线；

图5显示为PlAMV的RT-qPCR标准曲线；

图6显示为RT-qPCR特异性检测扩增曲线(A)和熔解峰图(B)；

图7显示为不同浓度PlAMV质粒的RT-PCR检测结果；

图8显示为不同浓度PlAMV质粒的实时荧光定量PCR扩增曲线；

图9显示为卷丹不同部位PlAMV病毒量RT-qPCR检测。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

下面实例中所涉及的材料，试剂和设备具体来源为：

1.材料：使用中国农业科学院蔬菜花卉研究所百合课题组保存的感染PlAMV百合植株进行特异引物的筛选；田间检测的样品为课题组资源圃的百合资源。

2.试剂：RNA提取试剂盒：RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441)和质粒提取试剂盒：高纯度质粒小提试剂盒(DP104)均购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒

II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(目录号：AH311)、胶回收试剂盒：

PCR Purification Kit(目录号：EP101)、克隆载体：

Blunt Cloning Kit(目录号：CB101)均购自北京全式金生物技术有限公司；高保真酶：KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit(目录号：KK2601)购自北京巨华泰克公司；常规PCR Mix：2×Hieff^TMPCR Master Mix(With Dye)(目录号：10102ES08)购自翌圣生物科技(上海)有限公司；

3.设备：超微量紫外分光光度计(Quawell Q3000)、PCR仪(Bio-Rad)、CFX96 Real-Time System荧光定量PCR仪(Bio-Rad)

实施例1

1.百合总RNA的提取及反转录

取百合植株的叶片50-100mg，采用多糖多酚植物组织裂解法对百合叶片样品进行总RNA提取，之后采用反转录试剂盒

II One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis Super Mix获得cDNA。

2.引物的设计合成及筛选

选择本实验室前期测序的PlAMV(GenBank:KX245539.1)为模板序列，利用DNASTAR软件分析比对NCBI数据库的PlAMV的CP基因保守序列，设计合成4对PlAMV RT-qPCR检测引物CP-1F/R、CP-2F/R、CP-3F/R、CP-4F/R。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

采用常规PCR对引物进行扩增和筛选。RT-PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃20s，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 检测PlAMV实时荧光定量PCR引物序列

采用4对PlAMV引物分别对4个携带PlAMV的百合样品进行RT-PCR检测，对于携带PlAMV的4个样品，结果表明：引物CP-1F/R、CP-3F/R和CP-4F/R条带不单一、有杂带，引物CP-2F/R扩增效果最好，条带单一，且无引物二聚体的产生，如图1所示。

3.PlAMV质粒标准品制备

1)以cDNA为模板，用筛选得到的检测引物CP-2F/R进行PCR扩增，反应体系总体积50.0μL：cDNA2.0μL，上下游引物各1.5μL，2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix 25.0μL，ddH₂O 20.0μL。反应条件：95℃3min；98℃20s，60℃15s，72℃30s，35个循环；72℃2min。利用2％的琼脂糖凝胶进行PCR产物切胶回收。

2)PCR纯化产物的连接反应参照全式金公司的

-Blunt Cloning Kit说明书进行。反应体系10.0μL：

Blunt Cloning Vector 2.0μL，PCR纯化产物8.0μL。混合液混匀后25℃放置15min，进行连接反应。

3)参照唯地生物DH5αChemically Competent Cell产品说明书，将连接后的质粒迅速转化到DH5α感受态细胞，并均匀涂抹于LB(50mg·L^-1氨苄青霉素)平板上，12小时后，挑取单菌落。

将单菌落置于1mLLB液体培养基(50mg·L^-1氨苄青霉素)中，37℃摇床上(200r·min^-1)培养8小时后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

4)选择测序结果中序列完全正确的阳性克隆样品，使用天根质粒提取试剂盒完成PlAMV质粒的提取。运用公式：C＝A·B^-1×6.02×10¹⁴(其中A代表质粒浓度ng·μL^-1，B代表质粒DNA分子量，C代表copies·μL^-1)计算出质粒浓度拷贝数，将其命名为PlAMV-CP2质粒标准品使用。

4.实时荧光定量PCR反应

cDNA 2.0μL，CP-2F和CP-2R引物各0.5μL，2×Perfect Start^TMGreen qPCR SuperMix 10.0μL，RNase Free ddH₂O 7.0μL。反应条件：94℃预变性30s；94℃变性5s，59.4℃退火15s，72℃延伸10s，39个循环。熔解曲线分析温度范围65～95℃。

5.实时荧光定量RT-PCR条件的优化

1)引物浓度的优化

以PlAMV-CP2质粒标准品作为模板，退火温度60℃，设定(1、5、10、15、20、30μmol·L^-1)的引物浓度，分别进行实时荧光定量PCR，并对扩增效率和熔解曲线进行观察。每组试验重复3次。结果发现不同引物浓度下，扩增曲线Cq值范围在19.11～24.32之间(图2)。当引物浓度为10μmol·L^-1时，相对荧光强度最大，检测效果最好，选择10μmol·L^-1作为该体系引物浓度。

2)退火温度的优化

在10μmol·L^-1引物浓度条件下，以PlAMV质粒标准品为模板，在8个不同退火温度(53、53.7、55、56.9、59.4、61.3、62.5、63℃)下观察荧光信号的变化。结果如(图3和图4)所示，扩增出的熔解曲线为单峰，解链温度为87℃，故扩增出的产物是目的基因。在不同温度中，59.4℃时的荧光吸收值达到最大，因此确定59.4℃为RT-qPCR检测体系的最佳退火温度。

6.标准曲线的制备

取PlAMV-CP2质粒标准品，用灭菌ddH₂O稀释为1.3×10³～1.3×10⁹copies·μL^-1的10倍浓度梯度模板，然后进行实时荧光定量PCR扩增，扩增完成后，以Cq值为纵坐标，标准品浓度(C代表copies·μL^-1)的对数值为横坐标，制作标准曲线。本实施例标准曲线如(图5)所示，PlAMV-CP2质粒标准品浓度的对数值与其Cq值之间具有良好的线性关系，扩增效率(E)为98.7％，决定系数(R²)为0.990，标准曲线的方程为y＝-3.353Log₁₀ ^C+37.104，y为Cq值，C为浓度(单位为copies·μL^-1)。

7.检测结果报告

1)通过扩增曲线及Cq值来判定待测植株是否为病毒侵染阳性植株，当扩增曲线良好并且Cq<35时，则为阳性，即判断待测植株带毒；反之，Cq≥35时，则为阴性，即判断待测植株不带毒。

2)当检测出待测百合植株带毒时，根据待测样品Cq值以及建立的标准曲线，计算待测植株内病毒浓度。

8.本发明检测PlAMV的特异性试验

用已检测含有百合无症病毒(Lily symptomless virus，LSV)，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosais virus，CMV)，百合斑驳病毒(Lily mosaic virus，LMoV)，车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus，PlAMV)的cDNA样品进行PlAMV的RT-qPCR特异性检测。每组试验重复3次，结果表明仅携带PlAMV病毒的样品出现正常的扩增曲线，Cq值为16.13、16.15、16.19，熔解温度为87℃，熔解曲线为单一峰(图6)。其他病毒均无明显扩增曲线，且熔解曲线无峰，表明该RT-qPCR方法可特异性检测PlAMV。

9.本发明检测PlAMV的灵敏度试验

以10⁸-10⁰梯度稀释的PlAMV-CP2质粒标准品为模板，分别进行常规PCR和实时荧光定量PCR检测，阴性对照为无菌ddH₂O。结果显示，常规PCR只能检测母液稀释10⁵倍的PlAMV-CP2质粒标准品(图7)，最低检出浓度为1300copies·μL^-1，而实时荧光定量PCR可检测母液稀释10⁷倍的PlAMV-CP2质粒标准品(图8)，最低检出浓度为13copies·μL^-1。实时荧光定量PCR检测灵敏度较常规PCR检测提高了100倍。

10.本发明检测PlAMV的重复性试验

以梯度稀释的1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴copies·μL^-1的PlAMV-CP2质粒标准品为模板，每个梯度3个重复，分3周进行3次实验，获得Cq值、标准差以及变异系数。实验结果(表2)显示各梯度组内和组间重复检测的变异系数均小于为1.5％，表明该方法具有较好的重复性。

表2 荧光定量RT-PCR重复性试验

11.本发明方法与常规PCR检测田间样品的对比试验

对田间采集的75份百合叶片样品进行总RNA提取，每一份样品分别采用的RT-qPCR和RT-PCR体系进行PlAMV病毒检测。结果显示，常规PCR共检测出21个阳性样品(28.00％)，RT-qPCR共检测出29个阳性样品(38.67％)，由此可见，RT-qPCR检测出阳性样品高于常规RT-PCR。另外，常规PCR检测除需要百合叶片总RNA提取、逆转录获得cDNA、PCR扩增外，还需要制胶、电泳等步骤。而本发明实时荧光定量RT-qPCR法仅需RNA提取、逆转录获得cDNA、qPCR扩增即可获得数据，检测速度快，灵敏度高，无污染。

12.本发明检测PlAMV侵染百合植株的不同组织部位病毒量

采用上述建立的RT-qPCR体系对PlAMV病毒侵染的食用百合卷丹‘Liliumlancifolium Thunb’的鳞茎、茎、叶片、花药进行不同组织检测，计算PlAMV病毒在百合不同部位表达量。结果显示(图9)，百合叶片中PlAMV的浓度最高，其次是花药、茎和鳞茎。因此，在检测PlAMV感染百合情况时，尽可能采用叶片为样品可有效保障病毒检测的准确性。

综上所述，本发明建立的RT-qPCR检测方法与常规RT-PCR相比，无需电泳凝胶和染色，具有灵敏度高、无污染、适用范围广等优越性，可对百合样品中的PlAMV进行准确高效检测，以用于PlAMV的长期监测预警和流行趋势研究。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法

<141> 2021-09-16

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 车前草花叶病毒(PlAMV)

<400> 1

tcttcgatgg cctcctcaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 车前草花叶病毒(PlAMV)

<400> 2

tagggatcgt gccgtctcat 20

Claims (8)

1.一种检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取待测百合植株的叶片，提取总RNA；

(2)以提取的百合叶片总RNA为模板，进行逆转录反应，获得cDNA；

(3)以步骤(2)的cDNA为模板，利用特异性引物对CP-2F/R进行基于荧光染料SYBRGreen I的实时荧光定量PCR检测，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，所述特异性引物的序列如下：

CP-2F：5’-TCTTCGATGGCCTCCTCAAC-3’，

CP-2R：5’-TAGGGATCGTGCCGTCTCAT-3’，

(4)以不同浓度的含有检测基因片段的质粒PlAMV-CP2标准品为模板制作标准曲线；

(5)根据步骤(3)的检测结果判断植株的带病情况，根据步骤(4)获得的标准曲线对带病植株的病毒进行定量计算。

2.根据权利要求1所述的检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR的方法，其特征在于：所述总RNA提取的方法包括采用多糖多酚植物组织裂解法对百合叶片样品进行提取。

3.根据权利要求1所述的检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR的方法，其特征在于：所述逆转录反应的反应体系及程序为：

7.0μL模板RNA

1.0μL Anchored Oligo(dT)₂₀Primer(0.5μg·μL^-1)

II RT/RI Enzyme Mix

1.0μL gDNA Remover

10.0μL 2×TS II Reaction Mix配置混合液。

所述混合液在50℃孵育15min，85℃加热5s得到的cDNA用于实时荧光定量PCR。

4.根据权利要求1所述的检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR检测的反应体系为：

cDNA 2.0μL，

CP-2F和CP-2R引物各0.5μL，

2×PerfectStart^TMGreen qPCR Super Mix 10.0μL，

RNase Free ddH₂O 7.0μL。

反应条件为：94℃预变性30s；94℃变性5s，退火15s，72℃延伸10s，39个循环，熔解曲线分析温度范围65～95℃。

5.根据权利要求4所述的检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测中荧光定量PCR扩增时，退火温度为59.4℃。

6.根据权利要求1所述的检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR的方法，其特征在于，所述步骤(3)中标准曲线的制作方法如下：

取百合中车前草花叶病毒外壳蛋白基因克隆质粒作为标准品，用RNase Free ddH₂O稀释为1.3×10³～1.3×10⁹copies·μL^-1的10倍浓度梯度模板，然后进行实时荧光定量PCR扩增，扩增完成后，以Cq值为纵坐标，标准品浓度的对数值为横坐标，制作标准曲线。

7.根据权利要求6所述的检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR的方法，其特征在于，所述标准曲线扩增效率(E)为98.7％，决定系数(R²)为0.990，标准曲线的方程为y＝-3.353Log₁₀ ^C+37.104，y为Cq值，C为浓度(单位为copies·μL^-1)。

8.根据权利要求1所述的检测百合中车前草花叶病毒的实时荧光定量PCR的方法，其特征在于，在步骤(4)中待百合测植株带病情况的判断方法如下：当扩增曲线良好并且Cq<35时，则为阳性，即判断待测植株带毒；反之，Cq≥35时，则为阴性，即判断待测植株不带毒，参考标准曲线，确定病毒浓度。

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