CN116479185A - 一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种RT‑qPCR检测百合无症状病毒的方法，涉及生物技术领域。所述方法包括以下步骤：(1)提取得到待检样品的总RNA，之后反转录得到cDNA；以所述cDNA为模板，利用特异性引物对进行RT‑qPCR反应，根据Ct值判断所述待检样品中是否含有百合无症状病毒：当15<Ct值<35时，为阳性，即为含有所述百合无症状病毒；当Ct值≥35时，为阴性，即为不含有所述百合无症状病毒。本发明以百合无症状病毒基因组编码外壳蛋白基因保守区域，设计特异性强的RT‑qPCR检测引物，建立了一种高效的RT‑qPCR检测方法，可为百合无症状病毒的准确高效监测防控提供技术支持。

Description

一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法。

背景技术

龙牙百合(Lilium brownii var.viridulum Baker)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)多年生草本植物，是野百合(Lilium brownii)的变种，因其鳞片肥大，形似龙牙而得名，具有个体肥厚而抱合紧密、颜色洁白而肉质细嫩、品质优良而营养丰富的优点，深受国内外消费者青睐(隆旺夫，1995)，为我国三大食用百合之一(赵健等，2017)。然而，在栽培过程中，龙牙百合常受到病毒病的侵染，导致其种球减产、花蕾畸形和凋落等，严重影响其产量和品质(徐榕雪，2007)。目前已经发现百合的病毒病原约有14种，其中以百合无症状病毒(Lily Symptomless Virus，LSV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus，CMV)、以及异名百合斑驳病毒(Lily Mottle Virus，LMoV)等3种病毒病是在百合种球生产中最普遍发生、危害严重的病毒(Kwon et al.，2013)。目前防治百合病毒病最有效的方法是利用病毒检测技术结合病毒脱除技术生产脱毒种球，并在生产中实时监测病毒的发生，防止其蔓延。因此，建立高效、快速、灵敏、准确的百合病毒检测技术至关重要。

目前常见的植物病毒病检测方法有指示植物法、电镜检测法、酶联免疫吸附法和分子生物学方法。

早期的植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法即指示植物检测法，即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式将待检测带毒植株的汁液接种到一种或几种指示植物上，观察其在指示植物上表现出的症状来进行检测的方法。但当从植物的直观性状表现上无法辨析感染病毒的类别时，就需要借助于显微镜进行更细微层次检测。一般通过对待测组织进行制样，借助负染色技术以及切片技术的应用进行观察，可以观测到病毒引起的寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究病毒病机理的重要手段之一(张伟等，2013)。但仪器设备比较昂贵，制片和操作技术复杂不易掌握，对操作人员技术水平要求较高(刘文洪等，2003)。随着免疫学的发展，建立了病毒检测的酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)，该方法具有快速、直观、费用较低等优点，逐渐成为病毒检测的主要方法。酶联免疫吸附法将植物病毒作为抗原，注射至动物体内产生抗体。每种病毒产生的抗血清具有特异性识别功能，可根据已知病毒的抗血清检测未知病毒。但纳克级别以下无法检测，且需制备高质量的抗血清，易出现假阴性(王继华等，2004)。此外，因抗原抗体反应具有专一性，但不同百合植株中病毒抗原会有所差异，所以常会漏检某一病毒或某一株系病毒。

分子生物学技术通过检测病毒遗传物质(RNA、DNA)确定病毒的存在，稳定性、灵敏性更高，适用于几乎所有植物病毒及类病毒的检测。早期的分子生物学病毒检测技术，主要指核酸杂交技术和双链RNA电泳技术，但技术难度较高，随着聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction，PCR)技术的快速发展，这两种方法逐渐被淘汰，基于PCR技术的病毒检测方法成为当前检测技术的主流。以核酸检测为代表的分子生物学检测技术主要包括PCR技术、多重PCR技术、荧光定量PCR技术及环介导等温扩增技术(LAMP)。

PCR是体外模拟体内基因复制的技术，能够在短时间内大量扩增目的DNA片段。其基本过程是：(1)双链DNA经过高温(95℃)变性，解链变成两条单链DNA；(2)单链D NA低温(与引物有关)复性，引物与单链DNA上的目的基因片段的启始位点互补结合；(3)72℃延伸，在引物的引导下和TaqDNA聚合酶的催化下，以目的DNA为模板，合成新的D NA链。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)则是在常规PCR基础上运用逆转录酶，将逆转录与基因扩增在一个反应管内进行。而多重PCR技术的基本原理与PCR类似，区别在于同一个反应体系中加入了2对以上的特异性引物，可以同时完成多个目的基因的扩增，这样一个反应体系就可以同时检测多个病毒，从而减少检测成本和时间。由于植物经常发生多种病毒复合侵染的情况，因此多重PCR检测方法在植物病毒检测中应用频繁。

迄今为止，针对百合感染的3种主要病毒(LSV、CMV、LMoV)的检测开发出了多种检测技术，其中最常用的手段为分子生物学技术，主要包括PCR技术、多重PCR技术和LA MP技术，以上方法虽然可以检测出百合感染的3种病毒，但在检测灵敏度和定量等方面存在劣势。多个研究团队通过优化多重RT-PCR反应条件，实现了同时快速检测LMoV、CMV和LSV病毒(王冲等，2006；徐榕雪等，2007；邹迎春等，2013；陈进，2013)。Zhao等人从百合斑驳病毒、百合无症病毒、黄瓜花叶病毒的CP基因上寻找保守区域，选择保守区域时避开所有的突变位点设计获得LAMP特异性引物，建立了百合病毒的LAMP和RT-LAMP检测体系(Zhao et al.，2018，2019)。但多重PCR技术因反应液中存在多对引物对，扩增时引物相互干扰，不同片段扩增效率不同，短片段优先扩增，而且易出现人工片段，出现非特异性扩增，无法判断是否存在假阳性，有时需添加假阳性检测步骤。此外，对于携带微量病毒的植物组织，RT-PCR方法的检测灵敏度还不能达到要求，另外，PCR产物还需要电泳和接触有毒试剂EB等。而LAMP4条引物只有与靶序列的6个区域完全匹配时，才能进行有效扩增，且低于100bp无法设计引物(杨丹等，2021)。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是PCR技术与荧光技术相结合的一种方法，其原理是将荧光染料或荧光标记的特异性探针加入到PCR反应体系中，根据荧光信号的积累实时监测整个PCR过程。灵敏度和特异性是诊断技术发展非常重要的指标(Torre et al.，2020)。相对于普通PCR和多重PCR，RT-qPCR特异性、敏感性和重复性更好，由于基因的扩增和检测同时进行，因此可对模板进行定性和定量分析(王森等，2021)，极大节省了检测时间。开发一种采用RT-qPCR检测百合是否感染LSV病毒的方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的方法可以缩短百合无症状病毒检测的时间，同时对低浓度病毒含量的龙牙百合组织样本，具有较好的检出率。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的引物对，包括核苷酸序列如SEQID NO.3所示的q-LSV-1-F引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的q-LSV-1-R引物。

本发明还提供上述的引物对在制备RT-qPCR检测百合无症状病毒的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的试剂盒，包括上述的引物对。

进一步地，所述试剂盒还包括内参引物Actin-F和Actin-R，核苷酸序列分别如SEQID NO.7-8所示。

本发明还提供上述的引物对或试剂盒在RT-qPCR检测百合无症状病毒中的应用。

本发明还提供一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取得到待检样品的总RNA，之后反转录得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，利用上述的引物对进行RT-qPCR反应，根据Ct值判断所述待检样品中是否含有百合无症状病毒：当15<Ct值<35时，为阳性，即为含有所述百合无症状病毒；当Ct值≥35时，为阴性，即为不含有所述百合无症状病毒。

进一步地，在步骤(2)中，所述RT-qPCR反应的反应体系包括：ddH₂O 3.6μL、qPCRSuper Mix 5μL、10μM上游引物0.2μL、10μM下游引物0.2μL和cDNA 1μL。

进一步地，在步骤(2)中，所述RT-qPCR反应程序为：94℃30s；94℃5s，60℃5s，65℃5s，40次循环。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以LSV基因组编码外壳蛋白(Coatprotein，CP)基因保守区域，设计特异性强的RT-qPCR检测引物，建立了一种高效的RT-qPCR检测方法，可为LSV的准确高效监测防控提供技术支持。

本发明建立的RT-qPCR法检测龙牙百合感染病毒的技术体系全程闭管，无需电泳观察，不仅减少了有毒试剂的接触，缩减了检测时间(约2h左右)，达到快速检测的目的，而且针对低浓度病毒含量的百合叶片组织样本具有较好的检出率。此外，整个检测过程采用荧光信号放大及计算机全程控制，有效减少了人为误差，并提高了灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为龙牙百合叶片总RNA电泳图；其中，M：DNA标准DL2000；1-3：总RNA；

图2为利用引物q-LSV-1-F和q-LSV-1-R得到的LSV及内参基因的RT-qPCR溶解曲线及扩增曲线；其中，a为溶解曲线；b为cDNA原液扩增曲线；c为cDNA原液稀释10×扩增曲线；d为cDNA原液稀释15×扩增曲线；

图3为利用引物q-LSV-2-F和q-LSV-2-R得到的LSV及内参基因的RT-qPCR溶解曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1.材料与方法

1.1材料

龙牙百合采集于万载县龙牙百合种植基地，种植在南昌师范学院生命科学学院花房，常规管理。戴乳胶手套，用洁净的剪刀取生长旺盛的百合叶片，每个样品3个生物学重复，锡箔纸包好并记录标记后，立即液氮冻存30min，置于-80℃冰箱，备用。

1.2方法

1.2.1龙牙百合总RNA的提取

RNA提取步骤参照多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒(带gDNA过滤器，北京金百特生物技术有限公司，货号：R318-50)说明书进行。提取过程中全程佩戴口罩和橡胶手套，以保证无菌和无RNA酶的实验环境。

1.2.2RNA质量及浓度的测定

用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，电泳结束后，再用Thermo NanoDrop2000紫外可见光分光光度计(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)检测浓度及纯度，检测方法按照仪器使用说明书进行。在RNA质量和浓度检测完之后，及时将其放入超低温冰箱中保存，备用。

1.2.3cDNA第一链的合成

反转录参照Uni One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuper Mi x(北京全式金，目录号：AU311-02)说明书，采用两步法完成第一链的合成。

1.2.4引物设计及合成

根据Gen Bank登录的侵染百合的LSV病毒的基因序列和内参18S rRNA，利用Primer Premier 5.0软件设计PCR和RT-qPCR反应及内参引物，引物分别见表1和表2，引物合成由擎科生物完成。

表1PCR反应引物序列

表2RT-qPCR反应及内参引物序列

1.2.5PCR技术初步检测百合感染病毒病情况

PCR Mix采用金牌Mix(擎科生物，货号：TSE101)。按照试剂盒说明书配制25μL反应体系，具体如下(表3)。

表3PCR反应体系

实验在Bio-RadT100 PCR仪中进行，其反应程序为：98℃2min；98℃10s，52℃15s，72℃15s，30个循环；72℃5min；4℃保存。

PCR反应结束后，分别采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送擎科生物测序，并采用BLAST进行序列比对，确定龙牙百合感染病毒情况。

1.2.6实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测龙牙百合感染病毒情况

将反转录获得的cDNA稀释10倍后，按照qRT-PCR按照试剂盒(北京全式金， II Green One-Step qRT-PCR Super Mix)说明书配制反应体系(10μL)，冰上避光操作。反应体系见表4。

表4qRT-PCR反应体系

以上试剂混匀后，置于Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪。反应程序采用两步法，具体如下：94℃30s；94℃5s，60℃5s，65℃5s，40次循环。65℃～95℃做溶解曲线。3个生物学重复和4个技术重复。内参基因反应体系同目的基因。

1.2.7特异性实验

利用q-LSV-F和q-LSV-R对含有百合无症病毒、黄瓜花叶病毒、百合斑驳病毒、车前草花叶病毒、葱黄条病毒、草莓潜环斑病毒和南芥菜花叶病毒的cDNA样品进行RT-qPCR检测，方法同1.2.6，以验证引物的特异性。

1.2.8病毒检测引物灵敏度测试

(1)质粒标准品检测

以梯度稀释的LSV病毒的质粒标准品为模板，利用q-LSV-F和q-LSV-R进行RT-qPCR检测，方法同1.2.6。

(2)龙牙百合cDNA样品检测

将龙牙百合cDNA样品分别进行梯度稀释，稀释成4个浓度梯度，然后进行实时荧光P CR扩增测试该方法对龙牙百合病毒检测灵敏度。

1.2.9数据处理及制图

利用SPSS 20.0进行数据统计与分析，采用2^-△△Ct法计算LSV病毒的相对表达量，并用Orgin8.0绘图。

2.结果

2.1龙牙百合叶片总RNA提取结果检测

经电泳检测后，表明所提取的RNA比较完整(图1)，可以清晰的看到18S和28S rRNA条带，表明RNA无降解现象。总RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在2.0左右，这表明无DNA和蛋白污染。以上结果表明所提取的核酸纯度较好，可以用于后续的实验。

2.2PCR检测百合感染病毒

1％琼脂糖凝胶电泳结果表明，引物LSV-F和LSV-R并未扩增到肉眼可见的目的条带。

2.3RT-qPCR检测结果

RT-qPCR检测结果见图2-3。

利用引物q-LSV-2-F和q-LSV-2-R进行RT-qPCR反应得到的溶解曲线图，如图3所示，可以看出，除了内参基因外，还有两个峰值，因此引物q-LSV-2-F和q-LSV-2-R并不适用。

利用引物q-LSV-1-F和q-LSV-1-R进行RT-qPCR反应，得到目的基因(LSV)以及内参基因Actin的扩增曲线及溶解曲线，如图2中a-b所示。可见，目的基因及内参基因分别在80℃和85℃左右有一个尖锐的溶解曲线峰值，这表明目的基因及内参基因所扩增的产物单一，无引物二聚体等杂质出现，此结果可以进一步利用Ct值进行进一步的相对定量分析。

结果判定：当15<Ct值<35时，为阳性，即为含有LSV病毒；当Ct值≥35时，为阴性，即为不含有LSV病毒。

目的基因及内参基因基本在20个循环后开始上升，走势基本一致。样本目的基因获得的Ct值在20-30之间，内参基因Ct值在26-28之间。综合以上结果可知，利用引物q-LSV-1-F和q-LSV-1-R进行RT-qPCR检测，结果可靠。

2.4特异性实验结果

利用q-LSV-F和q-LSV-R分别对含有百合无症病毒、黄瓜花叶病毒、百合斑驳病毒、车前草花叶病毒、葱黄条病毒、草莓潜环斑病毒或南芥菜花叶病毒的cDNA样品进行RT-qPCR检测，结果显示，仅有百合无症状病毒的cDNA出现扩增曲线，显示本发明的引物LSV-F和LSV-R特异性良好。

2.5灵敏度测试结果

(1)质粒标准品检测

以10⁹～10⁰梯度稀释的LSV病毒的质粒标准品为模板，利用q-LSV-F和q-LSV-R进行RT-qPCR检测，结果显示，检测下限为1.1×10¹copies/μL，表明本发明的RT-qPCR检测方法灵敏度高。

(2)龙牙百合cDNA样品检测

分别将龙牙百合cDNA稀释10×、15×、20×后，检测LSV病毒引物的灵敏度情况，结果见图2中c-d。可见，当cDNA稀释15×时，其RT-qPCR反应Ct值已经超过35。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示的q-LSV-1-F引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的q-LSV-1-R引物。

2.一种如权利要求1所述的引物对在制备RT-qPCR检测百合无症状病毒的试剂盒中的应用。

3.一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参引物Actin-F和Actin-R，核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7-8所示。

5.一种如权利要求1所述的引物对或如权利要求3或4所述的试剂盒在RT-qPCR检测百合无症状病毒中的应用。

6.一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取得到待检样品的总RNA，之后反转录得到cDNA；

(2)以所述cDNA为模板，利用权利要求1所述的引物对进行RT-qPCR反应，根据Ct值判断所述待检样品中是否含有百合无症状病毒：当15<Ct值<35时，为阳性，即为含有所述百合无症状病毒；当Ct值≥35时，为阴性，即为不含有所述百合无症状病毒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述RT-qPCR反应的反应体系包括：ddH₂O3.6μL、qPCRSuperMix5μL、10μM上游引物0.2μL、10μM下游引物0.2μL和cDNA1μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述RT-qPCR反应程序为：94℃30s；94℃5s，60℃5s，65℃5s，40次循环。