CN102443580A - 一种分离植物或微生物总rna的试剂组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学方法领域，涉及一种分离植物或微生物总RNA的试剂组合物及制备方法。以异硫氰酸胍、苯酚为主要成分，以NaCl、MgCl₂等提供阳离子，以醋酸钠-醋酸缓冲系统稳定溶液pH，经氯仿简单抽提后，即可得高质量的RNA。由于本发明的RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，与同类试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能有效分离。使核酸沉降过程短时间内即可完成，免除了-20℃沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间。该方法快捷、高效，适用样品广泛，比商业化TRIzol试剂更为廉价。克服了传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点。且操作更为灵活，样品匀浆后可于-20℃保存3天再进行RNA的提取。

Description

一种分离植物或微生物总RNA的试剂组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，涉及一种细胞总RNA的制备方法，具体涉及一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌总RNA的试剂组合物及其制备方法。

背景技术

RNA是参与细胞基因表达的主要成分，在整个遗传信息的维持和表达过程中扮演着十分重要的角色。在现代分子生物学研究中，RNA分离已成为许多试验不可或缺的技术手段。分离得到的RNA质量的高低也将直接影响后续试验的进行。而RNA由于其自身的生物学特性，存在易降解、难保存的特点。提取过程中也容易被蛋白质、DNA和其他细胞代谢物污染。因此一种能够分离得到完整高纯度RNA的方法一直是分子生物学工作者所希望实现的目标，其对分子生物学研究亦具有重要意义。

有关RNA的提取方法很多，依据RNA分离原理大致可以分为：密度梯度离心，化学沉降和介质吸附三大类。密度梯度离心法对离心设备要求高，操作繁琐且处理的样品非常有限，已经基本不再使用；化学沉降类方法中主要包括：CTAB法、SDS-酚法、异硫氰酸胍-酸酚-氯仿法。其中CTAB法和SDS-酚法在对植物、真菌等样品的RNA提取中使用较多，其提取原理主要是：利用CTAB、SDS等阴/阳离子去污剂裂解细胞膜，释放核酸，同时抑制RNA酶的活性。Tris-HCl、EDTA缓冲体系维持溶液pH值，稳定核酸。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)则能有效与多酚类物质结合，防止其氧化产物——醌类物质对核酸的破坏。随后经乙醇和LiCl两轮沉降得到RNA。由于LiCl对RNA的沉降具有一定特异性，绝大部分多糖、次生代谢物等杂质便在沉降过程中被除去，从而得到较纯的RNA。该方法在处理富含多糖多酚类复杂样品时仍然可以得到令人满意的结果，然而对于大量样品的处理，此类方法仍嫌繁琐，操作时间也较长。并且CTAB法和SDS-酚法均无法用于动物组织总RNA的提取。异硫氰酸胍的应用使这一状况得到改观，由于异硫氰酸胍具有极强的蛋白质变性能力，能够在裂解细胞的同时使RNA酶迅速失活，从而克服了以上方法裂解能力不足的问题，极大地保证了核酸的完整性。异硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法就是在此基础上发展起来的一种快速分离RNA的方法，首先由Chomczynski及其同事于1987报道，并历经数次改进。该方法适用大多数动植物样品，得到的RNA完整性好，并可在短时间内完成操作，几乎成为常规RNA提取的标准方法，使用也最为广泛。商业化的TRIzol试剂及其分离方法就建立在此基础之上，它比常规的异硫氰酸胍-酸酚-氯仿抽提法更为快捷和高效，然而其价格也较为昂贵，不利于常规大量样品的处理。介质吸附类方法是近年来迅速崛起的RNA分离方法，其主要原理是利用核酸在高盐低pH溶液环境下与硅胶膜表面-OH基团形成盐桥从而使核酸结合于硅胶膜表面。经一系列洗涤过程除去蛋白质和溶液中的盐，最后在低盐高pH条件下将核酸从硅胶膜上洗脱，从而分离得到RNA。这种方法可在极短时间内完成RNA的分离，并且得到的RNA纯度高、质量好，因而得到越来越广泛的应用。然而此种方法难以避免DNA的污染。由于是利用硅胶膜吸附溶液中的RNA，硅胶膜的吸附能力和吸附面积成为影响RNA得率的重要因素，不可避免的损失使得这种方法的得率并不优于化学沉淀类方法。而且这种损失对于分子量小的RNA来说尤为严重。限制了其在一些生物学实验中的应用，如小分子RNA干扰等。到目前为止，针对特殊样品的RNA提取方法的研究从未终止，一种简便、高效、廉价而又能够适应广泛样品的RNA提取技术一直是研究者们所追求的目标。

发明内容

本发明的目的在于克服传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点，提供一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌总RNA的试剂组合物及其制备方法。本发明的核心是建立一种快速、高效而又廉价的RNA提取方法。该方法适合分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌总RNA的方法，由于该方法向RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，故与同类型试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能够有效分离得到。同时使核酸沉降过程在短时间内即可完成，免除了-20℃沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间。该方法适用样品广泛，且比商业化TRIzol试剂更为廉价。样品匀浆后若不立即进行RNA提取可放于-20℃保存至少3天。

申请人经过大量研究和对比试验，优选出满足本发明目的的RNA提取试剂组合物及方法。本发明的RNA纯化试剂组合物包括以下组分：

1)溶液A：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.醋酸钠0.1mol/L

c.氯化钠0.25mol/L；

d.氯化镁10mmol/L；

e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7％；

f.糖原60μg/ml

g.按体积/体积计β-巯基乙醇0.5％

2)溶液B：水饱和酚(pH4.0-5.0)；

3)裂解液：

a.按体积/体积计，溶液A 50％-55％；

b.按体积/体积计，溶液B 50％-45％；

c.按重量/体积比计甲基红0.2‰；

将溶液A和溶液B按照体积比1∶1混合后，加入甲基红固体粉末使溶液呈玫瑰红色为裂解液，即得到本发明所述的试剂组合物。

2、申请人建立了一种从柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌中提取总RNA方法，其步骤包括：

按照前述的配方量制备RNA纯化试剂组合物(配方见上所述)，备用。

(1)样品裂解

根据样品称重，按照每0.1g样品添加1ml裂解液的比例吸取裂解液于离心管中，将样品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置5min，然后置于冰上直至所有样品匀浆完成。不立即进行RNA提取的样品可将匀浆置于-20℃保存；

(2)抽提

按每1ml裂解液添加200μl氯仿的比例向匀浆中加入氯仿，剧烈震荡使溶液呈乳浊状，冰上静置5min后于4℃下离心，离心后吸取上层水相于新离心管中并加入等体积氯仿再次抽提，离心，除去水相中残余的酚；

(3)沉降RNA

吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇，冰上至室温25℃放置10min后，离心回收RNA；

(4)洗涤溶解RNA

在室温条件下，用浓度为75％的乙醇使RNA沉淀悬浮，洗涤1-2次后，将其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的去离子水中。

本发明的特点在于：以异硫氰酸胍、苯酚为主要成分，以NaCl、MgCl2等提供阳离子，以醋酸钠-醋酸缓冲系统稳定溶液pH值，经氯仿简单抽提后，即可得到高质量的RNA。由于本发明的RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，故与同类型试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能够有效分离得到。同时使核酸沉降过程在短时间内即可完成，免除了-20℃沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间。该方法快捷、高效，适用样品广泛，且比商业化TRIzol试剂更为廉价。克服了传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点。且操作更为灵活，样品匀浆后可于-20℃保存3天再进行RNA的提取。

本发明的效果是：

1、能够在短时间内从样品中分离得到高纯度的RNA。

2、操作步骤简单，易于大量样品的处理。

3、适用样品广泛，对大部分植物、微生物及部分动物样品均有较好的提取效果。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是来源于毛果杨(Populus trichocarpa)的Actin 9基因的mRNA片段，序列全长为1726bp。

序列表SEQ IDNO：2和SEQ IDNO：3是扩增Actin 9基因的引物对。

序列表SEQ ID NO：4是来源于毛果杨(Populus trichocarpa)的Actin 1基因的mRNA片段，序列全长为1819bp。

序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是扩增Actin 1基因的引物对。

图1为：墨西哥株檬(Citrus aurantifolia)叶片总RNA非变性琼脂糖电泳效果(1×TAE，1.2％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，MD103-02)，2-5为实验重复。

图2为：本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片总RNA非变性琼脂糖电泳效果(1×TAE，1.2％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，MD103-02)，2-3为实验重复。

图3为：梨腐烂病菌(Valsa ambiens(Pers)Fr)菌丝总RNA非变性琼脂糖电泳效果(1×TAE，1.2％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，MD103-02)，2-5为实验重复。

图4为：不同方法提取得到的墨西哥株檬叶片总RNA非变性琼脂糖电泳效果(1×TAE，1.2％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，MD103-02)，2为：CTAB-LiCl法得到的总RNA，3为：本方法得到的总RNA，4为：使用RNAisoReagent试剂(TaKaRa，D312)得到的总RNA，5为：SDS-酚法得到的总RNA，6为：使用Trizol试剂得到的总RNA，7为：异硫氰酸胍-酸酚法得到的总RNA

图5为：RT-PCR扩增墨西哥株檬Actin基因片段琼脂糖电泳效果(1×TAE，2％)，图中1为分子量标准(TIANGEN，MD109-02)，2-5为：引物β-Actin(T52)扩增产物，6-9为：引物β-Actin(T60)扩增产物图6为：试剂性状，左为1ml溶液于1.5ml离心管中效果，右为加入氯仿分层后的效果。

具体实施方式

实施例1本发明的应用实施例应用RT-PCR扩增墨西哥株檬(Citrus aurantifolia)Actin基因片段

本实施例中墨西哥株檬叶片采集于华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心，墨西哥株檬植株为温室盆栽植株。该品种为商业化品种和生产上广泛应用的品种(材料)，公众如果需要，华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心可以对外发放该品种的材料。

一、RNA提取使用的试剂组合物的配制

1)糖原溶液(10mg/ml)

用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的去离子水将糖原粉末溶解后，定容于15mg/ml。依次先后用DNA酶(购自宝大连生物工程有限公司，即TaKaRa公司)、RNA酶(购自宝生物工程大连有限公司)及蛋白酶K(购自宝生物工程大连有限公司)进行消化处理，除去药品中的DNA、RNA及蛋白质污染。使用等体积水饱和酚抽提一次，用等体积氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提两次后，用DEPC处理过的去离子水将糖原溶液稀释至10mg/ml，分装于小份，-20℃保存。

2)溶液A：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.醋酸钠0.1mol/L；

c.氯化钠0.25mol/L；

d.氯化镁10mmol/L；

e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7％；

f.糖原60μg/ml

g.按体积/体积计β-巯基乙醇0.5％

将以上固体粉末准确称量并溶解后，加入已配制好的10mg/ml糖原溶液使其在溶液中的终浓度达到60μg/ml。添加β-巯基乙醇后用冰醋酸调节溶液pH至4.6左右。最后用DEPC处理过的去离子水定容。

3)溶液B：水饱和酚(pH5.0)

4)裂解液：

a.按体积/体积计溶液A 50％-55％

b.按体积/体积计溶液B 50％-45％

c.按重量/体积计甲基红0.2‰

将溶液A和溶液B按照体积比1∶1混合后，加入甲基红固体粉末使溶液呈玫瑰红色为裂解液，即得到本发明所述的试剂组合物。

二、提取墨西哥株檬叶片总RNA

1、准确称取0.1g墨西哥株檬(该品种是一个公开使用的商业化品种)叶片样品，液氮研磨后迅速加入含1ml裂解液的离心管中，剧烈震荡匀浆。

2、室温下放置5分钟后，将离心管置冰上，直至所有样品匀浆完毕。

3、在4℃，12000g下离心5分钟。

4、将上清转移至新离心管，弃去管底残渣。

5、向每个离心管中加入200μl氯仿，剧烈震荡20秒使溶液呈乳状。

6、冰上放置10分钟后于4℃，不低于12000g下离心15分钟。

7、小心吸取上层无色水相至新离心管中，加入等体积氯仿再抽提一次。

8、4℃，不低于12000g下离心10分钟。

9、小心吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇。冰上放置10分钟。

10、在4℃，8000g下离心10分钟后回收RNA沉淀。

11、倒掉上清，加入1ml 75％乙醇使沉淀悬浮，洗涤沉淀。

12、在8000g室温离心5分钟回收沉淀。

13、重复步骤11-13。

14、完全除去上清，室温静置15-20分钟使RNA沉淀干燥。

15、将沉淀溶于DEPC处理过的去离子水中，于-80℃下保存

本实施例经4次重复得到的总RNA得率平均为3090μg/g组织，4次重复分离得到的总RNA其A_260/280值均在2.06-2.10之间，其A_260/230比值均在2.09-2.19之间，电泳条带正常(见图1)。

三、cDNA合成

使用DNase I试剂(购自宝生物工程大连有限公司)对提取得到的总RNA进行消化，具体步骤参照该公司的产品说明书进行。

利用Oligo dT引物进行cDNA的合成，具体步骤如下：

1、取2μg消化后的总RNA，加入1μl Oligo(dT)_12-18(100μM)(上述材料或试剂均购自Fermentas公司产品)引物后，加入DEPC水至总体积10μl。

2、70℃水浴10min后迅速在冰上急冷5min。

3、瞬时离心后在离心管中加入反转录反应溶液：5μl 5×M-MLV Reaction Buffer、1μl M-MLV(200U/μl)(购自Promega公司产品)、6μl dNTP(10mM.)(购自Roche公司产品)、0.5μl RRI RNase inhibibtor(40U/μl)(宝生物工程大连公司产品)、2.5μl DEPC-H₂O。

4、42℃水浴1小时后70℃处理10min使反转录酶失活。

5、5倍稀释后分装成小分保存于-20℃

四、PCR扩增Actin基因片段

RT-PCR扩增内参基因Actin片段，根据NCBI数据库中已有的Actin 9基因序列(基因登录号：XM_002331844)设计如下的一对引物，其DNA序列如下：

β-Actin(T52)-F：5’-TCTATTCCAGCCATCTCTC-3’(序列表编号SEQ ID NO：2)，

β-Actin(T52)-R：5’-GACCCTCCAATCCAAAC-3’(序列表编号SEQ ID NO：3)。

序列全长为1726bp，其物种为毛果杨(Populus trichocarpa)，杨属植物，其mRNA片段如下所示(序列表编号SEQ ID NO：1)：

CTCTCTCTCTCTTTCTCTCTCGCACCAGCAACCGCAATACAAACAAGCAATTTAGGCCAGGCCACGTCTATAGCTAGATTTGGCTTGGTTC

GTTCTCTGATTATTCTCTCTTATACTTTTTTTGCACAGAACTTGTAGAAAATGGCCGATTCTGAGGATATTCAGCCCCTTGTCTGCGACAA

TGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCTGGGGATGATGCTCCCAGGGCAGTGTTTCCAAGTATTGTGGGTAGACCAAGACACACTGGT

GTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCTTATGTTGGTGACGAAGCACAATCTAAGAGAGGTATCTTGACCTTGAAATACCCTATTGAGC

ATGGTATTGTTAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACACTTTCTACAATGAGCTTCGTGTTGCTCCTGAGGAGCACCCAGT

CCTCCTTACAGAGGCTCCTCTTAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGATGACTCAAATCATGTTTGAGACCTTCAATGTGCCTGCAATGTAT

GTTGCTATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACTGGTATTGTGCTGGATTCTGGTGATGGTGTGTCTCACACTGTGC

CCATCTATGAAGGGTATGCCCTTCCACATGCCATCCTTCGTTTGGATCTTGCTGGTCGTGATCTCACTGATGCTTTGATGAAGATCCTCAC

CGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCGTGACATGAAGGAGAAACTTGCATATGTTGCCCTTGACTATGAG

CAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGTAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTATGAGCTACCTGATGGTCAGGTCATCACCATTGGAGCTGAGAGAT

TCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCATCTCTCATCGGAATGGAAGCTGCTGGTATCCACGAGACTACTTACAATTCTATCATGAAGTG

TGATGTGGATATCAGAAAGGATCTATATGGTAATATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATGTTCCCTGGTATTGCTGACCGTATGAGCAAG

GAAATCACTGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTTGCACCACCAGAGAGAAAATACAGTGTCTGGATTGGAGGGTCAATCC

TTGCATCTCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGTACGACGAGTCTGGCCCATCCATCGTCCACAGGAAGTGCTTCTA

AGTTCCGAACAGTGCGGTGATGGTGAGTTCTTTCTTTCTATTTAGTTGGCTTTTTTCGTGTCAAGGTGTCATGAACTCAAAGTCCTAGTTG

ATATGGAGAATTTGTTGAGGTGGGGGTCATTGAAGGAGGGAACATTCTGATATTCAATGTATCGAATAGGCTTGTGATTCGATGTTGTTAT

TGCTGCTTTTTAAGATGCGCAACTGTAATGGTCCTCCCTCTCGATGTGGTGGTCAGACACTTTGGTAGTCAAGCTCTTTGCTTTCTTCCAC

ATCATCTGTGGTTCAACCTTGCGTCTTTTTAGTAGGATGCTTGTAGACGGAGAGTGGTTGTGATGATGCTTTTTTATTTTTATTTTTTTTT

CCATCTCAACATTTGAAGGTGTTTTTTTCCTTGGGAACATTAATGTTAATAGTTATTGTATGAGAAATTTTGTGTTAGTGTCAATTTG

根据登录号：XM_002298674报道的Actin 1基因序列作为RT-PCR扩增内参基因Actin片段，设计了如下另一对引物对，其DNA序列如下：

β-Actin(T60)-F：5’-ATCTGCTGGAAGGTGCTGAG-3’(序列表编号SEQ ID NO：5)，

β-Actin(T60)-R：5’-CCAAGCAGCATGAAGATCAA-3’(序列表编号SEQ ID NO：6)。

序列全长为1819bp，其物种为毛果杨(Populus trichocarpa)，杨属植物，其mRNA片段如下所示(序列表编号SEQ ID NO：4)：

AACCCTTACACTCCTCCATTTTCGTCTCACCCTCTCTCTCGAGCGCAACCACCAGCTAGCAAGTCAGGCAGGCCACATCTTTCGCTAGACT

TGGCTTGGTCTGTTTCGCTCTCTGTCTCTAGATATCTCCTCTGTCTCCGACTTCAAAAGAATTTGTAGAAAATGGCCGATGCCGAGGATAT

TCAACCCCTTGTCTGTGACAATGGAACTGGAATGGTGAAGGCTGGGTTTGCAGGTGATGATGCACCCAGGGCAGTGTTTCCCAGTATTGTG

GGTAGACCAAGACACACTGGTGTCATGGTTGGAATGGGGCAGAAGGATGCCTATGTTGGTGATGAAGCACAATCTAAAAGAGGTATCTTGA

CCTTGAAATACCCCATTGAGCACGGTATTGTAAGCAACTGGGATGATATGGAGAAGATTTGGCATCACACTTTCTACAATGAGCTTCGTGT

TGCTCCTGAAGAGCACCCAGTCCTCCTGACTGAGGCTCCCCTCAACCCTAAGGCTAACAGAGAGAAGATGACTCAAATTATGTTTGAGACC

TTCAATGTTCCTGCAATGTATGTTGCCATCCAGGCTGTCCTTTCCCTGTATGCCAGTGGTCGTACAACTGGTATTGTGTTGGATTCTGGTG

ATGGTGTGAGTCACACTGTGCCAATCTATGAAGGTTATGCCCTTCCACACGCCATCCTTCGTTTGGATCTTGCTGGTCGTGACCTCACCGA

TGCTTTGATGAAGATTCTGACTGAGAGAGGTTACATGTTCACCACCACTGCTGAACGGGAAATTGTCCGTGATATGAAGGAGAAACTTGCG

TATGTTGCCCTCGACTACGAGCAGGAGCTTGAGACTGCCAAGAGCAGCTCCTCTGTTGAGAAGAACTACGAGCTTCCTGATGGTCAGGTCA

TCACCATCGGAGCTGAGAGATTCCGTTGCCCAGAAGTCCTCTTCCAGCCTTCTCTCATTGGAATGGAAGCTGCTGGCATCCACGAGACTAC

ATACAACTCAATCATGAAGTGTGATGTGGATATTAGAAAGGATCTGTATGGTAACATTGTGCTCAGTGGTGGTTCCACTATGTTCCCTGGT

ATTGCTGACCGAATGAGCAAGGAGATCACCGCCCTTGCCCCAAGCAGCATGAAGATCAAGGTGGTTGCACCACCAGAGAGAAAGTACAGTG

TCTGGATTGGAGGATCTATCCTTGCTTCCCTCAGCACCTTCCAGCAGATGTGGATTTCCAAGGGTGAGTATGATGAGTCTGGCCCATCCAT

TGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAGTTCTACAAGTGCTTTGATGGTGAGTTCTTTTTCCTATTTAGTTGGCTTTTTTCGTGTCAAGGTGTCAT

GAACTCAAAGTCCTGGTTGATATGGAGAATTTATTGAGGTGGGGGTCACTGAAGGAGAAGGGAACATTCTGATCTTCTATGTATCGAATAG

GCCTGTGATTCAATGTTGATATCGCTGCCATTTGTGAAGCTTAAACTGTAATGGTCCTCCCTCCGGATGTGGTGGGCAGACAGACACTTTG

GTAATCAAGTTCTTTGCTTCCCTCACATCATCACCAATGGTTCAACCTTGTGTCTTTTTTAGTAGGATGCTTGTAGTCGGAGAGTGATTGT

GATGATGCTTTTCTATTTTTATTTTTTTTCCATCTCGACATTTGAAGGGTTTATTTTTTTTTCCTGGGAACATTAATGTTAATAGTTATTG

TATGAGAAATTTTATGTTAGTGTCAATTTGCTTTCATAAACCCTATGGAAATCATATTTAATACTTTTGTTTGAACTTTGAATTGATCTT

PCR反应体系如下：

其中Taq酶及10×PCR缓冲液(Buffer)均为宝生物工程大连有限公司产品，dNTP为Roche公司产品。两对引物的退火温度分别为52℃和60℃，扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，循环30次后72℃延伸10min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后表明均能扩增得到预期大小为252bp和110bp的片段，扩增效果良好(见图5)。经克隆后测序表明扩增产物为Actin基因片段无误。

实施例2使用本发明的试剂组合物快速提取不同柑橘品种叶片总RNA

本实施例中下列柑橘类植物如酸橙(Citrus aurantium)、甜橙(Citurs sinensis)、葡萄柚(Citrus paradisi)、香橼(Citrus medica)、温州蜜柑(Citrus unshiu)、枳壳(Poncirus trifoliate)等柑橘样本均采集于华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心，这些品种都是十分常见的生产品种(或材料)或商业品种(或材料)，公众如果需要，华中农业大学国家果树脱毒种质资源室内保存中心可以对外发放上述品种或材料。

一、RNA试剂组合物的配制

1)糖原溶液(10mg/ml)

用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水将糖原粉末溶解后，定容于15mg/ml。依次先后用DNA酶(宝生物工程大连有限公司)、RNA酶(宝生物工程大连有限公司)及蛋白酶K(宝生物工程大连有限公司)进行消化处理，除去药品中的DNA、RNA及蛋白质污染。使用等体积水饱和酚抽提一次，用等体积氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提两次后，用DEPC处理过的去离子水将糖原溶液稀释至10mg/ml，分装于小份，-20℃保存。

2)溶液A：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.醋酸钠0.1mol/L；

c.氯化钠0.25mol/L；

d.氯化镁10mmol/L；

e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7％；

f.糖原60μg/ml

g.按体积/体积计β-巯基乙醇0.5％

将以上固体粉末准确称量并溶解后，加入已配制好的10mg/ml糖原溶液使其在溶液中的终浓度达到60μg/ml。添加β-巯基乙醇后用冰醋酸调节溶液pH至4.6左右。最后用DEPC处理过的去离子水定容。

3)溶液B：水饱和酚(pH5.0)

4)裂解液：

a.按体积/体积计溶液A 50％-55％

b.按体积/体积计溶液B 50％-45％

c.按重量/体积计甲基红0.29‰

将溶液A和溶液B按照体积比1∶1混合后，加入甲基红固体粉末使溶液呈玫瑰红色为裂解液，即得到本发明所述的试剂组合物。

二、提取墨西哥株檬叶片总RNA

1、准确称取0.1g叶片样品，液氮研磨后迅速加入含1ml裂解液的离心管中，剧烈震荡匀浆。

2、室温下放置5分钟后，将离心管置冰上，直至所有样品匀浆完毕。

3、在4℃，12000g下离心5分钟。

4、将上清转移至新离心管，弃去管底残渣。

5、向每个离心管中加入200μl氯仿，剧烈震荡20秒使溶液呈乳状。

6、冰上放置10分钟后于4℃，不低于12000g下离心15分钟。

7、小心吸取上层无色水相至新离心管中，加入等体积氯仿再抽提一次。

8、4℃，不低于12000g下离心10分钟。

9、小心吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇。冰上放置10分钟。

10、在4℃，8000g下离心10分钟后回收RNA沉淀。

11、倒掉上清，加入1ml 75％乙醇使沉淀悬浮，洗涤沉淀。

12、在8000g室温离心5分钟回收沉淀。

13、重复步骤11-13。

14、完全除去上清，室温静置15-20分钟使RNA沉淀干燥。

15、将沉淀溶于DEPC处理过的去离子水中，-80℃保存

本实施例每个样品经3次重复分离得到的总RNA其A_260/280值在1.89-2.10之间，其A_260/230比值均在1.95-2.11之间，得率在1583.4-2649.5μg/g组织之间(见表1)

表1本发明对不同柑橘品种总RNA的提取效果

柑橘品种	拉丁文名	得率(μg/g组织)	吸光值A260/230	吸光值A260/280
					酸橙	Citrus aurantium	2309.3±27.9	2.08±0.07	1.93±0.07
甜橙	Citurs sinensis	2649.5±58.3	2.01±0.06	1.89±0.07
					葡萄柚	Citrus paradisi	2127.2±39.6	2.08±0.08	1.96±0.03
枳壳	Poncirus trifoliate	1938.7±43.8	1.95±0.07	2.08±0.02
					温州蜜柑	Citrus unshiu	1679.7±36.2	2.11±0.03	1.95±0.05
香橼	Citrus medica	1583.4±29.5	2.06±0.09	2.10±0.06

实施例3使用本发明的试剂组合物快速提取本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片总RNA

本实施例中本氏烟叶片采集于华中农业大学国家脱毒中心及种质资源室内保存中心。

一、溶液配制

需配制以下试剂组合物以供RNA提取使用：

1)糖原溶液(10mg/ml)

用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水将糖原粉末溶解后，定容于15mg/ml。依次先后用DNA酶(购自TaKaRa公司)、RNA酶(购自TaKaRa公司)及蛋白酶K(购自TaKaRa公司)进行消化处理，除去药品中的DNA、RNA及蛋白质污染。使用等体积水饱和酚抽提一次，用等体积氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提两次后，用DEPC处理过的去离子水将糖原溶液稀释至10mg/ml，分装于小份，-20℃保存。

2)溶液A：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.醋酸钠0.1mol/L；

c.氯化钠0.25mol/L；

d.氯化镁10mmol/L；

e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7％；

f.糖原60μg/ml

g.按体积/体积计β-巯基乙醇0.5％

将以上固体粉末准确称量并溶解后，加入已配制好的10mg/ml糖原溶液使其在溶液中的终浓度达到60μg/ml。添加β-巯基乙醇后用冰醋酸调节溶液pH至4.6左右。最后用DEPC处理过的去离子水定容。

3)溶液B：水饱和酚(pH4.0)

4)裂解液：

a.按体积/体积计溶液A 50％-55％

b.按体积/体积计溶液B 50％-45％

c.按重量/体积计甲基红0.2‰

将溶液A和溶液B按照体积比1∶1混合后，加入甲基红固体粉末使溶液呈玫瑰红色为裂解液，即得到本发明所述的试剂组合物。

二、提取本氏烟叶片总RNA

1、准确称取0.1g叶片样品，液氮研磨后迅速加入含1ml裂解液的离心管中，剧烈震荡匀浆。

2、室温下放置5分钟后，将离心管置冰上，直至所有样品匀浆完毕。

3、在4℃，12000g下离心5分钟。

4、将上清转移至新离心管，弃去管底残渣。

5、向每个离心管中加入200μl氯仿，剧烈震荡20秒使溶液呈乳状。

6、冰上放置10分钟后于4℃，不低于12000g下离心15分钟。

7、小心吸取上层无色水相至新离心管中，加入等体积氯仿再抽提一次。

8、4℃，不低于12000g下离心10分钟。

9、小心吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇。冰上放置10分钟。

10、在4℃，8000g下离心10分钟后回收RNA沉淀。

11、倒掉上清，加入1ml 75％乙醇使沉淀悬浮，洗涤沉淀。

12、在8000g室温离心5分钟回收沉淀。

13、重复步骤11-13。

14、完全除去上清，室温静置15-20分钟使RNA沉淀干燥。

15、将沉淀溶于DEPC处理过的去离子水中，-80℃保存

本实施例经2次重复得到的RNA其A_260/280值均在2.0左右，其A_260/230比值均在2.05左右，电泳条带正常(见图2)，满足分子生物学实验需要。

实施例4使用本发明的试剂组合物快速提取梨腐烂病菌(Valsa ambiens(Pers)Fr)菌丝总RNA

本实施例中梨腐烂病菌(Valsa ambiens(Pers)Fr)茎杆样本采集自北京市顺义区试验站，经分离后于常用的PDA培养基(PDA培养基的组分及配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min)上培养6天后用于梨腐烂病菌丝总RNA的提取。

一、溶液配制

需配制以下试剂组合物以供菌丝总RNA提取使用：

1)糖原溶液(10mg/ml)

用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水将糖原粉末溶解后，定容于15mg/ml。依次先后用DNA酶(购自宝生物工程大连有限公司)、RNA酶(购自宝生物工程大连有限公司)及蛋白酶K(购自宝生物工程大连有限公司)进行消化处理，除去药品中的DNA、RNA及蛋白质污染。使用等体积水饱和酚抽提一次，用等体积氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)抽提两次后，用DEPC处理过的去离子水将糖原溶液稀释至10mg/ml，分装于小份，-20℃保存。

2)溶液A：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.醋酸钠0.1mol/L；

c.氯化钠0.25mol/L；

d.氯化镁10mmol/L；

e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7％；

f.糖原60μg/ml

g.按体积/体积计β-巯基乙醇0.5％

将以上固体粉末准确称量并溶解后，加入已配制好的10mg/ml糖原溶液使其在溶液中的终浓度达到60μg/ml。添加β-巯基乙醇后用冰醋酸调节溶液pH至4.6左右。最后用DEPC处理过的去离子水定容。

3)溶液B：水饱和酚(pH5.0)

4)裂解液：

a.按体积/体积计溶液A 50％-55％

b.按体积/体积计溶液B 50％-45％

c.按重量/体积计甲基红0.2‰

将溶液A和溶液B按照体积比1∶1混合后，加入甲基红固体粉末使溶液呈玫瑰红色为裂解液，即得到本发明所述的试剂组合物。

二、提取梨腐烂病菌菌丝总RNA

1、准确称取0.1g梨腐烂病菌丝样品，液氮研磨后迅速加入含1ml裂解液的离心管中，剧烈震荡匀浆。

2、室温下放置5分钟后，将离心管置冰上，直至所有样品匀浆完毕。

3、在4℃，12000g下离心5分钟。

4、将上清转移至新离心管，弃去管底残渣。

5、向每个离心管中加入200μl氯仿，剧烈震荡20秒使溶液呈乳状。

6、冰上放置10分钟后于4℃，不低于12000g下离心15分钟。

7、小心吸取上层无色水相至新离心管中，加入等体积氯仿再抽提一次。

8、4℃，不低于12000g下离心10分钟。

9、小心吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇。冰上放置10分钟。

10、在4℃，8000g下离心10分钟后回收RNA沉淀。

11、倒掉上清，加入1ml 75％乙醇使沉淀悬浮，洗涤沉淀。

12、在8000g室温离心5分钟回收沉淀。

13、重复步骤11-13。

14、完全除去上清，室温静置15-20分钟使RNA沉淀干燥。

15、将沉淀溶于DEPC处理过的去离子水中，-80℃保存

本实施例经4次重复得到的梨腐烂病菌丝总RNA其A_260/280比值及A_260/230比值在2.00左右，电泳条带正常(见图3)，满足分子生物学实验需要。

实施例5本发明与对照方法对墨西哥株檬(C.aurantifolia)叶片总RNA提取效果比较

本实施例涉及本发明与现有其他方法(包括SDS-酚法、CTAB-LiCl法、异硫氰酸胍法、Invitrogen公司Trizol试剂及TaKaRa公司RNAiso Reagent提取方法)对墨西哥株檬叶片提取总RNA效果进行了比较。样品来源同实施例1，对照方法操作步骤详见参考文献所述及的试剂公司提供的试剂使用说明书。

试验结果表明对杂质含量高的较老叶片，不同方法的提取效果开始出现较大差别。CTAB-LiCl法虽然能够得到完整的RNA，然而DNA污染严重，得率亦较低；SDS-酚法得到的RNA含有不溶物，RNA沉淀亦带有颜色，电泳条带不够清晰；使用TaKaRa公司RNAiso Reagent试剂及异硫氰酸胍-酸酚法得到的RNA电泳后未见明显RNA条带；Trizol法得到的RNA经电泳后虽带型正常，然而亦有明显DNA污染；本方法得到的RNA无论是在得率、吸光值及电泳带型上均优于其他方法得到的RNA(见图4，表2)，且耗时短、成本低、操作简单快捷。

表2.本发明与对照方法对墨西哥株檬叶片RNA提取效果

参考文献

1.Arun Dev Sharma，Prabhjot Kaur Gill，and Prabhjeet Singh：RNA isolation from plant tissues rich inpolysaccharides.Analytical Biochemistry，2003，314：319-321.

2.Iandolino AB，da Silva FG，Lim H，Choi H，Williams LE，Cook DR：High-quality RNA，cDNA，andderived EST libraries from grapevine(Vitis vinifera L.).Plant Molecular Biology Reporter，2004，22：269-278.

3.Karen E Reid，Niclas Olsson，James Schlosser，Fred Peng and Steven T Lund：An optimized grapevine RNAisolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berrydevelopment.BMC Plant Biology，2006，6：27.

4.Kam-Lock Chan，Chai-Ling Ho，Parameswari Namasivayam and Suhaimi Napis：A simple and rapid methodfor RNA isolation from plant tissues with high phenolic compounds and polysaccharides.Nature Protocols，2007.

5.Piotr Chomczynski，Nicoletta Sacchi：The single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction：twenty-something years on.Nature Protocols，2006，1：581-585.

6.Puissant C，Houdebine LM：An improvement of the single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-choroform extraction.Biotechniques.1990，8(2)：148-9.

7.Vineeta Ral，Jayadrl Sekhar Ghosh，Nrlslngha Dey：Isolation of total RNA from hard bamboo tissue rich inpolyphenols and polysaccharides for gene expression studies.Electronic Journal of Biotechnology，2010.

8.Zeng Y，Yang T：RNA isolation from highly viscous samples rich in polyphenols and polysaccharides.PlantMolecular Biology Reporter，2002，20：417.

Claims (2)

1.一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌丝体总RNA纯化试剂组合物，其特征在于，包括以下组分：

1)溶液A：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.醋酸钠0.1mol/L；

c.氯化钠0.25mol/L；

d.氯化镁10mmol/L；

e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7％；

f.糖原60μg/ml；

g.按体积/体积计β-巯基乙醇0.5％

2)溶液B：pH4.0-5.0的水饱和酚；

3)裂解液：

a.按体积/体积计，溶液A 50％-55％；

b.按体积/体积计，溶液B 50％-45％；

c.按重量/体积比甲基红0.2‰；

将溶液A和溶液B按体积比1∶1混合后，加入甲基红使溶液呈玫瑰红色，即为所述的裂解液。

2.一种分离柑橘类植物、烟叶或梨腐烂病菌丝体总RNA的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)、制备RNA纯化试剂组合物：

1)溶液A：

a.按重量/体积计异硫氰酸胍50％；

b.醋酸钠0.1mol/L；

c.氯化钠0.25mol/L；

d.氯化镁10mmol/L；

e.按重量/体积计十二烷基肌氨酸钠0.7％；

f.糖原60μg/ml

g.按体积/体积计β-巯基乙醇0.5％

2)溶液B：pH4.0-5.0的水饱和酚；

3)裂解液：

a.按体积/体积计，溶液A 50％-55％；

b.按体积/体积计，溶液B 50％-45％；

c.按重量/体积比甲基红0.2‰；

将溶液A和溶液B按体积比1∶1混合后，加入甲基红使溶液呈玫瑰红色，即为所述的裂解液；

(2)样品裂解

根据样品称重，按照每0.1g样品添加1ml裂解液的比例吸取裂解液于离心管中，将样品液氮研磨后迅速添加至含裂解液的离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置5min，然后置于冰上直至所有样品匀浆完成，不立即进行RNA提取的样品可将匀浆置于-20℃保存；

(3)抽提

按每1ml裂解液添加200μl氯仿的比例向匀浆中加入氯仿，剧烈震荡使溶液呈乳浊状，冰上静置5min后于4℃下离心，离心后吸取上层水相于新离心管中并加入等体积氯仿再次抽提，离心，除去水相中残余的酚；

(4)沉降RNA

吸取上层水相于新离心管中，加入等体积异丙醇，冰上至室温25℃放置10min后，离心回收RNA；

(5)洗涤溶解RNA

在室温条件下，用浓度为75％的乙醇使RNA沉淀悬浮，洗涤1-2次后，将其沉淀晾干，溶于焦碳酸二乙酯处理的去离子水中。

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