CN105713902B

CN105713902B - 一种荒漠植物总dna的提取方法

Info

Publication number: CN105713902B
Application number: CN201610231035.5A
Authority: CN
Inventors: 赵昕; 张继伟; 陈国雄; 赵鹏善
Original assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Current assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Priority date: 2016-04-14
Filing date: 2016-04-14
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2036-04-14
Also published as: CN105713902A

Abstract

本发明提供一种荒漠植物总DNA的提取方法，步骤如下：（1）将荒漠植物样品置于容器中，加入PVPP粉，然后加入液氮充分研磨三次以上，得到样品粉末；（2）在样品粉末中迅速加入前处理缓冲液，混匀后低速离心，弃上清，取沉淀物；（3）在沉淀物中加入65℃预热、等体积的提取裂解液，混匀后，65℃温浴1小时，离心；（4）取上清，加入酚/氯仿/异戊醇混匀，抽提，离心；（5）取上清，加入预冷的异丙醇，‑20℃沉淀DNA 30‑60min；（6）之后在低温下高速离心，取沉淀用乙醇清洗；（7）收集沉淀，加入灭菌水溶解。本发明的方法操作简单，耗时短，DNA损失少，产量高，纯度高，完整性好，适用性强。

Description

一种荒漠植物总DNA的提取方法

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及一种荒漠植物总DNA的提取方法。

背景技术

由于荒漠植物体内含有大量的多糖、多酚、单宁酸和其它次级代谢物，因此荒漠植物具有强抗逆性，现代分子生物学技术的运用对揭示荒漠植物强抵抗逆境的机制及其遗传种质资源的保护具有重要的作用，检测不同环境胁迫下基因表达水平的变化为理解植物的抗逆性提供一些必要的基础数据，高质量DNA的提取是进行分子生物学基因表达研究的必要前提。

目前提取DNA的方法有多种，包括异CTAB法、SDS法、沸水浴法、月桂酸提取法。然而，已经发表的大量文章都反映出在分离高质足量的DNA存有不同的困难，主要表现在：植物组织细胞破碎后，释放出大量的多酚、多糖以及其它次级代谢物而干扰DNA的提取；多酚易氧化成多醌而与核酸结合；多糖在低离子浓度缓冲溶液中与DNA结合产生共沉淀。这些都导致DNA产量降低。这样，不同植物组织中多糖、多酚以及其它次级代谢物含量的不同显著地影响着核酸的抽提及纯化过程，因此研究荒漠植物抗逆机制、DNA提取方法是科技工作者必须解决的一个技术难题。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种荒漠植物总DNA的提取方法。

本发明提供一种荒漠植物总DNA的提取方法，步骤如下：

（1）将荒漠植物样品置于容器中，加入PVPP粉，然后加入液氮充分研磨三次以上，得到样品粉末；

（2）在步骤（1）得到的样品粉末中迅速加入前处理缓冲液，混匀后低速离心，弃上清，取沉淀物；所述前处理缓冲液的配方为：200mM Tris-HCl+50mM EDTA+250mM NaCl+0.5-2%β巯基乙醇；

（3）在沉淀物中加入65℃预热、等体积的提取裂解液，混匀后，65℃温浴1小时，离心；所述提取裂解液的配方为：2% CTAB（W/V）+1.4M NaCl+0.02M EDTA+0.1M Tris-HCl+0.2-0.5%β巯基乙醇（V/V）；pH=8.0；

（4）取上清，加入酚/氯仿/异戊醇（体积比为25:24:1）混合液混匀，抽提，离心；

（5）取上清，加入预冷的异丙醇，-20℃沉淀DNA 30-60min；

（6）之后在低温下高速离心，取沉淀用乙醇清洗；

（7）收集沉淀，加入灭菌水溶解。

作为优选，步骤（1）中所述荒漠植物样品的加入量为0.2g-1.0g。该加入量植物样品最少取样量，最适合萃取体积，保证获得最大量DNA提取物。

作为进一步优选，步骤（2）中所述样品粉末与前处理缓冲液的比值为0.2-1.0g：500-1000μl。

作为优选，步骤（1）中所述PVPP粉的加入量为荒漠植物叶片质量的0.5-2%。

作为优选，步骤（2）中所述低速离心为900rpm离心5min。低速离心分离可溶性糖类，保留植物样本内核酸。

作为优选，步骤（4）中所述酚/氯仿/异戊醇混合液的加入量与上清液的体积相同。

作为优选，步骤（5）中所述异丙醇的加入量为上清液体积的1/2。

作为优选，步骤（6）中所述高速离心是在4℃ 12000rpm转速离心5-10min；所述取沉淀用乙醇清洗是用75%乙醇清洗两遍。

本发明的优点和产生的有益效果为：

1、操作简单，耗时少；操作过程大约2-3小时。

2、DNA损失少，产量高；DNA产量大于500ng/μl。

3、纯度高；荒漠植物富含多酚、多糖、蛋白质等次级代谢物，为了使提取的DNA纯度高，操作过程中首先在材料研磨时使用PVPP粉结合多酚进而通过氯仿／异戊醇抽提彻底去除多酚；通过使用高盐的前处理缓冲液去除大部分多糖。

4、完整性好；采用改良的CTAB法提取荒漠植物DNA，不仅试验操作简单，耗时少，产量高，纯度高，而且DNA完整性好。由于改良CTAB法能彻底去除多糖、多酚、蛋白质、RNA及其它污染物，所提的DNA适合分子生物学的下游实验如反转录及基因扩增等，所以改良CTAB法是提取荒漠植物总DNA的最理想方法，为后续开展荒漠植物分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验奠定了基础。

5、适用性强；本发明不仅能从常见荒漠植物中提取出高质量的DNA，同时也适合于其它富含多糖、多酚以及大量次级代谢物的植物DNA的高效提取，如提取水果果实、百合鳞茎中DNA，它具有广泛的应用价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为12种荒漠植物DNA电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

一、试验准备阶段：

1、植物材料

挑选腾格里沙漠南缘沙坡头地区的常见荒漠植物沙米、红砂、珍珠猪毛菜、柠条、沙冬青、油蒿、沙拐枣、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古莸、霸王等植株，取其叶片、茎、根、花穗等组织立即冻存于液氮，贮存在-80℃冰箱备用。

2、试剂

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、四乙酸乙二胺(EDTA)、β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVPP 6755)购自美国Sigma公司，琼脂糖（Agarose）等购自鹏程生物科技公司，其他试剂均为国产分析纯产品。

3、DNA提取准备工作

提取试剂配制所用容器，提取所用研钵、药匙和研杵等用高温灭菌。

制备DNA的离心管、枪头等于120℃高压蒸汽灭菌20分钟后烘干备用。

用于DNA电泳的电泳槽和梳子的处理：用去污剂清洗后，用水冲洗并用乙醇干燥，然后装满3％的H₂0₂溶液，室温下处理10min。

操作过程中，带手套口罩，无菌超净工作台上提取，研磨迅速，避免DNA受到污染。

4、提取相关溶液配置

PVPP粉末：购自Sigma公司；高压灭菌锅120℃20分钟灭菌后，密封低温保存；

前处理缓冲液：

200mM Tris-HCl+50mM EDTA+250mM NaCl+0.5-2%β巯基乙醇（V/V）；

提取裂解液：

2% CTAB（W/V）+1.4M NaCl+0.02M EDTA+0.1M Tris-HCl+0.2-0.5%β巯基乙醇（V/V）；pH=8.0；

CI纯化液：酚：氯仿：异戊醇=25:24:1，（V/V，分析化学级市售有机溶剂）；

异丙醇：100%纯度，分析化学级市售有机溶剂；

70%乙醇（V/V），分析化学级别有机溶剂；

所有溶液都用高压灭菌处理的超纯水配置，有机溶剂为国产分析级产品。

本发明的荒漠植物叶片DNA提取方法如下：

1、材料研磨

取荒漠植物样品（根、茎、叶、花、果实都可以）大约0.2-1.0g置于研钵中，在研钵中直接撒PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)粉，加入量为荒漠植物叶片质量的0.5-2%，加入液氮充分研磨，至少研磨三次以上，将样品粉末装入2ml微量灭菌离心管。

叶片在研磨过程中会释放出大量的多酚，多酚氧化形成醌类物质而与DNA结合，采用了在研磨过程中直接撒PVPP粉在研钵里与冷冻材料一起研磨的方法。PVPP粉作为多酚化合物的螯合剂，具有很强的结合酚能力。在此实验中特别提高了PVPP粉和前处理缓冲液中的β-巯基乙醇的含量，使其浓度都达到了0.5-2%，β-巯基乙醇提供还原条件，二者协同作用，使得多酚类物质不易被氧化，而与PVPP充分结合形成螯合物。再通过后续的步骤抽提除去，有效抑制了酚类物质对DNA提取的影响。

试验中使用PVPP而不用PVP，这是因为PVP是聚乙烯吡咯烷酮，水溶性好，可溶于各种有机溶剂，而PVPP是交联聚乙烯吡咯烷酮，是聚乙烯吡咯烷酮的交联聚合物，几乎不溶于任何溶剂。不溶性PVPP替代可溶性的PVP，可溶性PVP与酚的抽提不兼容而干扰DNA沉淀；不溶性PVPP既能结合多酚，又能结合多糖，从而阻止核酸与多糖多酚结合而导致DNA产量减少，可溶性PVP粉只结合多酚而不结合多糖，从而不能去除多糖污染物；PVP粉的使用量受到限制，缓冲液PVP粉不能超过的1%，否则DNA的产量会显著地减少，而PVPP不受限制。

2、加入前处理缓冲溶液，溶解多糖类物质

在第一步研磨的样品粉末中迅速加入前处理缓冲液500-1000μl，涡旋仪上高速混匀，离心机上低速900rpm离心5min，弃上清，取沉淀物。

3、抽提DNA，清除多糖类产物

在沉淀物中加入65℃预热、500-1000μl的提取裂解液中，涡旋仪上充分混匀，恒温水浴锅65℃温浴1小时，充分震荡混匀后高速离心机12000rpm离心10min。

CTAB提取液中包含有较高浓度的CTAB(2%)，NaCl(1.4M)，β-巯基乙醇(0.2-0.5%)以及25mM EDTA和100mM Tris-HCl(pH值8.0)。CTAB是一种阳离子去污剂，能溶解细胞膜，对植物细胞具有较好的裂解作用，而且同β-巯基乙醇共同对蛋白质的强烈变性作用，使核酸从蛋白-核酸复合物中彻底被释放出来。在高离子浓度的NaCl溶液中(NaCl>0.7M)，释放出来的核酸与较高浓度的CTAB(2%(w／v))形成可溶性的复合物，而变性蛋白质与CTAB形成不溶性的复合物，随着氯仿的抽提蛋白质被去除。同时，β-巯基乙醇不但可以作为强还原剂防止多酚氧化，提供pH值为8.0缓冲环境，还能有效降低多酚物质在酸性条件下被氧化的几率。

4、取上清加入新的2ml微量离心管，加等体积（800μl）CI纯化液混匀，抽提一次，室温下，高速离心机上12000rpm离心 5min。

5、取上清加入新的2ml微量离心管，加入1/2体积预冷的异丙醇放入冰箱冷冻室，-20℃沉淀DNA 30-60min。

6、取出2ml微量离心管，在4℃ 12000rpm转速离心5-10min，弃去液体部分，取沉淀用75%乙醇清洗两遍。

荒漠植物叶片中富含多糖，其成分以及理化性质和核酸很接近，不容易分离，尽管大量的多糖在DNA的抽提过程中被高盐的前处理缓冲液已经去除,但还是有极少量的多糖在低温沉淀过程中渗入到DNA水相中与DNA一起沉淀，而使抽提到的DNA中还含有极少量多糖的污染，所以后期再用低温预冷的异丙醇沉淀，这样可有效彻底去除残留多糖的干扰。并用75%的乙醇洗涤两次，这样可有效去除离子的干扰。这样，经过对多酚、多糖、蛋白质及离子物质的有效去除，获得纯净的DNA样品。

7、放入通风厨吹干至乙醇充分挥发，加入40-100μl灭菌水溶解，贴标签放入冰箱冷冻室冻存盒保存。

实施例1

一、荒漠植物叶片DNA提取方法具体如下：

1、材料研磨

取0.1-0.5g荒漠植物叶片（12种，为沙米、红砂、珍珠猪毛菜、柠条、沙冬青、油蒿、沙拐枣、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古莸、霸王）置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，加入量为荒漠植物叶片质量的1%，加入液氮与叶片一起快速研磨三次；

2、加入前处理缓冲溶液，溶解多糖类物质

将第一步研磨的粉末样品迅速加入前处理缓冲液500-1000μl，充分混匀后900rpm

离心5min，弃上清，取沉淀物。

3、抽提DNA，清除蛋白质与多糖类产物

将上一步的沉淀物加入65℃预热、500-1000μl的提取裂解液中，总溶液涡旋2min，65℃温浴1小时，之后室温12000rpm离心10min；加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1）的纯化溶剂，抽提1次，室温下，12000rpm，离心5min。

4、沉淀DNA，获取纯净高产DNA

向上清中加1/2体积预冷的异丙醇，混匀，冰浴-20℃冰箱放置30min。在4℃12000rpm离心10min，倒掉上清液，用浓度为75％乙醇溶剂漂洗二次，4℃12000rpm离心5-10min，收集沉淀，晾干，得纯净的DNA产品，溶于20-50μl无菌水中。

二、总DNA质量和产量检测阶段：

1、完整性检测

每个样品中取3μl总DNA溶液通过凝胶电泳检测其完整性，其它DNA样品保存在-20℃冰箱中。将1μl 5倍上样缓冲液和3μl总DNA溶液室温混合，然后上样到1%琼脂糖凝胶(已加2μl溴化乙锭EB)样孔中，在北京六一小型电泳槽中100V电泳中跑胶30min后，用全自动数码凝胶成像系统上海培清380C仪器拍照记录。结果参见图1，从左到右依次为柠条、沙米、红砂、珍珠猪毛菜、霸王、油蒿、沙木蓼、沙冬青、蒙古莸、沙拐枣、文冠果、花棒所提取的DNA电泳结果。由图1可以看出，12种荒漠植物提取的DNA完整性好。

2、总DNA纯度和产量检测

取1μl提取获得的DNA溶液，用Nanodrop2000C型微量紫外分光光度计测定OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₃₀处的吸光值(以无菌水为空白液调零)，计算DNA产量及纯度。总DNA产量计算根据公式：DNA产量为50×OD₂₆₀×样品的体积(μ1)／材料重(mg)。DNA、蛋白质和多糖、多酚分别在OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₃₀有最大的吸光值，常用A260／230、A260／280的比值来表示DNA的纯度，A260／230、A260／280大于1.8表示DNA有较高的纯度，A260／230小于1.8说明DNA有多糖、多酚污染，A260／280小于1.8说明DNA有蛋白质污染。结果参见表1。

表1 12种荒漠植物叶片DNA质量Nanodrop测定结果

实施例2

一、荒漠植物根DNA提取方法具体如下：

1、材料研磨

取0.2g荒漠植物的根部（12种，为沙米、红砂、珍珠猪毛菜、柠条、沙冬青、油蒿、沙拐枣、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古莸、霸王）置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，加入量为荒漠植物叶片质量的0.5%，加入液氮与叶片一起快速研磨三次；

2、加入前处理缓冲溶液，溶解多糖类物质

将第一步研磨的粉末样品迅速加入前处理缓冲液500μl，前处理液中β巯基乙醇的含量为0.5%，充分混匀后900rpm离心5min，弃上清，取沉淀物。

3、抽提DNA，清除蛋白质与多糖类产物

将上一步的沉淀物加入65℃预热、500μl的提取裂解液中，提取裂解液中β巯基乙醇的含量为0.2%，总溶液涡旋2min，65℃温浴1小时，之后室温12000rpm离心10min；加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1）的纯化溶剂，抽提1次，室温下，12000rpm，离心5min。

4、沉淀DNA，获取纯净高产DNA

向上清中加1/2体积预冷的异丙醇，混匀，冰浴-20℃冰箱放置30min。在4℃12000rpm离心10min，倒掉上清液，用浓度为75％乙醇溶剂漂洗二次，放入通风厨吹干至乙醇充分挥发，得纯净的DNA产品，溶于40μl无菌水中。

实施例3

一、荒漠植物茎部DNA提取方法具体如下：

1、材料研磨

取1.0g荒漠植物的茎（12种，为沙米、红砂、珍珠猪毛菜、柠条、沙冬青、油蒿、沙拐枣、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古莸、霸王）置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，加入量为荒漠植物叶片质量的2%，加入液氮与叶片一起快速研磨三次；

2、加入前处理缓冲溶液，溶解多糖类物质

将第一步研磨的粉末样品迅速加入前处理缓冲液1000μl，前处理液中β巯基乙醇的含量为2%，充分混匀后900rpm离心5min，弃上清，取沉淀物。

3、抽提DNA，清除蛋白质与多糖类产物

将上一步的沉淀物加入65℃预热、1000μl的提取裂解液中，提取裂解液中β巯基乙醇的含量为0.5%，总溶液涡旋2min，65℃温浴1小时，之后室温12000rpm离心10min；加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1）的纯化溶剂，抽提1次，室温下，12000rpm，离心5min。

4、沉淀DNA，获取纯净高产DNA

向上清中加1/2体积预冷的异丙醇，混匀，冰浴-20℃冰箱放置30min。在4℃12000rpm离心10min，倒掉上清液，用浓度为75％乙醇溶剂漂洗二次，放入通风厨吹干至乙醇充分挥发，得纯净的DNA产品，溶于100μl无菌水中。

实施例4

一、荒漠植物花DNA提取方法具体如下：

1、材料研磨

取0.8g荒漠植物的花（12种，为沙米、红砂、珍珠猪毛菜、柠条、沙冬青、油蒿、沙拐枣、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古莸、霸王）置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，加入量为荒漠植物叶片质量的1.5%，加入液氮与叶片一起快速研磨三次；

2、加入前处理缓冲溶液，溶解多糖类物质

将第一步研磨的粉末样品迅速加入前处理缓冲液800μl，前处理液中β巯基乙醇的含量为1.5%，充分混匀后900rpm离心5min，弃上清，取沉淀物。

3、抽提DNA，清除蛋白质与多糖类产物

将上一步的沉淀物加入65℃预热、800μl的提取裂解液中，提取裂解液中β巯基乙醇的含量为0.4%，总溶液涡旋2min，65℃温浴1小时，之后室温12000rpm离心10min；加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1）的纯化溶剂，抽提1次，室温下，12000rpm，离心5min。

4、沉淀DNA，获取纯净高产DNA

向上清中加1/2体积预冷的异丙醇，混匀，冰浴-20℃冰箱放置30min。在4℃12000rpm离心10min，倒掉上清液，用浓度为75％乙醇溶剂漂洗二次，放入通风厨吹干至乙醇充分挥发，得纯净的DNA产品，溶于80μl无菌水中。

实施例5

一、荒漠植物果实DNA提取方法具体如下：

1、材料研磨

取0.6g荒漠植物的果实（12种，为沙米、红砂、珍珠猪毛菜、柠条、沙冬青、油蒿、沙拐枣、沙木蓼、文冠果、花棒、蒙古莸、霸王）置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，加入量为荒漠植物叶片质量的1.4%，加入液氮与叶片一起快速研磨三次；

2、加入前处理缓冲溶液，溶解多糖类物质

将第一步研磨的粉末样品迅速加入前处理缓冲液600μl，前处理液中β巯基乙醇的含量为1.4%，充分混匀后900rpm离心5min，弃上清，取沉淀物。

3、抽提DNA，清除蛋白质与多糖类产物

将上一步的沉淀物加入65℃预热、600μl的提取裂解液中，提取裂解液中β巯基乙醇的含量为0.3%，总溶液涡旋2min，65℃温浴1小时，之后室温12000rpm离心10min；加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（苯酚：氯仿：异戊醇的体积比为25：24：1）的纯化溶剂，抽提1次，室温下，12000rpm，离心5min。

4、沉淀DNA，获取纯净高产DNA

向上清中加1/2体积预冷的异丙醇，混匀，冰浴-20℃冰箱放置30min。在4℃12000rpm离心10min，倒掉上清液，用浓度为75％乙醇溶剂漂洗二次，放入通风厨吹干至乙醇充分挥发，得纯净的DNA产品，溶于60μl无菌水中。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种荒漠植物总DNA的提取方法，其特征在于：步骤如下：

（1）将荒漠植物样品置于容器中，加入PVPP粉，然后加入液氮充分研磨三次以上，得到样品粉末；所述PVPP粉的加入量为荒漠植物叶片质量的0.5-2%；

（2）在步骤（1）得到的样品粉末中迅速加入前处理缓冲液，混匀后低速离心，弃上清，取沉淀物；所述前处理缓冲液的配方为：200mM Tris-HCl+50mM EDTA+250mM NaCl+0.5-2%β巯基乙醇；所述样品粉末与前处理缓冲液的比值为0.2-1.0g：500-1000μl；

（3）在沉淀物中加入65℃预热、等体积的提取裂解液，混匀后，65℃温浴1小时，离心；所述提取裂解液的配方为：2% CTAB+1.4M NaCl+0.02M EDTA+0.1M Tris-HCl+0.2-0.5%β巯基乙醇；pH=8.0；

（4）取上清，加入体积比为25:24:1的酚/氯仿/异戊醇混合液混匀，抽提，离心；

（5）取上清，加入预冷的异丙醇，-20℃沉淀DNA 30-60min；

（6）之后在低温下高速离心，取沉淀用乙醇清洗；

（7）收集沉淀，加入灭菌水溶解。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述荒漠植物样品的加入量为0.2g-1.0g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述低速离心为900rpm离心5min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中所述酚/氯仿/异戊醇混合液的加入量与上清液的体积相同。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述异丙醇的加入量为上清液体积的1/2。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中所述高速离心是在4℃12000rpm转速离心5-10min；所述取沉淀用乙醇清洗是用75%乙醇清洗两遍。